3 林(Folin)-酚试剂法测定

实验（四）蛋白质浓度测定——Folin-酚试剂法[原理]实验室常规测定蛋白质含量方法中，以Lorry等人发展的Folin-酚试剂法应用最为普遍。

该方法的优点是：灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10～20倍，双缩脲法灵敏100倍；操作简单快速，不需要复杂的仪器设备。

但它的不足之处是反应过程中受干扰因素较多。

Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。

在Folin-酚试剂法中，蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。

由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比。

通过比色测定，参照已知含量的标准蛋白质的标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。

本法可测定蛋白质含量的范围在25～250μg/mL。

由于不同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸残基的量不同，致使等量的不同蛋白质所显示的颜色深度不尽一致，产生误差。

如果所用溶液或样品中含有带“-CO-NH2”、“-CH2-NH2”、“-CS-NH2”基团的化合物，或者溶液或样品中含有氨基酸、Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时，会给本方法的测定带来干扰。

磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin-酚试剂B）仅在酸性条件下稳定，而蛋白质的显色反应需在pH10的环境中进行，因此当试剂B加入后应当立即充分混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前与蛋白质发生显色反应，这对于结果的重现性非常重要。

[方法与步骤]1、标准曲线的绘制取六支试管，标明编号（0～5），放置在试管架上，在试管内分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准酪蛋白溶液，用蒸馏水补足至每管总体积1.0mL。

再加入新配制的试剂A 5.0mL，充分混合，在室温下放置10min。

各管中加入0.5mL试剂B，立即摇匀，然后在室温下放置30min。

以零号管作空白对照，在660nm波长下比色测定。

folin酚试剂法测定蛋白质含量实验过程以folin酚试剂法测定蛋白质含量实验过程为标题一、引言蛋白质作为生物体内最重要的有机大分子之一，在生物学研究、生物医学和食品科学等领域中具有广泛的应用。

准确测定蛋白质的含量对于科学研究和实验分析至关重要。

本文将介绍一种常用的方法——folin酚试剂法测定蛋白质含量。

二、实验原理folin酚试剂法利用蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和组氨酸等具有芳香环的氨基酸与酚试剂发生氧化反应，在碱性条件下生成蓝色化合物，通过测定其吸光度从而计算蛋白质的含量。

该方法具有灵敏度高、操作简便等优点。

三、实验步骤1. 样品制备：将待测蛋白质样品溶解于适量的缓冲液中，使样品浓度控制在合适的范围内，通常为0.1-1.0 mg/mL。

2. 加入酚试剂：取适量的样品溶液，加入等体积的folin酚试剂。

3. 摇匀并静置：用试管或离心管摇匀试剂和样品，然后静置15-30分钟，使试剂与蛋白质充分反应。

4. 吸光度测定：将反应体系转移到光波长范围在650-750 nm之间的比色皿中，以空白试剂为对照，使用分光光度计测定吸光度。

5. 绘制标准曲线：取一系列已知浓度的标准蛋白质溶液，按照上述步骤进行处理和测定，绘制蛋白质浓度与吸光度之间的标准曲线。

6. 计算样品蛋白质含量：根据样品的吸光度值和标准曲线，通过插值或计算得出样品中蛋白质的含量。

四、结果与讨论将实验得到的吸光度值代入标准曲线中，可以得到样品中蛋白质的含量。

folin酚试剂法对于大多数蛋白质都有较好的测定效果，但对于一些特殊的蛋白质，如硫酸肌酸和硫酸软骨素等，可能会出现干扰。

此外，在使用过程中应注意控制各步骤的操作时间和条件，以保证实验的准确性和可重复性。

五、实验注意事项1. 保持实验环境清洁，避免杂质对结果的影响。

2. 注意使用过期的试剂可能导致结果的偏差。

3. 操作时要注意避免酚试剂和其他化学品的接触，避免引起意外事故。

4. 在吸光度测定时，应使用适当范围的波长，避免光吸收过高或过低。

蛋白质含量测定方法——Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理是蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸残基在Folin试剂存在下氧化成碘，与酚试剂结合形成一种蓝色复合物。

