鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测

鸡白细胞介素18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达李新生;尹红征;陈红英;邵攀峰;王振亚;宋亚鹏【期刊名称】《安徽农业大学学报》【年(卷),期】2009(36)4【摘要】通过RT-PCR技术直接从罗曼鸡脾脏提取的总RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序得到序列基因全长为597 bp的ChIL-18。

将ChIL-18成熟蛋白编码区(510 bp)定向插入到原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建重组表达质粒pGEX-ChIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下可高效表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。

SDS-PAGE可检测到分子质量约为46 kDa的GST-ChIL-18。

Western blot证实GST-ChIL-18能与鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。

融合蛋白GST-ChIL-18经谷胱苷肽Seph-arose-4B亲和柱层析纯化后明显促进鸡T淋巴细胞转化,表明所表达的ChIL-18具有一定的生物活性。

【总页数】5页(P547-551)【关键词】鸡白细胞介素18;成熟蛋白;克隆;原核表达【作者】李新生;尹红征;陈红英;邵攀峰;王振亚;宋亚鹏【作者单位】河南农业大学牧医工程学院;河南农业大学信息与管理科学学院【正文语种】中文【中图分类】S858.315.3【相关文献】1.海兰鸡白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 赵丽;崔保安;陈红英;宋凌云;方忠意;郑兰兰2.人白细胞介素-18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 徐东刚;牛建章;孟宗达3.河南良杂猪白细胞介素18基因的克隆及其成熟蛋白在大肠杆菌中的表达 [J], 郑兰兰;贾云飞;崔保安;陈红英;陈瑞亮4.猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 郑敏;金宁一;张洪勇;李昌;尹革芬5.人白细胞介素18的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 赵春艳;赵宝昌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

白细胞介素18及其在禽类中的研究进展
李行;韩凌霞
【期刊名称】《中国预防兽医学报》
【年(卷),期】2012(034)009
【摘要】白细胞介素18（Interleukin-18，IL-18）主要由单核-巨噬细胞系分泌，在结构上属于1L-1家族，在功能上与IL-12相似，而且与IL-12有协同效应，是
重要的调节先天性免疫和获得性免疫的因子。

IL-18除了能够明显诱导Th1、NK
及NKT细胞产生IFN-γ外，还可诱导诸如IL-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）及肿瘤坏死因子（TNF-α）等其它多种细胞因子的产生。

禽IL-18
具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫等中具有应用潜力。

【总页数】4页(P752-755)
【作者】李行;韩凌霞
【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实
验动物中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技
术国家重点实验室/实验动物中心,黑龙江哈尔滨150001
【正文语种】中文
【中图分类】S852.4
【相关文献】
1.白细胞介素18在HBV感染发病机制中作用研究进展 [J], 汤磊
2.白细胞介素18在重型肝炎机制中的研究进展 [J], 闫婧雅;阚全程;余祖江;李娟
3.糖尿病视网膜病变中白细胞介素-18作用信号通路的研究进展 [J], 杨晓春
4.白细胞介素-18在器官移植作用中的研究进展 [J], 胡慧霞
5.白细胞介素18在癌症中的研究进展 [J], 郭磊;辛本凯;沈若琪;张纪周;肖业臣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鸡IL-15、IL-16和IL-18基因实时荧光定量PCR检测方法的建立作者：王远萍，唐涛，吴艳秋，王国镔来源：《中国动物保健》2021年第02期摘要：根据GenBank上鸡白介素15（IL-15），白介素16（IL-16），白介素18（IL-18）基因的序列，在保守区设计并合成各自特异引物，并以β-actin基因为内参，采用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量PCR检测方法。

將基因克隆至pMD19-T载体上，以各阳性质粒作为标准品，构建标准曲线，并进行了熔解曲线分析。

结果表明，鸡IL-15、IL-16、IL-18和β-actin基因的Ct值与标准品稀释度在2×102～2×108copies/μL范围分别呈良好的线性关系，r2均大于0.999。

熔解曲线分析表明，产物为特异的单峰。

建立的鸡IL-15、IL-16和IL-18基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短，为在mRNA水平对鸡白介素的定量分析奠定了基础。

关键词：实时荧光定量PCR；鸡；IL-15；IL-16；IL-18细胞因子是多种细胞所分泌能调节细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症发生和创伤愈合等小分子多肽的统称[1]。

