考点一 基因工程的概念及操作工具(5年13考)(2015天津、福建、重庆、浙江、江苏；2014新课标、天津、北京、山东、江苏、海南；2013全国大纲卷、广东……)一、基因工程的概念二、DNA 1．限制性核酸内切酶(简称：限制酶)⎩⎪⎨⎪⎧来源：主要从原核生物中分离作用：割断两个核苷酸之间的磷酸二酯键作用特点：专一性，即限制酶可识别特定的核苷酸序列结果⎩⎨⎧ 错位切：产生两个相同的黏性末端平切：形成平末端2．DNA 连接酶都缝合磷酸二酯键，如图3.载体(1)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
(2)质粒的特点⎩⎪⎨⎪⎧能自我复制有一个至多个限制酶切割位点有特殊的标记基因1．下图为限制酶和DNA 连接酶的关系，据图回答：(1)限制酶和DNA 连接酶的作用部位相同吗？相同。
(2)DNA 连接酶起作用时是否需要模板？不需要。
2．探究载体所具条件的意义基因工程操作工具的综合考查导学号67241264(经典高考题)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶切割DNA 分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoR Ⅰ切割后产生的片段如下：AATT C ……GG ……CTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA 除可用EcoR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是______________________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA 连接酶有两类，即________DNA 连接酶和________DNA 连接酶。
(4)反转录作用的模板是________，产物是_____________________________________。
若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
(5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是____________________________________________________________________。
1．限制酶、DNA 连接酶、DNA 聚合酶等相关酶的分析比较(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
1.导学号导学号67241265如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A．①②③④B．①②④③C．①④②③D．①④③②2.导学号67241266若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GA TCT)、EcoRⅠ(G↓AA TTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。
下列分析合理的是()A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体3.导学号67241267已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120kb(kb：千碱基对)片段；用限制酶Ⅱ切割得到40kb和80kb两个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10kb、80kb和30kb3个片段。
据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为()4.导学号6724121268下列关于载体的叙述中，错误的是()A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割考点二基因工程的基本操作程序及应用(5年24考) (2015新课标Ⅰ、福建、天津、四川、海南、江苏；2014新课标、天津、广东、重庆、北京、山东、江苏、海南；2013新课标Ⅰ、福建……)1．操作步骤：获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
2．应用1．观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序(1)获取目的基因—⎩⎪⎨⎪⎧①从基因文库中获取②利用PCR 技术扩增③通过化学方法人工合成↓(2)基因表达载体的构建—组成⎩⎪⎨⎪⎧①目的基因②启动子③终止子④标记基因↓(3)将目的基因导入受体细胞—方法⎩⎪⎨⎪⎧①植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法②动物：显微注射技术③微生物：感受态细胞法↓(4)目的基因的检测与鉴定⎩⎪⎪⎨⎪⎪⎧①利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无②利用分子杂交技术检测目的基因的转录③利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译④利用个体生物学水平的鉴定检测重组性状的表达2．目的基因的检测和鉴定3．探究基因治疗与基因诊断的不同点基因工程的操作程序的考查导学号67241269(2015·四川卷)将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有T-DNA片段能转移到植物细胞中)。
(1)过程①需用同种____________酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。
为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用________培养基。
(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让________进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是________________________________________________________________________。
(3)若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加________以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是_________________________________________。
(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是____________。
种植转基因抗虫棉能减少________的使用，以减轻环境污染。
1.导学号67241270下图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。
据图分析，下列叙述正确的是()A．过程①需要DNA连接酶B．过程②需要限制性核酸内切酶C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同2.导学号67241271下列用于判断目的基因是否转移成功的方法中，不属于分子检测的是()A．通过害虫吃棉叶看其是否死亡B．转基因生物基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带C．转基因生物中提取的mRNA与DNA探针能否形成杂交带D．转基因生物中提取的蛋白质能否与抗体形成杂交带3.导学号67241272(2014·天津卷)为达到相应目的，必须通过分子检测的是()A．携带链霉素抗性基因受体菌的筛选B．产生抗人白细胞介素-8抗体的杂交瘤细胞的筛选C．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定D．21三体综合征的诊断4.导学号67241273(2015·福建卷)GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。
研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。
请回答：(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是__________________。
(2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的________限制酶进行酶切。
(3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。
为鉴定这3种连接方式，选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。
图中第________泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。
(4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的________与提取的蛋白质杂交。
当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行________培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
考点三蛋白质工程、转基因技术的安全性及生物武器(5年6考) (2015新课标Ⅱ、海南；2014重庆；2013广东、江苏……)1．概念理解从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
3．转基因技术的安全性(1)安全性问题①食物安全：滞后效应、过敏原、营养成分改变等。
②生物安全：对生物多样性的影响等。
③环境安全：对生态系统稳定性的影响等。
(2)理性看待转基因技术①需要正确的社会舆论导向：趋利避害，不能因噎废食。
②制定政策和法规，最大程度保证转基因技术和产品的安全性。
4．生物武器(1)生物武器的种类(连线)(2)生物武器的特点①致病力强、传染性大，②污染面广、危害时间长，③难以防治，④具有一定的潜伏期，⑤受自然条件影响大。
探究蛋白质工程与基因工程的区别和联系蛋白质工程的考查导学号67241274(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。
如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氮酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有酶的催化活性。
回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。
所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________________________________________。
