分子生物学的研究方法-DNA-蛋白质相互作用

细胞分子生物学研究中常用的技术和方法细胞分子生物学是指研究细胞内发生的生物分子互作及其调控的学科。

随着生命科学技术的不断发展和完善，许多技术和方法得以应用于细胞分子生物学的研究中。

本文将从多个方面介绍细胞分子生物学研究中常用的技术和方法。

一、基因克隆技术基因克隆技术是一种常用的细胞分子生物学研究方法。

它可以通过将感兴趣的DNA序列插入载体DNA上，构建含有特定目的基因的重组DNA，最终将重组DNA引入宿主细胞中来研究某一基因的生物学功能。

基因克隆技术的核心是重组DNA技术，其中最常用的重组DNA方法包括限制性内切酶切割、DNA连接、转化及放大等步骤。

特别是在近年来的分子克隆技术中，基因编辑技术的应用使得基因克隆技术更加得到精细化和精确化。

二、蛋白质结构分析技术蛋白质是生物体中极其重要的分子之一，其结构对蛋白质的生物学功能有着至关重要的作用。

蛋白质的功能在很大程度上取决于其三维结构，因此蛋白质结构的研究是细胞分子生物学的重要研究领域。

蛋白质结构分析技术包括X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜等。

其中，X射线晶体学是目前分析蛋白质最为常用的方法之一，其原理是利用X射线的衍射来确认蛋白质的三维结构。

三、荧光素酶标记技术酶标记技术是研究酶在细胞中的分布和功能的重要方法，其中荧光素酶标记技术则成为近年来应用最广泛的方法之一。

荧光素酶由日本学者O. Shimomura于1962年首次发现，可以发出明亮的荧光，被广泛应用于生物学研究中。

目前，荧光素酶标记技术被用来研究蛋白质的定位和运动等生物学过程，其原理是将荧光素酶标记的免疫球蛋白等物质与荧光素底物结合，从而通过荧光显微镜来研究生物分子的动态变化。

四、蛋白质互作筛选技术蛋白质在细胞中的互作是细胞分子生物学研究的重要问题之一。

蛋白质互作筛选技术则可以用来鉴定蛋白质之间的相互作用关系。

目前常见的蛋白质互作筛选技术包括酵母双杂交法、共免疫共沉淀、荧光共聚焦显微镜等。

可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。

本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。

电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。

由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。

在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。

从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。

分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。

Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

分子生物学试卷（二）生分子生物学试卷（二）一、选择题，选择一个最佳答案（每小题1.5分，共30分）1.DNA双螺旋结构模型的描述中哪一条不正确：（）A.腺嘌呤的克分子数等于胸腺嘧啶的克分子数B.同种生物体不同组织中的DNA碱基组成极为相似C.DNA双螺旋中碱基对位于外侧D.二股多核苷酸链通过A-T,C-T之间的氢键连接E.维持双螺旋稳定的主要因素是氢键和碱基堆集力。

2.有关DNA的变性哪条正确：（）A.变性是分子中磷酸二酯键的断裂B.变性后紫外吸收增加C.变性后粘度增加D.热变性DNA速冷后可复性E.DNA分子开始变性的温度叫Tm3.DNA聚合酶III的描述中哪条不对：（）A.需要四种三磷酸脱氧核苷酸作底物B.具有5′→3′外切酶活性C.具有3′→5′外切酶活性D.具有5′→3′聚合活性E.聚合反应需要引物4.有关反转录的正确叙述：（）A.反转录反应不需要引物B.反转录后的产物是cDNAC.反转录的板可以是RNA,也可以是DNAD.合成链的方向是3′→5′E.反转录反应的底物是4种NTP。

