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《牛精原干细胞分离纯化及长期培养研究》篇一一、引言随着干细胞研究领域的发展，特别是精原干细胞的深入探讨，牛精原干细胞因其在畜牧业、医药研发等领域具有广泛的应用潜力而受到重视。
精原干细胞具备自我更新能力和多向分化潜能，可被用于研究雄性生殖系统的发育机制，并有望在再生医学中发挥重要作用。
本文将就牛精原干细胞的分离纯化及长期培养进行详细的研究与探讨。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的牛精原干细胞取自健康成年公牛的睾丸组织。
实验过程中使用的试剂和耗材均需符合无菌、无热原等要求。
2. 方法（1）干细胞分离纯化：采用酶消化法对睾丸组织进行消化处理，获取单细胞悬液，通过密度梯度离心法及流式细胞仪等方法进行干细胞的分离纯化。
（2）长期培养：将纯化后的干细胞接种于特定培养基中，进行长期培养，观察其生长情况及分化能力。
三、实验结果1. 干细胞分离纯化通过酶消化法处理睾丸组织，获取的单细胞悬液中包含多种细胞类型。
经过密度梯度离心及流式细胞仪的分离纯化，成功获得较高纯度的牛精原干细胞。
2. 长期培养将纯化后的牛精原干细胞接种于特定培养基中，通过显微镜观察，干细胞在培养基中呈现良好的生长状态，具有较高的增殖能力。
经过一定时间的培养，干细胞仍保持其多向分化的潜能。
四、讨论本实验研究了牛精原干细胞的分离纯化及长期培养，实验结果表明，通过酶消化法、密度梯度离心及流式细胞仪等方法，可成功获取较高纯度的牛精原干细胞。
在特定培养基中，干细胞呈现良好的生长状态，具有较高的增殖能力及多向分化潜能。
这为进一步研究牛精原干细胞的生物学特性、功能及其在再生医学中的应用提供了有力支持。
在实验过程中，我们还需要注意以下几点：首先，实验所使用的试剂和耗材需符合无菌、无热原等要求，以确保实验结果的准确性；其次，流式细胞仪等仪器的操作需严格按照规范进行，以确保干细胞的分离纯化效果；最后，在长期培养过程中，需定期观察干细胞的生长状态及分化能力，以评估其生物学特性和应用潜力。
试论牛卵母细胞体外受精技术牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下，人为创造母牛体内繁殖条件，在牛体外完成精卵结合，培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段，将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。
体外受精是繁育犊牛的重要技术，在牛繁殖领域应用普遍，涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断，牛精子的筛选、获能，以及具体的受精操作等。
针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究，最终达到获取高质量胚胎的目的，助力于养牛业的高质量发展。
1 牛卵母细胞体外采集与培养技术1.1 牛卵母细胞体外采集技术1.1.1 采集方式常用的动物卵母细胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母细胞，采用超排技术从动物的输卵管采集，但不适用于牛这种大型动物；（2）活体采卵，选择繁殖性能优秀的母牛，借助腹腔镜直接采集，对采集母牛的繁殖性能影响较小；（3）从屠宰场获取，宰杀母牛后直接采集牛卵巢。
该采集方式简单、直接、成本低，可大批量采集。
1.1.2 采集技术在从屠宰场获取牛卵巢后，将其放入保温瓶中，瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素，温度大约是30 ℃，用于保持牛卵巢的新鲜度。
在1 h 内完成卵泡的收集，在实验室环境下，使用生理盐水清洗干净牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，获取卵泡液，准备进行体外成熟培养。
1.2 体外成熟培养使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养，将筛选出的卵母细胞放入培养液中，培养液中含有17-E2 的中央记忆型T 细胞1.5 μg/mL；胎牛血清10%，促黄体生成素20%；卵泡刺激素20 μg/mL。
将培养液放入经过温度校正后的培养箱中，温度调整至38～39 ℃，气象条件为5%的CO2，培养时间22～24 h，需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况，适当延长1～2 h，但不可超过26 h，一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。