对于人细胞因子已经有较广泛的研究，现已有大量纯化的细胞因子在临床上用于治疗多种疾病，禽细胞因子的研究远远落后于人细胞因子的研究[2]。

近年来，人们主要是研究鸡细胞因子的佐剂效应，很少研究细胞因子差异表达与疾病之间的关系。

本研究主要是建立一种检测细胞因子表达的快速灵敏的方法，为细胞因子差异表达与疾病之间关系的研究奠定基础。

1材料与方法1.1试验动物、菌种和质粒试验动物为21日龄非免疫鸡，DH5α基因工程菌株，pMD19-T载体。

1.2主要仪器实时荧光定量PCR仪，普通PCR仪，凝胶成像系统，电泳仪，核酸蛋白测定仪，高速冷冻离心机，超净工作台，电热恒温培养箱。

1.3主要试剂TRNzol-A+总RNA提取试剂，Master Mix，Real MasterMix SYBR GreenⅠ，质粒小量提取试剂盒，反转录酶Prime Script，PCR产物回收试剂盒。

饲喂重组鸡白细胞介素18蛋白增加肉仔鸡体重的初步研究韩宗玺;刘胜旺;孔宪刚;冉多良【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2005(25)3【摘要】经口服途径给肉仔鸡饲喂重组鸡白细胞介素 1 8(ChIL -1 8)蛋白 ,观察其在正常饲养条件下和人工感染鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)时对肉仔鸡的影响。

将84只肉仔鸡随机分为 2组 :正常称重组和IBV接种组。

2组肉仔鸡再随机各分为3个亚组 ,分别每隔 5d各口服 1次PBS、细菌蛋白和重组ChIL -1 8蛋白。

正常称重组每亚组 8只 ,每次口服前称重。

IBV接种试验组每亚组 2 0只 ,在 30日龄时滴鼻接种IBVM41株并每隔 5d称重 1次。

各亚组试验鸡分别在正压隔离器中饲养。

结果表明 ,饲喂重组ChIL- 1 8蛋白的试验亚组肉仔鸡体重总增重量明显高于饲喂PBS和细菌蛋白的对照亚组 ;IBV接种试验组肉仔鸡在人工感染IBVM41株后 ,饲喂重组ChIL 1 8亚组的发病率和死亡率明显低于饲喂PBS和细菌蛋白亚组 ,而且后 2个亚组肉仔鸡临床症状也较饲喂重组ChIL- 1 8试验亚组明显。

结果初步显示 ,饲喂重组ChIL -1 8融合蛋白能够增加肉仔鸡体重并可增强肉仔鸡对IBV感染的抵抗能力。

【总页数】5页(P60-64)【关键词】肉仔鸡;饲喂;IBV;鸡体;接种试验;称重;人工感染;IL-18;正常;口服【作者】韩宗玺;刘胜旺;孔宪刚;冉多良【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;新疆农业大学动物医学学院【正文语种】中文【中图分类】Q78;S858.31【相关文献】1.酵母蛋白替代鱼粉对肉仔鸡饲喂效果的研究 [J], 石学刚;郭福存;李发弟2.鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测 [J], 李宏梅;胡敬东;马凤龙;郑玉姝;刘翠艳;田兆菊;赵宏坤3.甘氨酸两种衍生物替代抗生素饲喂肉仔鸡效果的初步研究 [J], 苏玲玲;李凤鸣;杨开伦;苏伟祚;梅李红4.重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)对MDV感染SPF鸡细胞免疫的影响 [J], 李宏梅;胡敬东;郭慧君;郑玉姝;刘翠艳;田兆菊;赵宏坤5.重组鸡白细胞介素18对不同基因型新城疫病毒HN基因表达蛋白免疫活性的影响 [J], 张立娜;华彦;柴洪亮;贾竞波因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测的开题报告
一、研究背景
白介素18（IL-18）是一种重要的细胞因子，它能够调节免疫细胞的增殖、分化和活化，参与机体的免疫应答。

