淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达
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抗生素发酵生产工艺1.青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义?青霉素是发现最早,最卓越的一种B-内酰胺类抗生素,它是抗生素工业的首要产品,青霉素是各种半合成抗生素的原料。
青霉素的缺点是对酸不稳定,不能口服,排泄快,对革兰氏阴性菌无效。
青霉素经过扩环后,形成头孢菌素母核,成为半合成头孢菌素的原料。
2.如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制?青霉素在深层培养条件下,经历7个不同的时期,每个时期有其菌体形态特性,在规定时间取样,通过显镜检查这些形态变化,用于工程控制。
第一期:分生孢子萌发,形成芽管,原生质未分化,具有小泡。
第二期:菌丝繁殖,原生质体具有嗜碱性,类脂肪小颗粒。
第三期:形成脂肪包含体,积累储蓄物,没有空洞,嗜碱性很强。
第四期:脂肪包含体形成小滴并减少,中小空泡,原生质体嗜碱性减弱,开始产生抗生素。
第五期:形成大空泡,有中性染色大颗粒,菌丝呈桶状。
脂肪包含体消失,青霉素产量提高。
第六期:出现个别自溶细胞,细胞内无颗粒,仍然桶状,释放游离氨,pH上升。
第七期:菌丝完全自溶,仅有空细胞壁。
一到四期为菌丝生长期,三期的菌体适宜为种子。
四到五期为生产期,生产能力最强,通过工艺措施,延长此期,获得高产。
在第六期到来之前发束发酵。
3. 青霉素发酵工程的控制原理及其关键点是什么?控制原理:发酵过程需连续流加葡萄糖,硫酸铵以及前提物质苯乙酸盐,补糖率是最关键的控制指标,不同时期分段控制。
在青霉素的生产中,及时调节各个因素减少对产量的影响,如培养基,补充碳源,氮源,无机盐流加控制,添加前体等;控制适宜的温度和ph,菌体浓度。
最后要注意消沫,影响呼吸代谢。
4.青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作?青霉素不稳定,发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速,防止降解。
提炼工艺包括如下单元操作:①预处理与过滤:在于浓缩青霉素,除去大部分杂质,改变发酵液的流变学特征,便于后续的分离纯化过程。
②萃取:其原理是青霉素游离酸易溶于有机溶剂,而青霉素易溶于水。
【赢在高考•黄金8卷】备战2024年高考生物模拟卷(北京专用)生物黄金卷01(满分100 分,考试时间90 分钟。
)注意事项∶1.答卷前,考生务必将自己的姓名、考生号等填写在答题卡和试卷指定位置。
2.回答选择题时,选出每小题答案后,用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。
如需改动,用橡皮擦干净后,再选涂其他答案标号。
回答非选择题时,将答案写在答题卡上。
写在本试卷上无效。
3.考试结束后,将本试卷和答题卡一并交回。
一、单选题(本部分共15道小题,每小题2分,共计30分)1.用限制酶Spe Ⅰ和Hind Ⅲ切割质粒,用限制酶Hind Ⅲ和Xba Ⅰ切割目的基因,之后连接,构建基因表达载体。
下列叙述不正确...的是()A.青霉素抗性基因可作为筛选标记B.限制酶可使磷酸二酯键发生断裂C.表中限制酶切割之后均会产生黏性末端D.连接后的基因表达载体可被Spe I切开2.科学家从转基因羊的羊奶中提取到治疗血栓性疾病的特效药组织纤溶酶原激活剂(tPA)。
获得转基因羊的过程中,以下操作非必要的是()A.将tPA基因与羊乳腺特异表达启动子重组B.将表达载体显微注射到羊受精卵中C.将羊受精卵的核注入去核的卵母细胞中D.将体外培养的胚胎移植到羊的子宫内3.下列关于PCR技术的叙述,正确的是()A.PCR反应体系中需要添加耐高温的解旋酶和DNA聚合酶B.PCR过程中在引物的3'端添加脱氧核苷酸实现子链延伸C.利用PCR对目的基因进行扩增时需要基因序列全部已知D.在设计两种引物时,需要让引物和引物之间的碱基序列互补A.A B.B C.C D.D5.柑橘类水果深受人们喜爱,但大多种类多籽。