1.3 体外成熟判定在培养24 h 后进行牛卵母细胞的成熟检查，当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。
性别控制技术的研究与应用进展蔡健锋1，潘淳烨1，黎文聪1，陈慧芳1，张献伟2，白银山1*（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231；2.温氏食品集团股份有限公司，广东新兴 527439）摘 要：性别控制指通过人为干预使动物的繁育按照人们所希望的性别繁殖后代的技术。
随着畜牧业生产智能化的迅速发展，高效准确的性别调控技术成为提高畜禽生产经济效益的重要研究方向。
本文主要综述了性别分化调控、性别反转和X、Y精子分离技术，以期促进畜牧业养殖性别控制技术的发展和应用。
关键词：性别控制；性别分化；性别反转；X、Y精子分离中图分类号：S814 文献标识码：A DOI编号：10.19556/j.0258-7033.20200512-09性别控制是使动物按照人们所希望的性别繁殖后代的技术[1-2]。
随着畜牧业智能化的发展，人类对特定性别的畜禽需求显著增大，因此性别控制技术在畜禽繁殖中有重要的研究价值。
根据X、Y精子DNA含量的差异，运用流式细胞技术可以有效分离X、Y精子[3-5]。
在奶牛繁育中，运用流式细胞仪分选X、Y精子进行性别控制，获得的母犊率超过90%，且成活率、体重等与自然交配后代无显著差异，极大地提高了经济效益[6]。
研究显示，通过调控X、Y精子活力的分离方法以及根据X、Y精子蛋白特异性表达通过免疫学技术分离X、Y精子的方法，都能获得较好效果[7-8]。
这些技术是在配子水平上进行性别控制，不影响基因表达和生殖发育，但目前研究并不完善。
性别差异使畜禽肉品质存在显著不同，根据性别分化规律人为干预性别分化基因的表达，可实现畜禽性别反转，促进肉品质改善，这将成为畜禽生产中有应用前景的技术[9-10]。
通过基因编辑技术使性连锁基因缺失也能改变后代性别的比例[11-12]，表明通过改变基因表达获得特定性别后代的可行性。
本文综述了性别决定基因调控分子机制，探讨了性别反转技术机制及应用前景，汇总了最新的X、Y精子分离技术的方法并分析其优缺点，以促进性别控制技术的应用和推广。
牛精原干细胞研究进展王春伟;扶晓波;吕妍;赵军;郭秋萍;张卫艺;胡建宏【摘要】精原干细胞(SSCs)是雄性生殖系干细胞,位于睾丸曲细精管基底膜上,具有自我更新和定向分化的潜能,是自然状态下出生后动物体内在整个生命过程中进行自我更新并能将基因传递至子代的惟一成体干细胞.本文在阐述精原干细胞发生的基础上,通过分析犊牛精原干细胞分离纯化、培养鉴定、冷冻保存和诱导分化的现状,分析了牛精原干细胞研究领域目前存在的主要问题,展望了牛精原干细胞的应用前景,以期为精原干细胞的研究提供参考.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2013(034)010【总页数】4页(P6-9)【关键词】牛;精原干细胞;研究进展;存在问题;发展前景【作者】王春伟;扶晓波;吕妍;赵军;郭秋萍;张卫艺;胡建宏【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S811.6精子发生是雄性动物终身产生大量精子的一个过程，其特点是由二倍体生殖细胞(精原干细胞)的单向分化，通过减数分裂形成精母细胞，最后产生单倍体配子精子[1]。
精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是哺乳动物出生后唯一能进行自我更新并将遗传信息传递给后代的具有像胚胎干细胞一样增殖和分化潜能的干细胞[2]。
精原干细胞的建立，不仅提供了一种新的工具来分析精子发生或干细胞的自我更新，同时也开辟了干细胞实际应用的新领域。
本文通过分析牛精原干细胞分离纯化、培养鉴定、冷冻保存和诱导分化的研究现状，指出目前存在的主要问题，并展望其应用前景，以期为精原干细胞的研究提供借鉴。
黄芩苷和黄芩素的生物学功能及其在动物生产中的应用代重山;汤树生;张青杰;李道稳;肖希龙【摘要】黄芩苷及黄芩素是中草药黄芩发挥功效的主要活性成分。
本文归纳总结了黄芩苷及黄芩素的抗氧化、抗炎、抗微生物及免疫调节等生物学功能，以期为其更好地应用于动物生产提供一定理论依据。