因此，IL-18在疾病的预防和治疗中有很大的潜力。

研究证明，鸡IL-18的生物活性较高，因此成为研究IL-18的生物学功能和应用价值的重要模型。

二、研究目的
本研究的主要目的是利用毕赤酵母表达系统高效表达鸡IL-18的成熟蛋白突变体，并对其生物活性进行检测，为进一步研究鸡IL-18的生物学功能和应用价值提供有力的基础。

三、研究内容和方法
（一）鸡IL-18成熟蛋白突变体的构建
首先，利用基因编辑技术构建鸡IL-18的成熟蛋白突变体；其次，利用RT-PCR技术从鸡胸腺中提取IL-18的成熟RNA，经过反转录和PCR 扩增，得到IL-18成熟蛋白突变体的cDNA序列，并进行定向克隆到表达载体中。

（二）毕赤酵母表达系统的构建和表达条件的优化
将表达载体转化到毕赤酵母中，并利用SDS-PAGE和Western blot 技术检测其表达情况，同时优化表达条件，以提高鸡IL-18成熟蛋白突变体的表达量。

（三）生物活性的检测
利用ELISA技术检测鸡IL-18成熟蛋白突变体的生物活性，通过测定不同浓度IL-18处理后的小鼠脾细胞增殖情况来评估其生物活性。

四、研究意义和预期结果
本研究将为进一步研究鸡IL-18的生物学功能和应用价值提供有力的基础。

预期结果为成功构建鸡IL-18成熟蛋白突变体，并利用毕赤酵母表达系统高效表达，并且在其生物活性检测中取得重要的进展。

鸡α干扰素／白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究何静;张盼盼;孙敏华;康银峰;谢鹏;向斌;韩翡;谭阳通;任涛【摘要】目的构建原核表达载体pET28a-rChIFN-α-ChIL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测，研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂，以对鸡的病毒性疾病进行防治。

方法采用融合PCR （Fusion PCR ）方法，利用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素（Chicken interferon alpha，ChIFN-α）与鸡白细胞介素18（Chicken interleukin-18，ChIL-18）基因构建ChIFN-α-ChIL-18融合基因并克隆入pET-28 a原核表达载体中进行原核表达。

通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白，并进行 SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定。

采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-ChIL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒（VSV）及新城疫病毒（NDV）增殖活性。

结果和结论成功构建并克隆了pET28a-rChIFN-α-ChIL-18融合基因。

融合基因在大肠埃希菌中表达的rChIFN-α-ChIL-18蛋白相对分子质量约为38000，蛋白经纯化后纯度在90％以上。

rChIFN-α-ChIL-18蛋白在鸡胚成纤维（ CEF）细胞上具有明显抗病毒活性，其抗VSV和NDV的活性明显高于单一rChIFN-α、rChIL-18蛋白的抗病毒活性。