利用“默科特”橘橙二倍体叶肉原生质体和“早金”甜橙单倍体愈伤组织培育三倍体柑橘,相关叙述正确的是()A.用盐酸解离获得“默科特”橘橙二倍体叶肉原生质体B.用花药离体培养获得“早金”甜橙单倍体愈伤组织C.用电融合法或秋水仙素均可诱导两种原生质体融合D.三倍体柑橘可通过有性繁殖扩大种植面积6.生态环境质量持续改善是我们的发展目标,下列行为与此目标不符的是()A.减少私家车使用,出行多乘坐公共交通工具B.多采用生物防治的方法治理农林害虫C.家庭做好垃圾分类,投放专用垃圾桶,促进废弃物循环利用D.从国外带回适应性强的生物提高我国生态系统的生物多样性7.葡萄糖是主要的能源物质,关于葡萄糖的叙述错误的是()A.组成元素含有C、H、O、NB.有氧、无氧环境下均可分解C.可形成糖蛋白参与细胞间的识别D.可聚合形成纤维素构成植物细胞壁8.图为酵母菌细胞模式图,关于利用酵母菌生产α淀粉酶,相关说法错误的是()A.α淀粉酶在结构2上合成B.α淀粉酶的产生与结构1的加工、分类和包装有关CO,用于此过程能量消耗C.结构3可分解葡萄糖为酒精和2D.酵母菌细胞具有细胞器膜、细胞膜和核膜构成的生物膜系统9.酵母菌的品质影响葡萄酒的产量和质量,研究人员为分离出产酒精能力强的酵母菌菌株,进行了如图I 所示实验,甲、乙、丙、丁锥形瓶内分别加入100mL完全培养基,下列说法正确的是()A.传统葡萄酒发酵过程中,为避免污染发酵装置需严格灭菌B.用稀释涂布平板法计算出葡萄酒过滤液的活菌数为6.8×106个/L,此数值可能高于实际的活菌数C.对培养基进行灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法,菌种接种过程中的试管口、瓶口等无需再灼烧灭菌D.由图Ⅱ可知,丙可能是培养瓶密封不严导致,丁组酵母菌产酒精能力比乙强A.A B.B C.C D.D11.草甘膦是无选择性除草剂的有效成分,施用时也会“误伤”作物致死,其机理是抑制与植物多种代谢途径有关的EPSP合酶的活性。
中国农业科技导报,2011,13(2):53-58Journal of Agricultural Science and Technology收稿日期:2010-11-29;接受日期:2011-01-26基金项目:国际科技合作项目(2008DFA32080)资助。
作者简介:董世雷,硕士研究生,主要从事微生物与分子生物学的研究。
E-mail :dsl166@126.com 。
通讯作者:王欣,研究员,博士,主要从事微生物生态与免疫方面的研究。
Tel :0571-86415126;E-mail :xxww101@sina.com 大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT 的克隆及表达董世雷1,2,刘伟2,朱立颖2,王学琴3,于宏伟4,王欣2(1.浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;2.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所,杭州310021;3.内蒙古工业大学化工学院,呼和浩特010051;4.马歇尔大学微生物学与免疫学院,亨廷顿25755,美国)摘要:OmpT (Outer-membrane proteases T )是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。
利用大肠杆菌OmpT 降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗OmpT 蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。
根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT 的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR )方法,从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954bp 的序列,测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99.99%。
将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a 上构建重组表达质粒pET28a-OmpT 。
经IPTG 诱导后,在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36kDa 且具有生物活性的OmpT 蛋白。
生长曲线试验显示,抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT 的大肠杆菌生长没有影响,而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。
扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达与重组酶性质郭玉婉;沈微;王一恬;樊游;陈献忠;王正祥【摘要】通过PCR方法从扣囊复膜孢酵母基因组DNA中克隆获得α-淀粉酶基因成熟肽编码区(SfA),插入乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC1的α因子信号肽下游,构建重组表达载体pKLAC1-SfA.重组载体转化乳酸克鲁维酵母GG799,筛选获得表达α-淀粉酶SfA水平较高的重组菌.酶活检测和SDS-PAGE电泳检测均显示,重组菌分泌重组酶SfA到发酵液中.酶学性质研究表明:SfA最适温度为45℃,最适pH 5.0,在pH4.5 ~5.5、50℃条件下保持稳定.Ca2+等二价金属离子对SfA酶活有激活作用,EDTA强烈的抑制SfA活性.HPLC分析显示SfA水解糊精获得麦芽寡糖和少量葡萄糖,其中麦芽三糖是主要产物,占水解产物总量的52%.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2014(044)002【总页数】6页(P25-30)【关键词】扣囊复膜孢酵母;α-淀粉酶;乳酸克鲁维酵母;麦芽三糖【作者】郭玉婉;沈微;王一恬;樊游;陈献忠;王正祥【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院,天津300457【正文语种】中文α-淀粉酶能水解淀粉分子链中的α-1,4-葡萄糖苷键,是目前最重要的一类工业酶制剂,占据着整个酶制剂市场份额的25%左右[1-2]。
不同生物体来源的α-淀粉酶在水解产物和酶学性质等方面有着很大的差异,例如地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌来源的α-淀粉酶水解淀粉主要获得短链糊精和麦芽寡糖而丝状真菌来源的真菌α-淀粉酶水解淀粉则主要获得麦芽糖。
大肠杆菌基因工程引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌,它可以在动植物肠道中找到。
由于其生长快速、易于培养和转化,大肠杆菌成为了基因工程研究中最重要的模式生物之一。
大肠杆菌基因工程是通过改变大肠杆菌的遗传特征,实现对其功能的改造和优化,从而达到生产特定产物或解决特定问题的目的。
大肠杆菌基因工程的原理基因传递与插入大肠杆菌基因工程的核心在于将目标基因导入到大肠杆菌中。
目前常用的方法有以下几种:1.转化(transformation):通过将外源DNA直接导入大肠杆菌细胞内,使其在细胞内复制和表达。
2.电转化(electroporation):利用强电场将质粒DNA引入细胞内,使其与大肠杆菌细胞内的DNA重组。
3.病毒介导的转染(viral-mediated transduction):使用病毒载体将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
4.转座子介导的DNA转移(transposon-mediated DNAtransfer):利用转座子将目标基因插入到大肠杆菌染色体的特定位点上。
基因表达与调控在大肠杆菌基因工程中,外源基因导入之后需要进行表达和调控,以产生所需的受体蛋白或产物。
常用的表达系统包括启动子-启动子区域-编码序列-终止子的结构。
其中,启动子可以选择适当的促进剂或抑制剂进行调节,以控制基因的表达水平和时机。
应用案例生物医药领域在生物医药领域,大肠杆菌基因工程被广泛应用于生产重组蛋白药物。
通过引入外源基因,大肠杆菌可以高效地合成重组蛋白,并通过分离和纯化得到高纯度的药物。
例如,利用大肠杆菌表达系统,可以生产出重组人胰岛素、生长激素等重要药物。
环境治理领域大肠杆菌基因工程还可以应用于环境治理领域。
例如,通过改造大肠杆菌的基因组,使其具有降解有机污染物的能力,可以用于处理工业废水和土壤污染。
此外,大肠杆菌的工程还可以用于制造生物能源,例如利用大肠杆菌产生生物柴油或生物氢。
淀粉酶amy1基因淀粉酶amy1基因:简介与功能淀粉酶amy1基因是人类基因组中的一种酶编码基因,其主要功能是帮助人体消化淀粉质。
该基因位于人类染色体6号上,包含13个外显子和12个内含子,编码出的蛋白质为淀粉酶。
淀粉酶是一种水解酶,能够将淀粉分解为葡萄糖单元,以供身体能量消耗。
淀粉酶amy1基因:影响因素与变异人类身体中的淀粉酶含量和分泌量受到多种影响因素的调节。
其中最重要的一个影响因素就是个体差异。
不同人群中的淀粉酶水平存在显著差异,这些差异可能与遗传、环境和生活方式等多种因素有关。
此外,淀粉酶amy1基因存在着多种变异形式。
在不同人群中,该基因表达水平、编码蛋白质结构和功能等方面均存在差异。
这些变异形式可能与不同地理环境、食物习惯和生活方式等相关。
淀粉酶amy1基因:研究进展与应用前景近年来,淀粉酶amy1基因的研究成果不断涌现,相关领域的科学家们已经取得了一系列重要的突破。
在人类进化史中,淀粉酶amy1基因的变异与人类食物习惯和生活方式等密切相关。
通过对该基因的研究,科学家们可以更好地理解人类进化历程和适应环境的机制。
