第二章 分光光度技术
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第三节 分光光度分析技术有色溶液对光线有选择性的吸收作用,不同物质由于其分子结构不同,对不同波长光线的吸收能力也不同。
因此,每种物质都具有其特异的吸收光谱。
有些无色溶液,虽对可见光无吸收作用,但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。
分光光度技术(分光光度法) 主要是指利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术,其理论依据是Lambert 和Beer 定律。
分光光度法是比色法的发展,比色法只限于在可见光区,分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。
比色法用的单色光通过滤光片产生,谱带宽度为40-120nm ,精度不高,而分光光度法则要求近于真正单色光,其光谱带宽最大不超过3-5nm ,在紫外光区可到1nm 以下。
单色光通过棱镜或光栅产生,具有较高的精度。
一、基本原理分光分析法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度,其理论依据是Lambert 和Beer 定律。
1、Lambert 定律:一束单色光在通过一溶液时,由于溶液吸收一部分光能,使光的强度减弱,若溶液的浓度不变,则溶液的厚度愈大,光线强度的减弱也愈显著。
2、Beer 定律:当一束单色光通过一溶液时,若溶液的厚度不变,则溶液浓度愈高,光线强度的减弱也愈显著。
3、Lambert--Beer 定律及其应用kcl I I -=0lg如果将通过溶液后的光线强度(I)和入射光(I0)的比值称为透光度(T),将0lg I I-用光密度(OD 或D)表示该溶液对光线吸收的情况(有的也用吸光度A 表示);则它们之间的关系如下:kcl T I I OD =-=-=lg lg 0其中:k 为常数,称为消光系数(E),表示物质对光线吸收的本领,其值因物质种类和光线波长而异。
OD(或A)=ECL (1)从公式(1)可知,对于相同物质和相同波长的单色光(消光系数不变)来说,溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。
22112121C OD OD C C C OD OD ⨯=⇔= (2)如果C2为标准溶液的浓度,则可根据测得的光密度值,按公式(2)求得待测溶液的浓度。
第二节分光光度法(一)基础知识分类号:P2-O一、填空题1.分光光度法测定样品的基本原理是利用朗伯—比尔定律,根据不同浓度样品溶液对光信号具有不同的,对待测组分进行定量测定。
答案:吸光度(或吸光性,或吸收)2.应用分光光度法测定样品时,校正波长是为了检验波长刻度与实际波长的,并通过适当方法进行修正,以消除因波长刻度的误差引起的光度测定误差。
答案:符合程度3.分光光度法测定样品时,比色皿表面不清洁是造成测量误差的常见原因之一,每当测定有色溶液后,一定要充分洗涤。
可用涮洗,或用浸泡。
注意浸泡时间不宜过长,以防比色皿脱胶损坏。
答案:相应的溶剂(1+3)HNO3二、判断题1.分光光度计可根据使用的波长范围、光路的构造、单色器的结构、扫描的机构分为不同类型的光度计。
( )答案:正确2.应用分光光度法进行试样测定时,由于不同浓度下的测定误差不同,因此选择最适宜的测定浓度可减少测定误差。
一般来说,透光度在20%~65%或吸光值在0.2~0.7之间时,测定误差相对较小。
( )答案:正确3.分光光度法主要应用于测定样品中的常量组分含量。
( )答案:错误正确答案为:分光光度法主要应用于测定样品中的微量组分。
4.应用分光光度法进行样品测定时,同一组比色皿之间的差值应小于测定误差。
( ) 答案:错误正确答案为:测定同一溶液时,同组比色皿之间吸光度相差应小于0.005,否则需进行校正。
5.应用分光光度法进行样品测定时,摩尔吸光系数随比色皿厚度的变化而变化。
( ) 答案:错误正确答案为:摩尔吸光系数与比色皿厚度无关。
三、选择题1.利用分光光度法测定样品时,下列因素中不是产生偏离朗伯—比尔定律的主要原因。
( )A.所用试剂的纯度不够的影响B.非吸收光的影响C.非单色光的影响D.被测组分发生解离、缔合等化学因素答案:A2.分光光度计波长准确度是指单色光最大强度的波长值与波长指示值。
( )A.之和B.之差C.乘积答案:B3.分光光度计吸光度的准确性是反映仪器性能的重要指标,一般常用标准溶液进行吸光度校正。
