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944中国药事2019年8月第33卷第8期磷酸左奥硝哩酯二钠细菌内毒素检测方法验证杨晨，谢益晖"，王贺，顾德周，王林（扬子江药业集团，泰州225321）摘要目的：建立磷酸左奥硝哇酯二钠细菌内毒素的常规检测方法。
方法：按《中华人民共和国药典》2015年版通则1143细菌内毒素检查法进行。
结果：在验证条件下，样品原液稀释至6.25mg-mL_,时，对细菌内毒素检查法无干扰作用。
结论：建立的方法用于检查磷酸左奥硝哇酯二钠的细菌内毒素可行。
关键词：磷酸左奥硝哇酯二钠；细菌内毒素；凝胶法；干扰试验中图分类号：R927.1文献标识码：A文章编号：1002-7777(2019)08-0944-05doi:10.16153/j.1002-7777.2019.08.015Validation of Bacterial Endotoxin Testing Method for Levoornidazole Phosphate DisodiumYang Chen,Xie Yihui*,Wang He,Gu Dezhou,Wang Lin(Yangtze River Pharmaceutical Group Co.,Ltd., Taizhou225321,China)Abstract Objective:To establish a conventional bacterial endotoxin testing method for levoornidazole phosphate disodium.Methods:The test method was carried out according to the bacterial endotoxin testing method of general rule1143in the Chinese Pharmacopoeia of2015edition.Results:Under the validation condition,the sample stock solution diluted to6.25mg•mL'1did not interfere with the bacterial endotoxin testing.Conclusion:The established method can be used for bacterial endotoxin testing of levoornidazole phosphate disodium.Keywords:levoornidazole phosphate disodium;bacterial endotoxin;gel method;interference test奥硝醴为目前常用的抗厌氧菌药物，作为继甲硝哩和替硝醴后的第三代抗厌氧菌感染药物，疗效稳定，副作用小u-役左奥硝醴作为奥硝哩的单一对映体，与现有的奥硝醴相比，其副反应更小⑶。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。
2 范围适用于本公司质管部对注射用水的细菌内毒素检验。
3 责任检验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。
4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1仪器、用具4.1.1天平、电热干燥箱、旋涡混合器、恒温水浴锅、反应试管、镊子（金属）、金属盒、移液器具，酒精灯、脱脂棉球、剪刀、砂轮、封口膜，记号笔。
4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。
4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.2.2鲎试剂4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。
λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ≤λc≤2.0λ时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。
每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。
4.4供试品干扰试验按鲎试剂灵敏度复核试验项下，用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数（MVD）的稀释液分别将同一支（瓶）细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的细菌内毒素溶液。
