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第54讲基因工程的基本工具和基本操作程序课标内容(1)阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
(2)阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。
(3)DNA的粗提取与鉴定实验。
(4)利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一重组DNA技术的基本工具1.基因工程概述基因工程的理论基础2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是，根据图示分析回答下列问题：(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。
提示限制性内切核酸酶Ⅰ：限制性内切核酸酶Ⅱ：(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。
限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。
1.限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
基因工程的基本工具（A）［知识梳理］实现这一精确的操作过程至少需要三种工具即准确切割DNA的“手术刀”——限制性核酸内切酶、将DNA片段再连接起来的“缝合针”——DNA连接酶、将体外重组好的DNA导入受体细胞的“运输工具”——（运）载体（一）、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1、又称限制酶或（限制性内切酶）2、主要是从原核生物中分离纯化出来的是原核生物的防御机制) 3*、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，（大多数限制酶识别序列6个核苷酸组成）并在特定的切点（两个核苷酸之间的磷酸二酯键）上切割DNA分子（体现酶的专一性；注意与解旋酶的区别）4、切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——错位切：产生黏性末端。
平切：产生平口末端。
例：1）GAA TTC(写出)CTTAAG2) CCCGGGGGGCCC(二)DNA连接酶——“分子缝合针”1、两种来源不同的DNA用同种限制酶切割后，末端可以相互黏合，这种只能使互补的碱基连接起来，脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口（磷酸二酯键），需要靠DNA连接酶来“缝合”。
2、根据酶的来源不同，可以将这些分为两类：一类：从大肠杆菌中分离得到的，称为E·coliDNA连接酶；只能将双链DNA另一类；从T4噬菌体中分离出来的，称T4DNA连接酶；既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”平末端，但连接平末端之间的效率比较低。
（三）基因进入受体细胞的（运）载体——“分子运输车”1、通常利用质粒，质粒存在于许多细菌以及酶母菌等生物中。
质粒是独立于细菌（细胞）染色体外（即拟核DNA）之外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
质粒上有决定固氮、抗药性、抗生素生成的基因（可作为标记基因）。
2、作为运载体的特点：1）、有一个到多个限制酶的切割位点；(供外源DNA片段(基因)插入其中)2）、能进行自我复制；(在细胞中自称复制，或整合到染色体DNA上，随染色体进行同步复制)。
第1节重组DNA技术的基本工具学案设计(一)学习目标1.掌握基因工程操作的三种工具(限制酶、DNA 连接酶、载体)。
2.能够准确说出每一种操作工具的特点及用途。
自主预习一、基因工程的概念1.操作场所:生物体外。
2.操作技术:等技术。
3.操作结果:赋予生物新的,创造出更符合人们需要的新的和。
4.操作水平:水平。
二、重组DNA技术的基本工具1.限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”(1)来源:主要来自。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的特定,并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开。
(3)大多数限制酶的识别序列由个核苷酸组成,切割的结果是产生末端。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”(1)作用:将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的。
(2)3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)常用载体:,它是一种裸露的、结构简单、独立于之外,具有能力的分子。
(2)质粒适于用作基因载体的特点Ⅰ.质粒分子上有一个至多个位点,供外源DNA片段插入其中。
Ⅱ.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后,能在细胞中进行,或上,随受体DNA同步复制。
Ⅲ.质粒上常有特殊的,便于的筛选。
(3)基因工程中使用的载体除质粒外,还有等。
课堂探究课堂探究一:1.已知限制酶Eco R Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G ↓AATTC 和CCC ↓GGG,在图中写出两种限制酶切割DNA 后产生的末端并写出末端的种类。
Eco R Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列 (填“相同”或“不同”),切割位点(填“相同”或“不同”),说明限制酶具有 性。