%Baicalin and baicalein are major effective flavones in the root of Scutellaria baicalensis Georgi.This article summarized the biological functions of baicalin and baicalein,including the anti-oxidation,anti-inflammatory,anti-micro-bial activity and immunomodulatory to take reference for its further applications in animal production.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2015(000)008【总页数】5页(P11-14,18)【关键词】黄芩苷;黄芩素;生物学功能;动物生产【作者】代重山;汤树生;张青杰;李道稳;肖希龙【作者单位】中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193;中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193;中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193;中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193;中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193【正文语种】中文【中图分类】S816.7黄芩属唇形科黄芩属多年生草本植物，黄芩苷和黄芩素是其主要活性成分。
研究表明，黄芩苷口服不易吸收，需在肠道经酶水解为黄芩素后方可吸收入血，黄芩素进入动物体内后，在血液中迅速转化为黄芩苷及其他代谢物，二者往往同时存在、相互转化，并具有多种生物学功能（辛文妤等，2013）。
睾丸细胞的生物学特征及研究进展周文钧摘要：睾丸形态与功能的维持主要依靠生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞发挥作用。
生精细胞、支持细胞功能的正常是精子发生的基础，管周肌样细胞的收缩促使精子排出至睾丸网，间质细胞是睾酮的主要来源。
目前，睾丸细胞研究主要集中在细胞体外培养、细胞基因组学、细胞应用三大领域。
本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。
关键词：生精细胞；支持细胞；管周肌样细胞；间质细胞；生物学；应用睾丸由生精小管和间质构成，1～4条生精小管（seminiferous tubule）高度盘曲于睾丸小叶中。
管壁上皮为特殊的生精上皮，是精子发生的场所，主要由支持细胞（Sertoli cell）、生精细胞（spermatogenic cell）组成。
小管上皮基膜外有胶原纤维和管周肌样细胞（peritubularmyoid，PTM）。
睾丸间质是含有大量的血管及淋巴管的疏松结缔组织，其中含有大量的间质细胞（Leydig cell），其主要功能为合成和分泌雄激素。
本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。
1 睾丸细胞生物学特点1.1生精细胞精子发生既是一个复杂的生物形态与遗传变化过程，又是一个复杂、特异的细胞分化过程，是生命周期循环的重要环节之一，其中生精细胞生物学变化起到关键作用。
人的精子发生需要（64±4.5）d，需要经过精原细胞增殖分化、精母细胞减速分裂、形成精子三个阶段。
精原细胞位于生精小管基底室，基膜与之相接触。
其分化起始于胚胎时期的原始生殖细胞，分化形成生殖母细胞并逐渐迁移至生精上皮基膜，经过细胞分裂分化成为以精原干细胞（SSCs）为主的精原细胞，SSCs可自我更新，又能定向分化成精母细胞。
大鼠的精原细胞可分为A型、中间型、B型精原细胞，Huckins提出将大鼠的精原细胞分为三部分，即贮备型精原干细胞（As），更新或增值型精原细胞（Apr-Aal）和分化型精原细胞（A1～A4-In-B）[1]，前两者也可以称之为未分化型精原细胞。
牛磺酸在牛胚胎体外发育中的作用研究袁水桥;罗光彬;李东全;王冰松【期刊名称】《沈阳农业大学学报》【年(卷),期】2007(038)004【摘要】研究了牛体外受精后早期胚胎体外发育时,向其基础培养液中加入牛磺酸对胚胎桑椹胚率、囊胚率和孵化囊胚率的影响,以探寻牛磺酸克服牛胚胎"体外发育阻滞"现象的作用.试验结果表明:以TCM-199+10%FBS为基础培养液(对照组),再加入7,14mM的牛磺酸(试验组),试验组与对照组的桑椹胚率分别为48.1%、47.4%和43.2%;囊胚率分别为26.4%、22.3%和21.0%;孵化囊胚率分别为21.8%、18.7%和0%.IVF后2细胞、4～8细胞及8～16细胞期,在基础培养液中分别添加7mM 的牛磺酸时,桑椹胚率分别为48.7%、57.1%和52.0%,囊胚率分别为25.1%、30.7%和27.9%,孵化囊胚率分别为25.9%、28.6%和25.0%:而添加14mM牛磺酸组时,桑椹胚率分别为50.4%、56.4%和55.4%,囊胚率分别为26.5%、31.3%和27.7%,孵化囊胚率分别为27.5%、31.1%和29.9%.体外发育培养液中添加7mM牛磺酸可显著提高桑椹胚率和囊胚率(p＜0.05),在4～8细胞期添加14mM牛磺酸最为合适.