膜-胞浆-核蛋白分步提取方法

核蛋白提取实验准备：1 4℃离心机2 根据标本数计算所需I，II，III，IV总体积，取出液体，并加入蛋白酶抑制剂，（III由加蛋白酶抑制剂I与加蛋白酶抑制剂II混合物）实验操作：1 收集细胞。

10ml 对照细胞（1-2*105/ml ）培养48h后，15ml 离心管收集，300g（1370 rpm）* 5min。

弃上清，加1ml 1*PBS轻轻涡旋混匀后转移至1.5ml EP管。

2 4℃，300g * 5min，弃上清。

3 重悬细胞于120μl缓冲液I。

4 重悬细胞于120μl缓冲液II，4℃轻微旋转混匀，15min。

5 4℃ 2500 rpm * 1min。

6 转移上清（胞浆蛋白）至新管。

7 在沉淀中缓慢加120μl缓冲液III，轻微颠倒混匀，离心：4℃，2500 rpm * 1min。

8 弃上清，加130μl缓冲液IV（+蛋白酶抑制剂），4℃旋转混匀1h。

9 离心4℃，13000g * 10 min。

10 转移上清（核蛋白）至一新管，定量。

核提取缓冲液I（15ml）25mM HEPES 375μl HEPES5mM KCl 75μl 1M KCl0.5mM MgCl2 7.5μl 1M MgCl2DDH2O 14.54 ml核提取缓冲液II（15ml）25mM HEPES 375μl HEPES5mM KCl 75μl 1M KCl0.5mM MgCl2 7.5μl 1M MgCl21% NP-40 150μl NP-40DDH2O 14.39 ml核提取缓冲液III（15ml）25mM HEPES 250μl HEPES10% Sucrose 1g Sucrose350mM NaCl 700μl 5M NaCl0.01% NP40 1μl NP-40DDH2O 9.1 ml5M NaCl：14.61g/50 ml H2O注：1在提取浆蛋白后，吸去上清时，如第一次用100μl枪洗不干净，再离心，然后用10μl枪吸尽液体。

（完整word版）膜蛋白提取1分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。

弃去上清，沉淀用适量的Buffer B 重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

2取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。

样品蛋白含量测定采用酚试剂法。

3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。

将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。

2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。

RIP试剂配方及操作步骤所有试剂需用DEPC水配置，临用前加入终浓度1 mM PMSF，1×Protease inhibitors (PIC)和100 U/ml RNase inhibitor！！！1、胞浆和核蛋白提取(10 mM Tris, pH 7.4, 200 mM NaCl, 30 mM EDTA and 0.5% Triton-X 100)(10 mM Tris, pH 7.4, 200 mM NaCl, 30 mM EDTA and 0.5% Triton-X 100, 0.5% NP40)也可以直接用RIP buffer。

2、膜蛋白提取(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM EDTA)，相当于碧云天的中强裂解液。

3、RIP Buffer(150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 25mM Tris PH7.5, 5 mM EDTA, 0.5% NP40)4、Wash buffer I（低盐）(20 mM Tris-Hcl pH 8.1, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 and 0.1% SDS)5、Wash buffer II（高盐）(20 mMTris-Hcl pH 8.1, 500 Mm NaCl, 1% TritonX-100 and 0.1% SDS)6、PBS（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4）7、Nuclear isolation buffer（1.28 M sucrose，40 mM Tris-HCl pH 7.5，20 mM MgCl 2，4% Triton X-100）步骤：蛋白的制备1、睾丸组织样本用预冷的PBS洗三次，加入PBS冰浴匀浆为单细胞。

膜-胞浆蛋白提取方法膜-胞浆蛋白提取方法膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒产品组成：产品组成规格试剂 A 试剂 B 试剂 C蛋白酶抑制剂混合物蛋白稳定剂BB-3111-150T 10ml 20ml 10ml 250μl 100ulBB-3111-2 100T 20ml 40ml 20ml 500μl 200ul储存条件：蛋白酶抑制剂、蛋白稳定剂-20℃保存；蛋白提取液2-8℃保存。

有效期：一年。

产品简介：哺乳动物跨膜蛋白承当各种生物功能，在疾病的发生、开展过程中扮演重要角色。

膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析^p 及质谱分析^p 等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。

传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和外表活性剂增溶。

去污剂处理睬使膜蛋白丧失其天然构造，因此阻碍了膜蛋白的功能研究。

贝博膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白提取试剂盒。

本试剂盒提供配套试剂，适用于从细胞和动物组织提取膜蛋白和胞浆蛋白。

提取过程简单方便，可在1小时内完成。

提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少穿插污染。

提取的蛋白可用于Western Blotting、转录活性分析^p 、Gel shift凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。

应用实例：1 4 4图片说明：用膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞样本的'SDA-PAGE的电泳考染照片和Western照片。

图1泳道中1、4分别为Marker、膜蛋白样本。

图2为以上样品的EGFR的WB结果照片。

使用方法：A．细胞蛋白提取①1. 取5-10×106个以上细胞，在4℃，500g条件下离心2-3分钟，小心汲取培养基，尽可能吸干，搜集细胞。

2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3. 细胞样品中参加200μl冷的试剂 A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，2ul蛋白稳定剂，高速涡旋振荡15秒，置冰上10-15分钟。