2.为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来?推测它在原核生物中的作用是什么?它会不会切割自己的DNA 分子?课堂探究二:1.3.限制性内切核酸酶和DNA 连接酶的作用是否都体现了酶的专一性?课堂探究三:细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同?核心素养专练1.下列有关基因工程的叙述,错误的是()A.基因工程产生的变异属于基因突变B.最常用的载体是质粒C.工具酶主要有限制性内切核酸酶和DNA连接酶D.该技术人为地增加了生物变异的范围,实现了物种间遗传物质的交换2.在基因工程操作过程中,DNA连接酶的作用是()A.将任意两个DNA片段连接起来B.将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来,包括DNA片段和碱基对之间的氢键C.连接具有相同黏性末端或平末端的DNA片段,即形成磷酸二酯键D.只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键3.下列有关质粒的叙述,正确的是()A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B.质粒是真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,能自我复制的环状双链DNA分子C.质粒只有在侵入宿主细胞后,才能在宿主细胞内复制D.基因工程中常用的载体除了质粒外,还有核DNA、动植物病毒以及噬菌体4.如图所示为限制酶Bam HⅠ、Eco RⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的识别序列,箭头表示每一种限制酶的特定切割位点,切割出来的DNA片段末端可以互补黏合的限制酶及其正确的末端互补序列为()A.Bam HⅠ和Eco RⅠ;末端互补序列为—AATT—B.Bam HⅠ和HindⅢ;末端互补序列为—GATC—C.Eco RⅠ和HindⅢ;末端互补序列为—AATT—D.Bam HⅠ和BglⅡ;末端互补序列为—GATC—5.关于下图所示黏性末端的叙述,正确的是()①②③④A.①与③是由相同限制酶切割产生的B.DNA连接酶可催化①与③的连接C.经酶切形成④需要脱去2分子水D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端6.下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述,正确的是()A.用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口,有2个磷酸二酯键被断开B.限制酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大C.序列—CATG↓—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同D.T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接7.某细菌质粒上有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。
第1课时基因工程的操作工具第1课时基因工程的操作工具课程一.1 DNA重组技术的基本工具【课前导学】1.1 DNA重组技术的基本工具一、基因工程的原理：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外赋予生物新的基因特征，创造更符合人们需求的新生物类型和生物产品。
因为基因工程是在水平水平上设计和建造的，所以也被称为基因工程。
二、限制性核酸内切酶1.切割DNA的工具是，也称为。
2、这类酶在生物体内能将外来的dna切断，即能够限制异源dna的侵入并使之失去活力，但对自己的dna却无损害作用，这样可以保持细胞原有的遗传信息。
3.由于这种切割是在DNA分子内进行的，因此被称为限制性内切酶（简称限制性内切酶）。
4.DNA分子的限制性内切酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即和。
三、dna连接酶――“分子缝合针”根据DNA连接酶的不同来源，它们可分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为e?colidna连接酶。
e?colidna连接酶只能将连接起来，不能将双链dna片段平末端之间进行连接。
另一种是从T4 DNA连接酶中分离出来的。
T4 DNA连接酶可以“缝合”互补和双链DNA片段，但连接效率相对较低。
四、基因进入受体细胞的载体――“分子运输车”1.在基因操作过程中，载体有两个用途：一是作为载体将目标基因转移到宿主细胞；第二种是利用它在宿主细胞中复制大量目标基因。
2、现在通常使用的载体是，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核dna之外的环状dna，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个。
3.质粒可以通过细菌之间的连接从一种细菌转移到另一种细菌，这种连接可以复制或整合到细菌假核DNA中，并通过假核DNA的复制进行复制。
4、其他载体还有和等。
5、作为载体必须具备以下条件：能在宿主细胞中复制并稳定保存；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；它有一些用于筛选的标记基因，如抗生素耐药基因、产品颜色反应基因等[摘要]归纳点1基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果归纳点2基因工程的工具及其比较基因剪接技术或DNA重组技术→ 拼接→ 介绍→ 在生物体外的基因DNA分子水平上表达人类所需的基因产物1。
闪堕市安歇阳光实验学校考点2 基因工程的操作工具及基本步骤(5年34考)(2013新课标卷Ⅰ、Ⅱ，广东卷、浙江卷、福建卷、天津卷、山东卷，2012新课标卷、浙江卷、福建卷……)一、概念又叫基因拼接技术或DNA重组技术。
通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