【总页数】4页(P552-555)【作者】袁水桥;罗光彬;李东全;王冰松【作者单位】沈阳农业大学,畜牧兽医学院,沈阳,110161;沈阳市二○四医院,生殖医学研究中心,沈阳,110043;沈阳农业大学,畜牧兽医学院,沈阳,110161;沈阳农业大学,畜牧兽医学院,沈阳,110161;沈阳市二○四医院,生殖医学研究中心,沈阳,110043【正文语种】中文【中图分类】S852.1;S823【相关文献】1.牛磺酸对昆明小鼠早期胚胎体外发育和着床的影响 [J], 范晶晶;郑秋闿2.牛磺酸和颗粒细胞对牛胚胎体外发育的影响 [J], 卢晟盛3.培养皿种类与牛磺酸和谷酰胺对牛胚胎体外发育的影响 [J], 卢晟盛4.K^+和Ca^(2+)对牛体外受精胚胎体外发育的作用 [J], 刘东军;旭日干5.不同培养液对牛孤雌生殖胚胎和体细胞核移植胚胎体外发育的影响 [J], 李雪峰;安志兴;郭继彤;张琇;张涌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
牦牛胰脏中糜蛋白酶的分离纯化及部分特性研究牦牛胰脏中糜蛋白酶的分离纯化及部分特性研究一、引言糜蛋白酶是一种在哺乳动物体内常见的消化酶，具有降解蛋白质的作用。
研究糜蛋白酶的分离纯化及特性，对于了解其结构和功能具有重要意义。
牦牛是我国北方高寒地区重要的农牧交错区域的酿酒牛品种，在其胰脏中存在着糜蛋白酶。
本研究旨在通过分离纯化及部分特性研究，探索牦牛胰脏中糜蛋白酶的性质和功能。
二、方法1. 实验样品准备：选取具有健康牦牛，采集其胰脏组织作为实验样品。
2. 粗提酶液制备：将牦牛胰脏组织切碎，加入磷酸盐缓冲液进行均质，离心上清液后，加入硫酸铵盐析沉淀蛋白质。
3. 分离纯化：将上述粗提酶液溶解沉淀后，通过酶活测定和蛋白质含量测定，选择合适的分离纯化方法。
4. 酶活测定：利用染色法或比色法，测定分离纯化后酶的活性。
5. SDS-PAGE分析：应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，确定酶的纯度和分子量。
6. 酶的理化特性测定：测定酶的最适温度、最适pH、热稳定性和抑制剂影响等。
三、结果1. 粗提酶液制备：通过离心和硫酸铵盐析，得到了牦牛胰脏组织的粗提酶液。
2. 分离纯化：通过酶活测定和蛋白质含量测定，采用凝胶过滤层析及离子交换层析得到了较为纯净的糜蛋白酶。
3. SDS-PAGE分析：通过SDS-PAGE分析，得到了糜蛋白酶的电泳图谱，确定其分子量为约25kDa。
4. 酶的理化特性测定：糜蛋白酶在45℃时表现出最佳的酶活性，其最适pH为7.5。
并且糜蛋白酶在60℃以下具有较好的热稳定性。
四、讨论通过对牦牛胰脏中糜蛋白酶的分离纯化及部分特性研究，我们得到了一定程度上纯净的糜蛋白酶，其分子量为约25kDa。
同时，糜蛋白酶具有较高的最适温度和最适pH，表明其在牦牛胃肠道中能够高效降解蛋白质。
然而，由于本研究仅对部分特性进行了探究，还有许多糜蛋白酶的性质和功能有待进一步研究。
五、结论本研究通过采用离心、盐析、层析等方法，成功分离纯化了牦牛胰脏中的糜蛋白酶，并初步探究了其部分特性。
生长因子和体细胞共培养对牛体外受精的影响丁向彬;王轶敏;郭志林;张涌【期刊名称】《天津农学院学报》【年(卷),期】2011(018)003【摘要】为研究表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对牛卵母细胞体外发育的影响以及体细胞共培养对体外受精胚胎体外发育的影响，将获取的牛卵泡卵母细胞在含有30μg，LEGF或50mg／L Insulin或30μg／LEGF＋50mg／L Insulin的成熟培养液中进行成熟培养，比较不同生长因子对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响；将受精卵用颗粒细胞单层培养系统或牛输卵管上皮细胞单层培养系统进行体外培养，比较体细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。
结果表明，成熟培养液中添加30μg／LEGF或者30μg／LEGF＋50mg／L Insulin 可以显著提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率（P〈0．05）；输卵管上皮细胞共培养系统可以显著提高受精后的囊胚发育率（P〈0．05），可以用于牛体外受精胚胎的体外培养。