5.有关蛋白质合成，下列哪条是错误的：（）A.基本原料是20种氨基酸B.直接模板是mRNAC.合成的方向是从羧基端到氨基础D.是一个多因子参加的耗能过程E.是多聚核蛋白体循环6.在乳糖操纵子中，阻遏蛋白结合的是：（）A.操纵基因B.调节基因C.启动基因D.结构基因E.终止基因7.氨基酸活化酶：（）A.能识别一组同功tRNAB.催化磷酸二酯键的形成C.催化氨基酸结合到tRNAD.催化氨基酸的氨基与tRNA结合E.催化氨基酸的羧基与GTP反应8.稀有核苷酸含量最高的核酸是：（）A.tRNAB.mRNAC.rRNAD.DNAE.hnRNA9.真核与原核细胞蛋白质合成的相同点是：（）第 1 页共5 页A.翻译与转录偶联进行B.模板都是多顺反子C.转录后的产物都需要进行加工修饰D.甲酰蛋氨酸是第一个氨基酸E.都需要GTP10.与pCAGCT互补的DNA序列是：（）A.pAGCTGB.pGTCGAC.pGUCGAD.pAGCUGE.pTCGAC11.色氨酸操纵子的调控需要：（）A.增强子B.转录子C.衰减子D.顺反子E.调节子12.下列哪种氨基酸的密码子可作为起始密码：（）A.甲硫氨酸B.S-腺苷蛋氨酸C.苯丙氨酸D.丙氨酸E.以上都不是，而是TAG13.真核细胞中mRNA的加工修饰不包括：（）A.在mRNA3′末端另polyA尾B.mRNA的前体是核内hnRNAC.在mRNA5′端形成7甲基尿苷酸帽子结构D.除去非结构信息部分E.不同RNA片断之间的拼接14.真核生物基因组中没有：（）A.内含子B.外显子C.转录因子D.插入序列E.高度重复序列15.DNA的半保留复制需要（）A.核心酶和单链DNA结合蛋白B.模板DNA和四种NTPC.引物和RNA聚合酶D.DNA引物和连接酶E.冈崎片段和终止因子16.PCR实验的特异性主要取决于（）A.DNA聚合酶的种类B.反应体系中模板DNA的量C.引物序列的结构和长度D.四种dNTP的浓度E.循环周期的次数17.RNA电泳转移后与探针杂交叫作：（）A.SouthernblotB.NorthernblotC.WesternblotD.斑点杂交E.原位杂交18.对限制性核酸内切酶的作用，下列哪个不正确：（）A.识别序列长度一般为4-6bpB.识别序列具有回文结构C.切割原核生物D分子D.只能识别和切割双链DNA分子E.只能识别和切割原核生物DNA分子19.在基因工程实验中，DNA重组体是指：（）A.不同来源的的两段DNA单链的复性B.目的基因与载体的连接物C.不同来原的DNA分子的连接物D.原核DNA与真核DNA的连接物E.两个不同的结构基因形成的连接物20.对基因工程载体的描述，下列哪个不正确：（）A.都可以转入宿主细胞B.都有限制性核酸内切酶的识别位点C.都可以连接进目的基因D.都是环状双链DNA分子E.都有筛选标志二、简答题（每题5分，共40分）1.衰减子2.DNA拓扑异构酶3.基因表达4.前导肽5.启动子6. DNA分子克隆技术7.G蛋白8.受体型酪氨酸激酶三、论述题（每题10分，共30分）1.操纵子中的诱导剂和辅阻遏对基因表达的调控有何不同？2.细胞内第二信使包括哪些物质?它们是怎样产生的,有何作用?3.PCR和细胞内DNA复制两者有哪些主要的相同点和不同点?参考答案一、选择题，选择一个最佳答案（每小题1.5分，共30分）1.D；2.B；3.A；4.A；5.A；6.C；7.C ；8.C ；9.B；10.E二、填空题（每题1分）1．质粒DNA具有三种不同的构型分别是：（SC构型）、（oc构型）、（L构型）。

简述分子生物学的主要研究内容分子生物学是研究生物体内生命活动的基础单位——生物分子的结构、功能和相互关系的学科。

其主要研究内容包括以下几个方面：1. DNA 的结构和功能：分子生物学研究DNA 的双螺旋结构、碱基序列以及 DNA 的复制、修复、重组等功能。

此外，还研究 DNA 的转录为 RNA 的过程，进一步揭示基因的表达和调控机制。

2. RNA 的结构和功能：分子生物学研究各种 RNA 分子的结构、合成与分解、调控以及功能，例如信使 RNA (mRNA)、转运RNA (tRNA)、核糖体 RNA (rRNA) 等，以及其他非编码 RNA 的功能。

3. 蛋白质的合成和调控：分子生物学研究蛋白质的合成、折叠、修饰和降解等过程，同时也研究蛋白质的结构和功能。

此外，还研究基因表达调控中的转录因子、启动子、细胞信号转导等分子机制。

4. 基因工程和基因治疗：分子生物学在基因工程和基因治疗领域有重要应用。

基因工程利用分子生物学技术修改和调控基因，创造出具有特殊功能的生物体或蛋白质。

基因治疗是利用DNA 或RNA 分子为基础，将健康基因导入到疾病患者体内，以修复或替代异常基因。

5. 分子进化与系统生物学：分子生物学通过比较生物体内分子的序列或结构，揭示物种之间的进化关系和生物进化机制。

此外，还应用分子生物学技术研究生物多样性、系统分类学和物种分化。

6. 生物信息学：随着大规模基因组测序技术的发展，分子生物学与信息学的交叉研究逐渐成为一个新兴领域。

生物信息学的研究内容包括基因组学、蛋白质组学、转录组学和表观基因组学等，主要应用于基因组序列分析、生物序列比较、蛋白质结构预测和表达调控网络研究等方面。

总之，分子生物学的主要研究内容可以总结为 DNA、RNA 和蛋白质的结构、功能和相互关系，以及与之相关的基因表达调控、基因工程、基因治疗、分子进化和生物信息学等方面的研究。