二、操作工具1．基因的“剪刀”——限制性核酸内切酶(简称限制酶)(1)分布：主要在微生物体内。
(2)特性：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。
(3)实例：Eco R Ⅰ限制酶能专一识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。
(4)切割结果：产生两个带有黏性末端的DNA片段。
(5)作用：基因工程中重要的切割工具。
在微生物体内能将外来的DNA切断，对自己的DNA无损害。
2．基因的“针线”——DNA连接酶(1)催化对象：两个具有相同黏性末端的DNA片段。
(2)催化位置：脱氧核糖与磷酸之间的缺口。
(3)催化结果：形成重组DNA。
3．常用的运载体——质粒(1)本质：小型环状DNA分子(2)作用⎩⎪⎨⎪⎧①作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去②用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制(3)条件⎩⎪⎨⎪⎧①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制②有多个限制酶切点③有标记基因三、操作步骤提取目的基因错误!↓目的基因与运载体结合⎩⎪⎨⎪⎧用一定的限制酶切割质粒用同一种限制酶切割目的基因加入DNA连接酶质粒和目的基因结合成重组DNA分子↓将目的基因导入受体细胞：主要是借鉴细菌或病毒侵染细 胞的方法 ↓目的基因的检测与鉴定⎩⎪⎨⎪⎧检测：根据受体细胞中是否具有标记基因，判断目的基因导入与否鉴定：受体细胞是否表现目的基因控制的性 状，如棉花抗虫性状的表现特别提醒 (1)微生物常被用做受体细胞的原因是其具有繁殖快、代谢快、目的基因产物多的特点。
实验方法总结（1）：基因操作工具1、基因A（GeneA）的敲减载体构建 (1)2、GeneA过表达载体构建 (1)3、GeneA点突变载体构建 (2)4、GeneA敲除载体构建（CRISPR/Cas9法） (2)5、GeneA敲除载体构建（TALENs 法） (2)6、GeneA的miRNA载体表达构建 (3)1、基因A（GeneA）的敲减载体构建版本1：针对GeneA，在Sigma网站上搜索已验证过敲减效率的shRNA序列，合成后两端加上酶切位点，合成双链DNA oligo，成为含干扰序列的具对应粘性末端的shRNA表达框架。
以EcorI和BamHI内切酶酶切pEGFP载体以使其线性化，形成不对称的粘性末端。
将shRNA表达框架插入pGP，转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行PCR鉴定与测序，构建含有针对GeneA的shRNA骨架质粒。
版本2：从Genebank调取人GeneA核苷酸序列，利用Ambion数据库软件设计针对GeneA的有效的shRNA序列，经Blast 比对进行同源性分析后，选出特异性较高的3 组分别命名，以可以被任意替换的茎干发夹结构作为阴性对照。
取pEGFP shRNA载体15μL 于EP 管，用BamHI 1.5μL 与EcoRII 1.5μL、10×buffer 5μL 酶切反应4 h 以上；产物回收加入T4 DNA Ligase 使GeneA shRNA 片段与目的载体连接，连接产物加入至DH5α感受态细胞中转化；用高纯质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，同时挑取阳性克隆行PCR 鉴定、DNA 测序。
2、GeneA过表达载体构建从Pubmed Nucleotide数据库中检索针对目的基因的CDS序列，将序列导入DNAMAN软件中，进行酶切位点分析；在该序列中不包含的酶切位点中，选择克隆载体上多克隆位点中有的两个限制性内切酶——EcoRI和SacII。
引物直接在GeneA CDS编码区起始和末端设计，然后在引物的5’端加上相应的酶切位点。
高考生物-基因工程的含义及操作工具1.基因工程的诞生(1)概念：基因工程是狭义的遗传工程。
广义的遗传工程泛指把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。
(2)核心：构建重组DNA分子，早期也将基因工程称为重组DNA技术。
(3)诞生时间：20世纪70年代。
(4)理论基础：DNA 是生物遗传物质的发现，DNA双螺旋结构的确立以及遗传信息传递方式的认定。
(5)技术保障：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒载体的发现和运用。
2.基因工程的基本工具归纳总结与DNA有关的酶的比较(1)限制性核酸内切酶只能用于切割目的基因( F )(2)DNA 连接酶能将两碱基间通过形成的氢键连接起来( F )(3)质粒是小型环状DNA 分子，是基因工程常用的载体( T )(4)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达( T )(5)DNA 连接酶能够将任意2个DNA 片段连接在一起( F )1．下列关于基因工程的叙述，不正确的是( D )A ．基因工程的原理是基因重组B ．运用基因工程技术，可使生物发生定向变异C ．一种生物的基因转接到另一种生物的DNA 分子上，属于基因工程的内容D ．是非同源染色体上非等位基因的自由组合2．以下有关基因工程的叙述，正确的是( D )A ．基因工程是细胞水平上的生物工程B ．基因工程的目的是获得目的基因表达的蛋白质产物C ．基因工程产生的变异属于人工诱变。
人工诱变—基因突变D ．基因工程育种的优点之一是可以定向地使生物产生可遗传的变异3、不属于质粒被选为基因运载体的理由是 ( D )A ．能复制B ．有多个限制酶切点C ．具有标记基因D ．它是环状DNA4．质粒之所以能做基因工程的载体，是由于它( D )A ．含蛋白质，从而能完成生命活动B ．能够自我复制，从而保持连续性C ．是RNA ，能够指导蛋白质的合成D ．具有环状结构，能够携带目的基因5．限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA 分子上特定的核苷酸序列。