此外,淀粉酶amy1基因在医学领域也具有重要的应用前景。
例如,在肥胖、代谢综合征等代谢性疾病的预防和治疗中,淀粉酶水平可能成为一个重要的评估指标。
此外,在口腔保健、食品加工等领域中,淀粉酶也有着广泛的应用场景。
总结综上所述,淀粉酶amy1基因是人类基因组中一种重要的消化酶编码基因。
该基因存在着多种影响因素和变异形式,并具有广泛的应用前景。
未来随着科学技术水平不断提高,淀粉酶amy1基因的研究成果将会为人类健康和生活带来更多的福祉。
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究一、概述基因工程是一种革命性的生物技术,它允许科学家在分子水平上对生物体进行精确的操控和改造。
自从20世纪70年代基因工程技术诞生以来,它已广泛应用于医药、农业、工业等领域,为解决人类面临的诸多挑战提供了新的途径。
利用基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素是基因工程在医药领域的一个重要应用。
重组人胰岛素是一种通过基因工程技术生产的人胰岛素类似物,具有与天然人胰岛素相似的生物活性。
它主要用于治疗糖尿病等代谢性疾病,具有广阔的市场前景和重要的社会价值。
与传统的动物源胰岛素相比,重组人胰岛素具有纯度高、稳定性好、免疫原性低等优点,因此备受关注。
在大肠杆菌中发酵生产重组人胰岛素的过程涉及多个关键步骤,包括基因克隆、表达载体的构建、宿主细胞的选择、发酵条件的优化等。
通过这些步骤,可以实现重组人胰岛素的高效表达和分泌,从而生产出符合治疗要求的胰岛素产品。
本文旨在探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展、技术原理、工艺优化以及未来的发展趋势。
通过深入了解这一领域的研究现状,可以为重组人胰岛素的生产提供理论支持和实践指导,进一步推动基因工程技术在医药领域的应用和发展。
1. 重组人胰岛素的重要性和应用背景重组人胰岛素,作为一种生物技术产品,在医学领域具有极其重要的地位。
它是通过基因工程技术,将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌等微生物体内,使其能够生产与人体胰岛素功能相似的胰岛素。
这种胰岛素在治疗糖尿病方面发挥着至关重要的作用。
糖尿病是一种全球性的健康问题,影响着数以亿计的人口。
根据国际糖尿病联盟(IDF)的数据,全球约有62亿成年人患有糖尿病,预计到2045年这一数字将增至7亿。
糖尿病的治疗需要长期使用胰岛素,而重组人胰岛素因其与人体胰岛素的高度相似性,成为糖尿病治疗的首选药物。
重组人胰岛素的应用背景源于对胰岛素需求的不断增长。
在重组人胰岛素出现之前,糖尿病患者主要依赖从猪或牛体内提取的胰岛素进行治疗。
淀粉酶的生产及应用淀粉酶是一种重要的工业酶制剂,具有广泛的应用前景。
以下将就淀粉酶的生产和应用进行详细阐述。
一、淀粉酶的生产淀粉酶是通过发酵工艺生产的,主要来源于微生物、动物和植物。
1. 微生物源生产微生物源生产淀粉酶是目前主要的生产方式,常用的微生物有真菌和细菌。
常见的真菌有Aspergillus、Penicillium、Trichoderma等,常见的细菌有Bacillus、Streptomyces等。
微生物源生产淀粉酶的步骤一般为:选材→筛选高效菌株→发酵→提取淀粉酶→纯化淀粉酶。
2. 动物源生产动物源淀粉酶主要来自猪胰腺。
提取过程一般为:猪胰腺养殖→收集猪胰腺→粉碎破碎→提取淀粉酶→纯化淀粉酶。
3. 植物源生产植物源淀粉酶主要来自马铃薯、玉米等植物中。
提取过程一般为:马铃薯破碎→破菌、杀菌、酶解→提取淀粉酶→纯化淀粉酶。
二、淀粉酶的应用1. 食品工业中的应用淀粉酶在食品工业中有着广泛的应用,主要用于食品加工中的葡萄糖浆、糖化醇、果胶等的制备和糖化工艺的调控。
例如,淀粉酶可将淀粉酶解为较小的糖分子,提高食品中糖的含量,改善口感和稳定性。
此外,淀粉酶还可用于面包、饼干等面粉制品的改良,并提高其贮存性和食用品质。
2. 纺织工业中的应用淀粉酶在纺织工业中主要用于织物的整理处理,如退浆、硫酸盐还原等。
其作用是分解纺织原料中的淀粉,提高降解淀粉成分的活性和效果,从而达到改善织物的柔软度、光泽度和手感等目的。
3. 制浆造纸工业中的应用淀粉酶在造纸工业中广泛应用于原料中的淀粉和非淀粉物质的降解处理。
通过添加适量的淀粉酶,可以有效降低造纸原料中淀粉的含量,提高浆料的筛选效率和纸张的强度、光泽度等性能。
4. 医药工业中的应用淀粉酶在医药工业中主要用于药物的合成和改良。
例如,淀粉酶可以用于制备药物辅料,改变其物化性质,提高药物的稳定性和可溶性。
此外,淀粉酶还可用于药物的表面活性剂、缓释剂等的改良,提高药效和降低毒副作用。
淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达 一、相关背景
淀粉酶是较早发现的酶类之一,早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶,即高峰淀粉酶。1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。 淀粉酶(amylase,AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1,4-葡聚糖,水解α-1,4-糖苷键的酶类的总称。现在淀粉酶大致可分为四大类:第一类α-淀粉酶,广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物。第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键,切下的是麦芽糖单位。第三类葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3),习惯上简称糖化酶,从底物的非还原性末端顺次水解α-1,4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键,切下整个侧枝。还有淀粉α-1,6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称,通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料,由于淀粉酶退浆机械作用小,水的用量少,可以在低温条件下达到退浆效果,具有鲜明的环保特色。 除此之外,不同性质的α-淀粉酶还具有许多不同的用途。耐热性α-淀粉酶,由于使用时温度提高,液化完全,用酶量少,操作比较容易,β-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。在制醋工业中,常用β-淀粉酶代替部分麸曲节省成本,在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。在医药工业上,β-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖,医学上常用该酶和α-淀粉酶一道作为消化剂使用。 二、目前研究情况 1 .国内外研究机构 由于 α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶,国内外很多课题组对它进行了研究。国内主要研究 α-淀粉酶的生产菌株及其培养条件; α-淀粉酶的结构以及应用性能,如耐热性、耐酸性;淀粉酶的变性机理以及环境对 α-淀粉酶的影响;淀粉酶的固定化和动力性质;对多种 α-淀粉酶生产菌的一淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。 国外有代表性的研究单位有:加拿大的University of British Columbia,他们对人胰腺的 α-淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究;丹麦的Carlsberg实验室主要研究大麦 α-淀粉酶结构域与结合位点;美国的Westenr Regional Research Center主要研究大麦 的 α-淀粉酶与抗菌素的作用以及大麦一淀粉酶的活性位点。 2.国内外α-淀粉酶研究方向 第一 利用传统育种技术对生产菌进行改良;第二对不同来源的α-淀粉酶的基因进行克隆.表达及酶学性质研究;第三α-淀粉酶结构与功能关系的研究。 三、实验研究的目标 构建出α-淀粉酶基因,并使其在大肠杆菌(amp+)中进行表达。 希望可以通过实验对α-淀粉酶基因的一些功能进行研究。
四、简略研究步骤
DNA提取——>(电泳鉴定)——> PCR扩增(引物设计) ——>(电泳鉴定)——>电泳 ——>目标带回收——>(电泳鉴定)——>连接载体(质粒)——>转化大肠杆菌——>菌体PCR检测 五、相关实验详细介绍 Ⅰ DNA提取 Ⅱ SDS法提取DNA (一)试剂及器材: 1.母液: (1)1M Tris-HCl:称Tris-Base 12.1g,双蒸水溶解,定容至100ml,用浓HCl调pH8.0(pH8.0)。 (2)0.25M EDTA:称Na2EDTA〃2H2O9.3g,双蒸水溶解,定容至100ml,用NaOH调pH8.0(pH8.0)。 (3)2M NaCl:称NaCl 11.6g,双蒸水溶解,定容至100ml。 2.SDS bulfer: 取母液中1M Tris-HCl 10ml,0.25M EDTA 20ml,2M NaCl 25ml,定容至100ml,加SDS2g混合。 3.5M醋酸钾:称醋酸钾49g,双蒸水溶解,定容至100ml,乙酸调pH4.8。 4.TE:(10m M Tris-HCl,0.1m MEDTA)1M Tris-HCl 1ml,40μlEDTA 99ml双蒸水。 5.3M 醋酸钠(pH5.2):称醋酸钠3H2O 40.8g双蒸水溶解定容,固体NaOH调pH至5.2。 6.Tris-饱和酚。 7.其它:离心机、研钵,7ml离心管,1.5ml离心管,大小枪头,异丙醇,75%乙醇等。