【总页数】4页(P9-12)【作者】丁向彬;王轶敏;郭志林;张涌【作者单位】天津农学院动物科学系,天津300384;天津农学院动物科学系,天津300384;西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S814.6【相关文献】1.牛体外受精卵与牛胎儿睾丸支持细胞体外共培养研究 [J], 刘赛;赵云程;陈静波;海丽且木;赵晓娥;马保华2.碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对成年牛晶状体上皮细胞增殖的影响[J], 胡建石;林玲;郑志竑;朱进伟;林建银3.人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力 [J], 周建良;邹明晖;陈义初;周诚;史嘉玮;董念国4.不同共培养体细胞和胎牛血清浓度对牛体外受精后早期胚胎的影响 [J], 彭礼繁;罗光彬;袁水桥5.牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养的研究 [J], 张嘉保;伊藤贵子;板仓はっえ;小西正人;武富敏;郎青;柳敬人因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
两步酶法在小鼠睾丸支持细胞分离与培养过程中的研究作者：南涛张奎原张虎骆衡徐述雄宋大龙罗光恒孙兆林胡建新来源：《中国民族民间医药·下半月》2018年第03期【摘要】目的：探讨两步酶法分离小鼠睾丸支持细胞以及在体外培养、纯化、鉴定过程中的优越性。
方法：选取7～8d雄性昆明小鼠，用胶原酶Ⅳ及胰蛋白酶两步酶法分离小鼠睾丸组织获得支持细胞，利用细胞差速贴壁特性纯化支持细胞，利用倒置显微镜、PI染色、特异性抗体标记的方法从多个维度鉴定小鼠睾丸支持细胞。
结果：培养72 h后支持细胞呈片状平铺于培养皿底层，相互接触，连接成片。
用波形蛋白特异性鉴定证实本实验分离所获得的小鼠睾丸支持细胞。
经过PI染色提示这些支持细胞为具有活性的支持细胞。
结论：本研究提示两部酶法是一种简便且高效的分离小鼠睾丸支持细胞的有效方法，值得推广。
【关键词】两部酶法；细胞分离；睾丸支持细胞；研究【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）06-0041-04Abstract：Objective To investigate the advantages of the two step enzyme method to Isolated mouse Sertoli cells and culture in vitro，purify and identify.Methods Selection the KunMing male mice which born 7-8 days，using collagenase IV and trypsin to digestive testis tissue to get the sertoli cell and spermatogonium.Purification of Sertoli cells using differential adherent characteristics of the two cells.Sertoli cells were identified in several ways by using inverted microscopy， PI staining，and specific antibody labeling.Results After 72 hours of culture，The Sertoli cell spread at the bottom of the culture dish in？patches，and there are no obvious spermatogonial stem cells here whice looks like round.The PI staining indicated that these Sertoli cells are active.Vimentin specific identification proved that the isolated Testis Sertoli cells were obtained in this study.To verify what we got from the seperation experiment were the sustentacular cells of mouse testicles through vimentin specificity identification.Conclusion This research suggests the two enzymes is a simple and efficient method for separating Sertoli cells from mouse testis，the method is worth to be spread.Keywords：Two Step Enzyme Method；Cell Separation；Sertoli Cells；Research小鼠睾丸支持细胞是存在于小鼠睾丸生精上皮内的一种非生殖细胞，对生殖细胞具有支持营养作用[1]，每个支持细胞都营养着一定数目的生殖细胞[2-3]。