分光光度技术一.概念分光光度法(Spectrophotography),又称为比色法,它是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。
有色溶液对光线有选择性的吸收作用,不同物质由于其分子结构不同,对不同波长的光的吸收能力不同,因此,每种物质都具有其特异的吸收光谱。
比色法只限于可见光区,分光光度法可扩展到紫外光区和红外光区。
使用的光谱范围200-1000nm紫外光区:200-400nm可见光区:400-760nm红外光区:760-1000nm二.基本原理物质的吸收光谱与它们的本身的分子结构有关,不同物质由于其分子结构不同,对不同波长光线的吸收能力也不同。
每种物质都具有特定的吸收光谱,在一定条件下,其吸收程度与该物质浓度成正比,因此可利用各种物质不同的吸收光谱及其强度,对不同物质进行定性和定量分析。
分光光度法根据的原理是Lambert-Beer定律,该定律阐明了溶液对单色光吸收程度与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。
1. 朗伯(Lambert)定律:当单色光通过一吸收光的介质时,其光强度随吸收光介质的厚度增加而成指数减少,即I / I0 = e-K1LI0:入射光强度,I:出射光强度,L:介质的厚度e: 自然对数的底,即2.718 K1: 溶液的吸光率ln(I0/I)= K1l换算成常用对数式,即log(I0/I)= 0.4343·K1l令K = 0.4343·K1则log(I0/I)= Kl此处以K为吸光率也就是说:在溶液浓度不变时,溶液对光的吸收随溶液厚度的增大而增大。
2. 比尔(Beer)定律:单色光通过一光吸收介质时,光强度随介质浓度增长而成指数减少,即I / I0 = e-K2LC:溶液浓度log(I0/I)= KC也就是说:溶液厚度不变时,溶液对光的吸收随溶液浓度的增大而增大。
3. Lambert-Beer定律如果同时考虑吸收溶液的浓度和厚度对光吸收的影响,将以上两式结合,则得出log(I0/I)= KCl令T =(I/I0) A = log(I0/I)则A = KCl=-—logTA为吸光度,T为透光度K(L·mol-1·cm-1)是一常数,即削光系数,也叫摩尔吸光度;三.计算1.标准管法(标准比较法)用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色,读出吸光度,在根据公式计算。
第二章 紫外-可见分光光度法一、选择题1 物质的紫外 – 可见吸收光谱的产生是由于 ( B )A. 原子核内层电子的跃迁B. 原子核外层电子的跃迁C. 分子的振动D. 分子的转动2 紫外–可见吸收光谱主要决定于 ( C )A. 原子核外层电子能级间的跃迁B. 分子的振动、转动能级的跃迁C. 分子的电子结构D. 原子的电子结构3 分子运动包括有电子相对原子核的运动(E 电子)、核间相对位移的振动(E 振动)和转动(E 转动)这三种运动的能量大小顺序为 ( A )A. E 电子>E 振动>E 转动B. E 电子>E 转动>E 振动C. E 转动>E 电子>E 振动D. E 振动>E 转动>E 电子4 符合朗伯-比尔定律的一有色溶液,当有色物质的浓度增加时,最大吸收波长和吸光度分别是 ( C )A. 增加、不变B. 减少、不变C. 不变、增加D. 不变、减少5 吸光度与透射比的关系是 ( B ) A. T A 1=B. TA 1lg = C. A = lg T D. A T 1lg = 6 一有色溶液符合比尔定律,当浓度为c 时,透射比为T 0,若浓度增大一倍时,透光率的对数为 ( D )A. 2T OB. 021TC. 0lg 21T D. 2lg T 07 相同质量的Fe 3+和Cd 2+ 各用一种显色剂在相同体积溶液中显色,用分光光度法测定,前者用2cm 比色皿,后者用1cm 比色皿,测得的吸光度值相同,则两者配合物的摩尔吸光系数为 ( C )已知:A r(Fe) = 55.85,A r(Cd) =112.4A. Cd Fe 2εε≈B. e d F C 2εε≈C. e d F C 4εε≈D. Cd Fe 4εε≈8 用实验方法测定某金属配合物的摩尔吸收系数ε,测定值的大小决定于 ( C )A. 入射光强度B. 比色皿厚度C. 配合物的稳定性D. 配合物的浓度9 以下说法正确的是 ( A )A. 吸光度A 随浓度增大而增大B. 摩尔吸光系数ε随浓度增大而增大C. 透光率T 随浓度增大而增大D. 透光率T 随比色皿加厚而增大10 下列表述中的错误是 ( A )A. 