由于蛋白质的量与Folin 试剂呈正比，因此可以通过比色法测定蛋白质含量。

步骤：1. 准备一系列浓度的标准蛋白质溶液（从低到高），并设置空白对照。

2. 取一定量的Folin试剂和样品混合，充分摇匀后静置2-3分钟。

3. 用酚试剂对样品进行稀释，制备出一系列浓度的标准样品。

4. 对比观察各标准样品的颜色变化，找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。

5. 绘制标准曲线，再用于样品蛋白质的测定。

6. 根据样品中剩余的Folin试剂颜色，求出样品中的蛋白质含量。

注意事项：1. 必须严格控制反应温度和时间，以免影响测定的准确度。

2. 在加入Folin试剂后，需要摇动几次以确保充分反应。

3. 如果要测定的样品含有维生素C或其他具有抗氧化性质的物质，需要事先进行去除或中和。

4. 对于浓度过高的样品，建议先进行稀释再进行测定。

在实践中，除了遵循以上步骤，还可以参考以下技巧和经验：* 使用干净的玻璃器具来操作，避免使用塑料器具导致的颜色干扰。

* 在加入Folin试剂后，可以加入少量无水乙醇来稳定颜色反应。

* 在绘制标准曲线时，可以使用不同浓度的标准蛋白质溶液制备一系列梯度样品，这样可以更准确地找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。

* 对于未知样品，可以先进行预实验，大致确定蛋白质浓度范围，以便更好地控制实验进程。

总之，Folin—酚试剂法是一种简便、灵敏的蛋白质定量方法，通过遵循正确的步骤和注意事项，可以获得较为准确的测定结果。

folin酚试剂法Folin酚试剂法是一种常用于测定物质浓度的方法。

它基于Folin-Ciocalteu试剂与物质中的还原性化合物反应产生蓝色产物的原理。

该方法被广泛应用于食品、药品、生物化学等领域的研究中。

Folin-Ciocalteu试剂是一种含有酚酸和磷酸的溶液，它具有优异的氧化性能。

在试验中，Folin-Ciocalteu试剂首先与物质中的还原性化合物反应，生成具有吸收波长为760nm的蓝色产物。

蓝色产物的浓度与物质中还原性化合物的浓度成正比，通过测量蓝色产物的吸光度，可以间接测定物质中还原性化合物的浓度。

Folin酚试剂法的优点在于操作简便、灵敏度高、适用范围广。

它可以测定各种还原性化合物，如多酚类物质、抗氧化剂、维生素C 等。

同时，该方法还可以用于测定植物中的总酚含量，用于评估植物的抗氧化能力和生物活性。

在使用Folin酚试剂法进行测定时，需要注意一些关键步骤。

首先，需要准备好Folin-Ciocalteu试剂溶液，并根据需要调整其浓度。

其次，需要准备待测物质的溶液，并确保其浓度在试剂检测范围内。

然后，将试剂和待测物质混合，充分反应一定时间。

最后，使用紫外可见光谱仪或分光光度计测量蓝色产物的吸光度，并根据标准曲线计算出物质浓度。

Folin酚试剂法的应用非常广泛。

在食品领域，该方法可以用于测定茶叶、咖啡、葡萄酒等中的多酚类化合物的含量，评估其抗氧化性能。

在药品领域，该方法可以用于测定药物中的还原性物质，如双酚A等。

在生物化学研究中，该方法可以用于测定细胞培养基中的抗氧化剂浓度，评估其对细胞的保护作用。

Folin酚试剂法是一种简便、灵敏且广泛应用的测定物质浓度的方法。

它通过与还原性化合物反应生成蓝色产物，并通过测量蓝色产物的吸光度间接测定物质浓度。

该方法在食品、药品、生物化学等领域都有重要的应用价值，为科学研究提供了有力的工具。

[目的]掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。

[原理]蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。

[操作]取试管7支、编号、按下表操作：立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。

用660nm比色，测定光密度值。

操作注意事项：1．按顺序添加试剂2．试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。

[计算](一)绘制标准曲线。

以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。

(二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。

(三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。

[器材](一)721型分光光度计(--)恒温水浴箱(三)中试管7支(四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。