(二)步骤: 1.取湿菌体约400mg(5ml发醇液),8000rpm,离心5min,弃上清 将湿菌体放入研钵中,加液N2(-180℃) 约20ml研磨3~5次,2管1.5ml离心管取粉末约0.5ml,各加700μl预热的SDSbuffer,65℃保温1h,7000rpm 离心6min取上清。 2.加上清2/3体积(约500μl)的5M KAC溶液,4℃,放臵30min,12000rpm,离心10min,取上清 3.加入等体积的异丙醇,-20℃,2小时以上,或过夜,4℃,8000rpm,离心5min,收集DNA沉淀,75%乙醇洗涤2次,离心管口向下晾干,50μl双蒸水(即ddH2O)溶解。 4.Tris-饱和酚,抽提3次。 5.加1/10体积的3M NaAc (pH5.2) ,4℃,放臵10min,10000rpm,离心10min,取上清。 6.2倍酒精沉淀。 7.75%酒精洗2次,凉干,50μl双蒸水溶解。 一般情况下,做前3步即可。
2电泳 (一)试剂及器材: 1.50×TAE Buffer pH8.5 1L(2M Tris-醋酸,100m MEDTA) 称Tris-Base 242g,Na2 EDTA〃2H2O 37.2g加800ml双蒸水,充分混匀搅拌,加57.1ml醋酸,加双蒸水定容到1L,室温保存。 2.1×TAE(取20ml 50×TAE+双蒸水定容至1L) 3.电泳仪、大小枪头、离心管,溴化乙淀,mark(d2000)等。 (二)步骤: 1.取20ml(1×TAE)液体,称0.20g琼脂糖,混合,加热溶化,,倒入插有梳子的电泳槽中,冷却、凝固, 2.取出梳子,向槽中倒入TAE溶液至淹没胶块,样品5μl与1μl溴汾兰在塑料皮上混匀后点样入胶孔内(注意不能有泡),加盖,通电,电压100V,电流45mA,40min后,关闭电源。 3.打开盖子,倒去TAE,取出胶块,在EB中染色5min,后用蒸馏水漂洗干净,紫外分析仪中(260nm),观察电泳条带。
3 PCR扩增 (一)试剂及器材: DNA提取物,Taq酶,Buffer,双蒸无菌水(灭菌过滤),PCR仪,电泳仪,离心机等。 (二)步骤: 1.PCR扩增,先设定程序,94℃,3min。(94℃,30s;55℃,30s;72℃,1min)×30。72℃,5min。及94℃,5min。(93℃,50s;46℃, 30s;68℃,1.2min)×35。68℃,7min。 2.将双蒸无菌水20μl,Buffer 3μl,引物NS1 1μl,引物NS2 1μl,dNTP 1μl,DNA(模板)3μl及Taq酶1μl依次加入,(Taq酶在冰上加入),总反应时间约2.5小时,反应结束后4℃,冰箱保存。(注意:加引物,dNTP及模板时需换枪头)。
3.1%琼脂糖胶电泳作鉴定。 剩余的再作电泳,用于回收扩增产物即目标DNA(1%胶更好,大孔梳子)。
4 目标带回收 (一)试剂及器材: 回收试剂盒,1×TAE Buffer(pH8.5),电泳仪、大小枪头、离心管,溴化乙淀,mark(d2000)等。 (二)步骤: 1.PCR扩增产物,用大孔梳子胶做电泳,将目标带用刀片切下估称重量(先称小离心管重量,再称放有胶带的重量,两次相差,即为胶的重量),胶约0.1g加300μl S1溶液,65℃,保温10 min,融化完全。 2.将300μl的DNA琼脂糖溶液加到一个回收纯化柱上,并把柱子装在一干净的2ml收集试管内,室温下12000rpm离心1.5min。 3.加500μl W1洗涤缓冲液,洗涤柱子,静臵2min,室温12000rpm离心1.5分钟。 4.加500μl W1洗涤缓冲液,洗涤柱子,室温12000rpm离心1.5分钟。 5.将空柱室温12000 rpm 离心1.5分钟,甩干残余液体。 6.将柱子装在一个灭菌干净的1.5ml离心管上,加20-30μl T1洗脱液在柱子中心,12000rpm,离心1.5分钟,洗脱DNA。 7.取3μl收集的DNA做电泳鉴定,检测是否回收到。
5 目的基因连接载体
(一)试剂及器材: solution[2×buffer,T4DNA连接酶],载体pMD18-T质粒,纯DNA目标基因片段等。 (二)步骤: 取纯化的DNA片段13μL(总量约30μL)加质粒载体pMD18-T 1.0μL(即25ng), solution 6μL(T4DNA连接酶及buffer),22℃过夜(连接)