%[Objective]This study was conducted to explore a highly efficient chicken gene engineering an-tiviral agent to prevent and control the chicken viral disease .A recombinant plasmid pET28a-rChIFNα-IL18 was constructed , which was expressed in Escherichia coli, purified by Ni-NTA and tested for antivi-ralbioactivitiy .[Method] This study introduced a novel method for constructing vectors by fusion PCR , which generated PCR products withoverlapping chain using Primers complementary to the end .Through the extension of PCR products , ChIFN-αand ChIL-18 constituted the ChIFN-α-ChIL-18 fusion gene when cloned into the vector pET-28a, induced the expression in E.coli strain BL21 (DE3).This pro-tein was purified by Ni-NTA and detected by SDS-P AGE and Western-blot.Cytopathic effects( CPE) were applied to examine the potency of recombination rChIFN-α-ChIL-18 against vesicular stomatitis virus (VSV) and newcastle disease virus ( NDV) proliferation.[Result and conclusion] The fusion gene of ChIFN-α-ChIL-18 was successfully constructed and cloned into pET-28a vector.The rChIFN-α-ChIL-18 protein was expressed in E.coli and successfully purified with a molecular mass of about 38 000 and more than 90% on SDS-PAGE, which indicated that the correct rChIFN-α-ChIL-18 fusion protein had been obtained .The antiviral activity units of rChIFN-α-ChIL-18 protein inhibiting the reproduction of VSV and NDV on chicken embryo fibroblast ( CEF) cells were much higher than those of the recombinant rChIFN-α, rChIL-18 protein.【期刊名称】《华南农业大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P18-22)【关键词】鸡α干扰素;鸡白细胞介素18;融合PCR;抗病毒活性【作者】何静;张盼盼;孙敏华;康银峰;谢鹏;向斌;韩翡;谭阳通;任涛【作者单位】华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642;华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642;华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642;华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642;华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642;华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642;华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642;华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642;华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】S852.65何静，张盼盼，孙敏华，等.鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究［J］.华南农业大学学报，2015，36(1):18-22.α干扰素(IFN-α)具有广谱抗病毒活性［1］，其主要作用是抑制病毒繁殖、抗肿瘤活性、加强NK细胞杀伤病毒感染细胞的能力从而抑制病毒的增殖和扩散、增强机体细胞免疫应答水平等［2］.白细胞介素18 (IL-18)是20世纪80年代发现的一类细胞因子，由单核巨噬细胞系统的细胞分泌，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用.ChIL-18除了能明显诱导IFN-γ基因表达外，还可诱导诸如 IL-2、TNF-α及GMCSF等多种细胞因子的产生，同时，IL-18也可增强CTL细胞和NK细胞的活性，上调细胞毒活性作用，促进T细胞增殖，在细胞免疫反应中发挥重要作用［3］.近年来有关IL-18的研究非常活跃，其应用领域包括抗肿瘤、抗感染及作为免疫调节剂治疗一些免疫性疾病，具有重要的临床应用价值.