2015版《中国药典》关于《通则和指导原则》的内容（以下红色标记的内容更需要关注）序号编码目录10100 制剂通则2 0101 片剂3 0102 注射剂4 0103 胶囊剂5 0104 颗粒剂6 0105 眼用制剂7 0106 鼻用制剂8 0107 栓剂9 0108 丸剂10 0109 软膏剂乳膏剂11 0110 糊剂12 0111 吸入制剂13 0112 喷雾剂14 0113 气雾剂15 0114 凝胶剂16 0115 散剂17 0116 糖浆剂18 0117 搽剂19 0118 涂剂20 0119 涂膜剂21 0120 酊剂22 0121 贴剂23 0122 贴膏剂24 0123 口服溶液剂口服混悬剂口服乳剂25 0124 植入剂26 0125 膜剂27 0126 耳用制剂28 0127 洗剂29 0128 冲洗剂30 0129 灌肠剂31 0181 合剂32 0182 锭剂33 0183 煎膏剂（膏滋）34 0184 胶剂35 0185 酒剂36 0186 膏药37 0187 露剂38 0188 茶剂39 0189 流浸膏剂与浸膏剂400200 其他通则41 0211 药材和饮片取样法42 0212 药材和饮片检定通则43 0213 炮制通则44 0251 药用辅料45 0261 制药用水46 0291 国家药品标准物质通则47030048 0301 一般鉴别试验49 0400 光谱法50 0401 紫外-可见分光光度法51 0402 红外分光光度法52 0405 荧光分光光度法53 0406 原子吸收分光光度法54 0407 火焰光度法55 0411 电感耦合等离子体原子发射光谱法56 0412 电感耦合等离子体质谱法57 0421 拉曼光谱法58 0431 质谱法59 0441 核磁共振波谱法60 0451 X射线衍射法610500 色谱法62 0501 纸色谱法63 0502 薄层色谱法64 0511 柱色谱法65 0512 高效液相色谱法66 0513 离子色谱法67 0514 分子排阻色谱法68 0521 气相色谱法69 0531 超临界流体色谱法70 0532 临界点色谱法71 0541 电泳法72 0542 毛细管电泳法730600 物理常数测定法74 0601 相对密度测定法75 0611 馏程测定法76 0612 熔点测定法77 0613 凝点测定法78 0621 旋光度测定法79 0622 折光率测定法80 0631 pH值测定法81 0632 渗透压摩尔浓度测定法82 0633 黏度测定法83 0661 热分析法84 0681 制药用水电导率测定法85 0682 制药用水中总有机碳测定法860700 其他测定法87 0701 电位滴定法与永停滴定法88 0702 非水溶液滴定法89 0703 氧瓶燃烧法90 0704 氮测定法91 0711 乙醇量测定法92 0712 甲氧基、乙氧基与羟丙氧基测定法93 0713 脂肪与脂肪油测定法94 0721 维生素A测定法95 0722 维生素D测定法96 0731 蛋白质含量测定法970800 限量检查法98 0801 氯化物检查法99 0802 硫酸盐检查法100 0803 硫化物检查法101 0804 硒检查法102 0805 氟检查法103 0806 氰化物检查法104 0807 铁盐检查法105 0808 铵盐检查法106 0821 重金属检查法107 0822 砷盐检查法108 0831 干燥失重测定法109 0832 水分测定法110 0841 炽灼残渣检查法111 0842 易炭化物检查法112 0861 残留溶剂测定法113 0871 甲醇量检查法114 0872 合成多肽中的醋酸测定法115 0873 2-乙基己酸测定法1160900 特性检查法117 0901 溶液颜色检查法118 0902 澄清度检查法119 0903 不溶性微粒检查法120 0904 可见异物检查法121 0921 崩解时限检查法122 0922 融变时限检查法123 0923 片剂脆碎度检查法124 0931 溶出度与释放度测定法125 0941 含量均匀度检查法126 0942 最低装量检查法127 0951 吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法128 0952 黏附力测定法129 0981 结晶性检查法130 0982粒度和粒度分布测定法131 0983 锥入度测定法132 1100 生物检查法133 1101 无菌检查法134 1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法135 1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法136 1107 非无菌药品微生物限度标准137 1121 抑菌效力检查法138 1141 异常毒性检查法139 1142 热原检查法140 1143 细菌内毒素检查法141 1144 升压物质检查法142 1145 降压物质检查法143 1146 组胺类物质检查法144 1147 过敏反应检查法145 1148 溶血与凝聚检查法1461200 生物活性测定法147 1201 抗生素微生物检定法148 1202 青霉素酶及其活力测定法149 1205 升压素生物测定法150 1206 细胞色素C活力测定法151 1207 玻璃酸酶测定法152 1208 肝素生物测定法153 1209 绒促性素生物测定法154 1210 缩宫素生物测定法155 1211 胰岛素生物测定法156 1212 精蛋白锌胰岛素注射液延缓作用测定法157 1213 硫酸鱼精蛋白生物测定法158 1214 洋地黄生物测定法159 1215 葡萄糖酸锑钠毒力检查法160 1216 卵泡刺激素生物测定法161 1217 黄体生成素生物测定法162 1218 降钙素生物测定法163 1219 生长激素生物测定法164 1401 放射性药品检定法165 1421 灭菌法166 1431 生物检定统计法1672000 中药其他方法168 2001 显微鉴别法169 2101 膨胀度测定法170 2102 膏药软化点测定法171 2201 浸出物测定法172 2202 鞣质含量测定法173 2203 桉油精含量测定法174 2204 挥发油测定法175 2301 杂质检查法176 2302 灰分测定法177 2303 酸败度测定法178 