[试剂](一)试剂甲(1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液(2)0.2N氢氧化钠溶液(3)1％硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合(25ml+25ml;0.5ml+0.5ml)，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。

该试剂只能用一天，过期失效。

(一)试剂乙：(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。

(2)或取Na2WoO42H2O l00g和Na2MOO3 25g。

溶于蒸馏水700ml中，再加85％H3PO4 50ml和HCl(浓)100ml，将上物混合后，置1000ml圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水数滴。

继续沸腾15分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸度为1N。

实验1-3 蛋白质的定量测定（Folin-酚试剂法）一、实验原理1921年，Folin 首创Folin-酚试剂法，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应；1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。

Folin-酚试剂法主要包括两步：第一步双缩脲反应在碱性溶液中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。

由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。

即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

第二步 Folin-酚显色反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。

由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显色反应。

即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。

另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋白质的含量。

二、实验材料（一）样品液的制取10g样品加入100mL蒸馏水进行匀浆，离心后取上清液备用（或者振荡浸渍30min滤液备用）（二）试剂1．牛血清白蛋白标准液（1mg/mL）准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到50mL。

2．碱性硫酸铜溶液(福林酚试剂A)①碱溶液：Na2CO32g 溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。

②硫酸铜溶液：CuSO4∙5H2O 0.5g溶于100ml 35mmol/L(1%)酒石酸钾钠中。

使用前将①与②按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液（福林酚试剂A）。

实验一Folin酚试剂法测定蛋白质含量「实验目的」掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的原理和操作方法。

「实验原理」Folin酚试剂法是利用了蛋白质的性质——显色反应来测定蛋白质含量，是很灵敏的方法之一。

该方法的原理是Folin酚试剂中的盐被蛋白质中还原物质还原，生成蓝色复合物，并且蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比。

需要注意的是加入酚试剂时，需要立即混匀溶液。

「实验步骤」1.取七支试管，按下表操作。

试剂0 1 2 3 4 5 6（待测）蛋白质标准液（250*g/ml）0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 0.00 待测蛋白质样品液0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 0.9%NaCl溶液 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0.00 碱性铜溶液 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 处理混匀后于室温（25℃）放置20min酚试剂0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 相当于蛋白质浓度（*g/ml）0.00 50 100 150 200 250 ？2.在室温下放置30min，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm处测定各管中溶液的吸光度值。

「实验结果」各管中溶液的吸光度值0 1 2 3 4 5 60.000 0.210 0.240 0.298 0.478 0.506 0.2170.000 0.236 0.262 0.344 0.477 0.500 0.203均值0.000 0.223 0.251 0.321 0.478 0.503 0.210。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。

需强调的地方请用蓝颜色标出。

不得出现多行、多页空白现象。

一、实验目的1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。

2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。

二、实验原理Folin-酚反应是利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。

为了提高该反应的敏感度，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应。

1、双缩脲反应：在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。

由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。

即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

2、Folin-酚显色反应：蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。

即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。

三、材料与方法：以流程图示意1、材料：①样品：健康人的血清（稀释300倍）②试剂：牛血清蛋白标准液（200μg/ml ）、碱性的硫酸铜溶液、蒸馏水、Folin-酚试剂③仪器及器材：V-1100型分光光度计、恒温水浴箱、试管6只、试管架、加样枪、加样枪架、加样枪头2① 取6支试管编号1~6，按下表依次加入试剂并混匀，室温放置10min 。

表格 1 Folin-酚试剂定量蛋白质实验步骤② 往6支试管中分别加入Folin-酚试剂0.20ml ，在2s 内立即混匀。