比色法又称分光光度法B. 透射光与吸收光互为补色光,黄色和蓝色互为补色光C. 公式bc II A ε==0lg 中,ε称为摩尔吸光系数,其数值愈大,反应愈灵敏 D. 吸收峰随浓度增加而增大,但最大吸收波长不变11 吸光光度分析中比较适宜的吸光度范围是 ( C )A. 0.1~0.5B. 0.1~1.2C. 0.2~0.8D. 0.2~1.512 若显色剂无色,而被测溶液中存在其它有色离子干扰,在分光光度法分析中,应采用的参比溶液是 ( D )A. 蒸馏水B. 显色剂C. 试剂空白溶液D. 不加显色剂的被测溶液13 采用差示吸光光度法测定高含量组分时,选用的参比溶液的浓度c s 与待测溶液浓度c x 的关系是 ( D )A. c s =0B. c s = c xC. c s > c xD. c s 稍低于c x14 桑德尔灵敏度S 与摩尔吸光系数ε的关系是 ( A ) A. εMS = B. 610⨯=εM S C. ε610⨯=M S D. M S ε= 15下列因素对朗伯-比尔定律不产生偏差的是 ( A )A. 改变吸收光程长度B. 溶质的离解作用C. 溶液的折射指数增加D. 杂散光进入检测器二、填空题1吸光光度法进行定量分析的依据是__朗伯-比耳定律,用公式表示为___A= εbc,式中各项符号各表示:A为吸光度,b为吸收介质厚度,ε为摩尔吸光系数,c为吸光物质的浓度。
分光光度技术基本原理利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱,利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法,称为分光光度法或分光光度技术,使用的仪器称为分光光度计,这种分光光度计灵敏度高,测定速度快,应用范围广,其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
因此本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。
1. 光谱:光是电磁波,可用波长“λ”表示,电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成,对于生物化学来说,最重要的波长区域是可见光和紫外光。
光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。
光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。
λ=C/νλ——波长C——光速ν——频率,单位时间通过一个定点的波数。
光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。
这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出:E=h·νH——普朗克常数( 6.624×10-27尔格·秒)ν——频率紫外区可分为紫外(近紫外)和真空紫外(远紫外)。
由于吸收池(又称样品池、比色杯等)和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光,因此常规紫外测定集中在近紫外区,即200nm~400nm。
可见光区为400nm~800nm。
组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着,分子的运动可分为平动、转动、振动和分子内电子的运动,每种运动状态都处于一定的能级,因此分子的能量可以写成:E=E0+E平+E转+E振+E电E0是分子内在的不随分子运动而改变的能量,平动能E平只是温度的函数,因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。
分子的每一种能量都有一系列的能级,能级不是任意的,而是具有量子化特征的,通常分子处于基态,当它吸收一定能量跃迁到激发态,则产生吸收光谱。
分子转动、振动和电子能级的跃迁,相应地产生转动、振动及电子光谱。
按照量子力学原理,分子能态按一定的规律跳跃式地变化,物质在入射光的照射下,分子吸收光时,其能量的增加是不连续的,物质只能吸收一定能量的光,吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系:E=E2- E1=hE1、E2分别表示初能态和终能态的能量,初能态与终能态之间的能量差愈大,则所吸收的光的频率愈高(即波长愈短),反之则所吸收的光的频率愈低(即波长愈长)。