本研究采用融合PCR(Fusion PCR)方法，将鸡ChIFN-α与Ch IL-18基因构建成Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入pET-28a原核表达载体中进行表达，该蛋白具有很好的免疫原性和很强的抗水泡性口炎病毒(VSV)和新城疫病毒(NDV)活性.这项研究可有效地降低研制成本，易于生产，且具有叠加的ChIFN-α和ChIL-18抗病毒功能，为生产高活性及高效基因工程重组复合抗病毒制剂奠定了基础.1.1 材料1.1.1 菌(毒)株与质粒大肠埃希菌Escherichia coli BL21、DH5α菌株由华南农业大学兽医学院动物传染病实验室保存;VSV由广东省农业科学院惠赠; NDV及质粒载体pET-28a均由华南农业大学兽医学院动物传染病实验室保存.1.1.2 试剂 PCR扩增用试剂、内切酶、T4连接酶、dNTP均为大连(宝)生物(TaKaRa)工程有限公司产品;DNA回收试剂盒、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒等试剂均为Omega公司产品;TRIzol试剂为Invitrogen公司产品;淋巴细胞分离液为杭州灏洋生物工程公司产品;DM EM培养基和小牛血清均为Hyclone公司产品.1.1.3 主要仪器设备 PTC-200型PCR仪为美国MJReSearch公司产品;凝胶成像分析系统为英国Gyndene公司产品;Galaxy 300 L CO2培养箱为英国Rsbiotech 公司产品;分光光度计(ND-1000)为Nano-Drop公司产品;恒温CO2培养箱为英国Rsbiotech公司产品;超声波裂解仪为美国Scientz公司产品.1.2 方法1.2.1 引物的设计与合成参照GenBank登录的ChIFN-α基因序列(DQ226092)、ChIL-18基因序列(AJ277865)及pET-28a(+)多克隆位点，用Oligo 7 (Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，CO)辅助设计2对具有互补末端的引物，分别为P1/P2、P3/ P4引物对，引物均由英潍捷基(广州)贸易有限公司(Life technologies)合成.本试验所用引物见表1.1.2.2 Ch IFN-α-ChIL-18融合基因的构建参照李敏等［4］报道的方法进行ChIFN-α-ChIL-18融合基因的构建.首先采用 P1/P2引物对，以 rpMD19-T/ ChIFN-α质粒为模板对ChIFN-α基因片段进行扩增后，采用P3/P4引物对，以rpMD19-T/ChIL-18质粒为模板扩增ChIL-18基因片段.使用低熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收ChIFN-α、ChIL-18基因片段，将上述2个回收产物混合，取0.5μg混合物用于ChIFN-α与ChIFN-γ基因的融合反应.采用P2/P3引物对，依据上述融合反应片段为模板进行ChIFN-α与ChIL-18融合片段的PCR扩增.回收约996 bp的PCR产物.1.2.3 ChIFN-α-ChIL-18融合基因的克隆、测序与表达将“1.2.2”回收的996 bp左右的PCR产物定向克隆至 pMD19-T载体，后筛选阳性克隆质粒(pMD19-T/ChIFN-α-ChIL-18)送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，阳性克隆质粒经Eco RⅠ和Hin dⅢ双酶切后连接到经相同酶双切后的表达载体pET-28a(+)，将构建好的重组pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18表达质粒分别转入宿主菌E.coli BL21中，筛选阳性重组菌送英潍捷基(广州)贸易有限公司(Life technologies)测序.选取核苷酸序列和插入方向都正确的重组菌、pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18空载体菌对照、BL21空菌对照进行IPTG诱导表达，采用SDSPAGE分析表达蛋白.1.2.4 重组ChIFN-α-ChIL-18融合蛋白的诱导表达及 Western-blot分析将测序正确的 pET-28a/ ChIFN-α-ChIL-18于10 mL含Kna+的LB液体培养基中，37℃、150 r/min扩大培养12 h.取培养物5 mL接种于500 mL LB液体培养基中，37℃、150 r/min振荡培养至D600nm达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，16℃诱导表达10 h，同时，设立37℃诱导表达(IPTG至终浓度为1.0 mmol/L)的对照组、未诱导的菌液和pET-28a/BL21空载体菌作为阴性对照.制备12%分离胶和5%浓缩胶，利用SDSPAGE电泳检查目的蛋白表达情况.将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜(NC)，将His标签抗体(1∶2 000)作为一抗，然后用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶10 000)作二抗，进行Western-blot反应.1.2.5 重组ChIFN-α-ChIL-18融合蛋白的纯化通过试验证明pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18原核表达载体表达的融合蛋白于上清液中以可溶性形式存在，按GE公司Ni-NTA纯化系统说明书的Native purifycation方法纯化融合蛋白.用紫外分光光度计分别测定D260nm和D280nm，根据下式计算蛋白质质量浓度［ρ(蛋白质)］［5］: ρ(蛋白质)=(1.45×D280nm-0.74×D260nm).1.2.6 rChIFN-α-ChIL-18蛋白抗病毒活性检测采用微量细胞病变抑制法在鸡胚成纤维(CEF)细胞上测定rChIFN-α-ChIL-18蛋白的抗VSV及NDV活性.同时设rChIFN-α、rChIL-18蛋白对照.CEF细胞在96孔细胞培养板培养至单层后，将纯化的ChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α、rChIL-18用维持液(DMEM+体积分数为2%的FCS)进行4倍倍比稀释，每个稀释度重复8孔，于37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养12 h后，弃上清液，用PBS洗涤后，分别加入100μL 100TCID50 VSV和100μL 100TCID50NDV的病毒稀释液，同时设置只用病毒攻毒对照组和正常细胞对照组，继续培养48～72 h后观察细胞病变情况，待阳性对照细胞出现明显细胞病变时判定结果，能抑制50%细胞病变的细胞因子的最高稀释度的倒数作为其抗VSV、NDV活性单位.采用Reed-Muench法［6］计算 rChIFN-α-ChIL-18蛋白抗VSV及NDV活性，同时与rChIFN-α、rChIL-18蛋白进行比较.2.1 Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因的构建以重组质粒 pMD19-T/ChIFN-α和 pMD19-T/ ChIL-18为模板PCR扩增IFN-α和IL-18片段，得到ChIFN-α和ChIL-18 PCR扩增产物，大小分别为489和510 bp;采用P2/P3引物对扩增到了大小为996 bp左右的ChIFN-α-ChIL-18融合基因，这些扩增产物大小均与预期的相一致(图1).说明采用融合PCR方法成功构建了ChIFN-α-ChIL-18融合基因.2.2 Ch IFN-α-Ch IL-18基因表达载体的构建ChIFN-α-ChIL-18融合基因成功克隆入pMD19-T载体，测序结果表明，融合基因序列全长为996 bp，对比原模板质粒中的ChIFN-α和ChIL-18核苷酸序列没有发生变异.对阳性rpET-28a/ChIFN-α-ChIL-18质粒测序表明，插入 pET-28a 载体中的 ChIFN-α-ChIL-18融合基因长度为 996 bp，与 pMD19-T/ ChIFN-α-ChIL-18克隆质粒中的相应基因序列完全一致.以上结果表明成功构建了pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18表达质粒.2.3 rCh IFN-α-Ch IL-18蛋白的表达及鉴定重组菌BL21(pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18)经IPTG诱导后，经SDS-PAGE和Western-blot分析，结果表明，表达的重组蛋白相对分子质量为38 000左右，与预期大小相一致;且该融合蛋白具有可溶性，由SDS-PAGE电泳结果可知，16℃比37℃更利于蛋白在上清液中的表达.对照BL21空菌和含pET-28a空载体的BL21菌在相应位置均无条带(图2).2.4 重组Ch IFN-α-Ch IL-18融合蛋白的纯化将诱导后的菌体超声裂解，纯化后经SDS-PAGE电泳检测，结果显示目的蛋白由Native-100的咪唑洗涤液洗脱下来，用凝胶扫描分析，蛋白纯度高达90%以上(图3).经紫外分光光度计测定融合蛋白ChIFNα-IL18质量浓度为0.350 mg/mL. 2.5 rCh IFN-α-Ch IL-18蛋白抗病毒活性检测2.5.1 rChIFN-α-ChIL-18蛋白抗VSV活性将抑制50%细胞病变的干扰素稀释度的倒数作为干扰素抗VSV活性单位.计算得rChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α以及rChIL-18的活性分别约为4.67×106、2.58× 105、5.9×103IU/mg.试验结果表明，分别经rChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α及 rChIL-18蛋白作用后感染VSV的正常CEF细胞，正常的CEF细胞均无细胞病变，而病毒对照组感染VSV的CEF细胞基本死亡(图4).说明rChIFNα-IL18和rChIFN-α、rChIL-18均有明显的抗病毒活性，且融合蛋白的抗病毒效果要高于单一蛋白.2.5.2 rChIFN-α-ChIL-18蛋白抗NDV活性将可以抑制50%细胞病变的干扰素的稀释浓度的倒数作为干扰素抗NDV活性单位.计算得rChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α及rChIL-18抗NDV的活性分别约为3.17×106、2.0×103、1.19×103IU/mg.试验结果表明，分别经 rChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α及rChIL-18蛋白作用后感染NDV的正常CEF细胞，正常的CEF细胞均无细胞病变，而病毒对照组感染VSV的 CEF细胞基本死亡(图5).说明rCh IFNα-IL18和rChIFN-α、rChIL-18均有明显的抗病毒活性，且融合蛋白的抗病毒效果要高于单一蛋白.目前禽类病毒性传染病依然严重威胁着养禽业，但是仍然没有有效的药物可以预防，人们的防控依然主要依靠疫苗免疫.由于疫苗的单一血清型而导致无法有效地对快速变异的病毒进行防控，而大量药物的使用，引起一系列的药物残留和抗药性的问题.因此研发广谱、高效、安全、无毒副作用的抗病毒药物对促进养鸡业健康发展具有重要意义.干扰素因具有广谱的抗病毒活性，一方面可以促进机体加强对病毒的抵抗，另一方面也能促进疫苗的免疫效果.因此重组干扰素的研究和应用将成为病毒性疾病防治的重要方向.rIFN-α具有广谱的抗病毒活性，基因工程rIFN-α作为抗病毒制剂对多种病毒性疾病的疗效已明确［7］.rChIFN-α蛋白对NDV［8］、禽流感H9N2型病毒及马立克氏病毒［9-11］均具有抑制作用，rChIL-18蛋白可调节机体免疫功能，明显诱导IFN-γ基因表达，增强疫苗的免疫效果.本研究通过融合PCR方法成功将ChIFN-α、ChIL-18基因融合成ChIFN-α-ChIL-18融合基因并进行了融合表达，经对比rChIFN-α-ChIL-18融合蛋白进行生物学活性测定结果表明，rChIFN-α-ChIL-18蛋白在 CEF细胞上具有明显优于单一rChIFN-α和rCh IL-18的生物学活性，说明rCh IFN-α-ChIL-18具有单一rChIFN-α蛋白和rChIL-18蛋白的双重生物学活性，调动了机体强大的免疫功能，发挥抗病毒效果，这与闫若潜等［7］的相关报道一致.本研究采用的融合PCR方法，与传统利用酶切位点将各个片段逐个连接到载体上的方法相比，此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接，大大缩短了反应时间，降低了操作难度.重组蛋白绝大部分以可溶的形式存在于上清液中.正常的诱导表达中，蛋白主要以包涵体的形式存在，由于包涵体纯化难度高、纯化产物不易保存，本试验经过多次探索，发现在16℃低温诱导条件下，上清液中可检测到可溶性蛋白表达.本研究证明，rChIFN-α-Ch IL-18蛋白对NDV和VSV具有有效的抑制效应，本试验为临床上新城疫的防治提供了新的思路和方法，对病毒性疫病的防控具有重要意义［10］.同时为下一步将rChIFN-α-ChIL-18蛋白用于鸡体内抗病毒感染研究奠定了基础.【相关文献】［1］ MEAGER A，LEUNG H，WOOLLEY J，et al.Assays for tumour necrosis factor and related cytokines［J］.J Immunol Methods，1989，116(1):1-17.［2］ JOHNSON H M，BAZE FW，SZENTE B E.How interferons fight disease［J］.Sci Am，1994，270(5):68-75.［3］王宪文，刘兴友，王岩.鸡白细胞介素18研究进展［J］.安徽农业科学，2008，36(16):6776-6777.［4］李敏，杨谦.一种高效构建同源重组DNA片段的方法—融合PCR［J］.中国生物工程杂志，2007，27(8): 53-58.［5］韦琴，彭贵青，金梅林，等.鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究［J］.生物工程学报，2006，22 (5):737-743.［6］ SAGANUWAN SA.Amodified arithmeticalmethod of reed and muench for determination of a relatively idealmedian dose(LD50)［J］.Afr JPharm Pharmacol，2011，5(12): 1543-1546.［7］闫若潜，谢彩华，吴志明.鸡α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究［J］.中国农业科学，2010，43 (3):594-604.［8］ YEH H Y，WINSLOW B J，JUNKER D E，et al.In vitro effects of recombinant chicken interferon-gamma on immune cells［J］.J Interf Cytok Res，1999，19(6):687-691.［9］ MEAGER A.Biological assays for interferons［J］.J Immunol 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编码鸡IL-18成熟蛋白基因的分子克隆与序列测定潘蔚绮;刘胜旺;孔宪刚;李广兴;夏春【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2003(025)002【摘要】白细胞介素18(IL-18)是一种能诱导IFN-γ产生的新型细胞因子,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用.本研究根据已发表的鸡白介素18(IL18)cDNA 基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从有丝分裂原ConA刺激48小时活化的白来航鸡脾细胞中扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白质的基因,并进行序列测定,并与结果进行了比较,发现本研究克隆到的鸡IL-18成熟蛋白编码基因序列在482位为C,而Schnieder等报道的序列为T,这一核苷酸序列的变化导致了推导的对应氨基酸残基由苯丙氨酸变为丝氨酸.该处碱基变化的原因究竟是鸡IL-18本身存在多态性,还是反转录或PCR过程中的碱基错配所致,该处碱基的变化对于鸡IL-18蛋白的表达及其生物活性究竟有无影响等问题正在研究中.该基因为国内首次报道经序列测定证实的鸡IL-18基因,为进一步体外表达鸡IL-18蛋白并深入研究其功能奠定了基础.【总页数】4页(P114-117)【作者】潘蔚绮;刘胜旺;孔宪刚;李广兴;夏春【作者单位】东北农业大学动物医学院;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;东北农业大学动物医学院;中国农业大学动物医学院【正文语种】中文【中图分类】S852.652;Q78【相关文献】1.鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备 [J], 刘一尘;张春杰;程相朝;张谦;李银聚;吴庭才;赵战勤2.H5亚型AIV的HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因的杆状病毒共表达载体的构建 [J], 孔娜;田夫林;兰邹然;杨林;冯涛;梁成珠;赵宏坤3.鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及分子进化分析 [J], 王振国;金宁一;张洪勇;尹革芬;葛淑敏4.鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 王振国;金宁一;马鸣潇;张洪勇;尹革芬;金扩世5.鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达 [J], 刘一尘;张春杰;程安春;程相朝;汪铭书;李银聚;吴庭才;易明林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。