2321 铅、镉、砷、汞、铜测定法179 2322 汞和砷元素形态及其价态测定法180 2331 二氧化硫残留量测定法181 2341 农药残留量测定法182 2351 黄曲霉毒素测定法183 2400 注射剂有关物质检查法1843000 生物制品相关检查方法1853100 含量测定法186 3101 固体总量测定法187 3102 唾液酸测定法（间苯二酚显色法）188 3103 磷测定法189 3104 硫酸铵测定法190 3105 亚硫酸氢钠测定法191 3106 氢氧化铝（或磷酸铝）测定法192 3107 氯化钠测定法193 3108 枸橼酸离子测定法194 3109 钾离子测定法195 3110 钠离子测定法196 3111 辛酸钠测定法197 3112 乙酰色氨酸测定法198 3113 苯酚测定法199 3114 间甲酚测定法200 3115 硫柳汞测定法201 3116 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯含量测定法202 3117 O-乙酰基测定法203 3118 己二酰肼含量测定法204 3119 高分子结合物含量测定法205 3120 人血液制品中糖及糖醇测定法206 3121 人血白蛋白多聚体测定法207 3122 人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定法208 3123 人免疫球蛋白中甘氨酸含量测定法209 3124 重组人粒细胞刺激因子蛋白质含量测定法210 3125 组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺测定法211 3126 IgG含量测定法212 3127 单抗分子大小变异体测定法（CE-SDS）2133200 化学残留物测定法214 3201 乙醇残留量测定法215 3202 聚乙二醇残留量测定法216 3203 聚山梨酯80残留量测定法217 3204 戊二醛残留量测定法218 3205 磷酸三丁酯残留量测定法219 3206 碳二亚胺残留量测定法220 3207游离甲醛测定法221 3208 人血白蛋白铝残留量测定法222 3209 羟胺残留量测定法2233300 微生物检查法224 3301 支原体检查法225 3302 外源病毒因子检查法226 3303 鼠源性病毒检查法227 3304 SV40核酸序列检查法228 3305 猴体神经毒力试验229 3306 血液制品生产用人血浆病毒核酸检测技术要求2303400 生物测定法231 3401 免疫印迹法232 3402 免疫斑点法233 3403 免疫双扩散法234 3404 免疫电泳法235 3405 肽图检查法236 3406 质粒丢失率检查法237 3407 外源性DNA残留量测定法238 3408 抗生素残留量检查法（培养法）239 3409 激肽释放酶原激活剂测定法240 3410 抗补体活性测定法241 3411 牛血清白蛋白残留量测定法242 3412 大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法243 3413 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法244 3414 酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法245 3415 类A血型物质测定法246 3416 鼠IgG残留量测定法247 3417 无细胞百日咳疫苗鉴别试验（酶联免疫法）248 3418 抗毒素、抗血清制品鉴别试验（酶联免疫法）249 3419 A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法250 3420 伤寒Vi多糖分子大小测定法251 3421 b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法252 3422 人凝血酶活性检查法253 3423 活化的凝血因子活性检查法254 3424 肝素含量测定法255 3425 抗A、抗B血凝素测定法256 3426 人红细胞抗体测定法257 3427 人血小板抗体测定法258 3500 生物活性/效价测定法259 3501 重组乙型肝炎疫苗（酵母）体外相对效力检查法260 3502 甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检查法261 3503 人用狂犬病疫苗效价测定法262 3504 吸附破伤风疫苗效价测定法263 3505 吸附白喉疫苗效价测定法264 3506 类毒素絮状单位测定法265 3507 白喉抗毒素效价测定法266 3508 破伤风抗毒素效价测定法267 3509 气性坏疽抗毒素效价测定法268 3510 肉毒抗毒素效价测定法269 3511 抗蛇毒血清效价测定法270 3512 狂犬病免疫球蛋白效价测定法271 3513 人免疫球蛋白中白喉抗体效价测定法272 3514 人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法273 3515 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法（E玫瑰花环形成抑制试验）274 3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法（淋巴细胞毒试验）275 3517 人凝血因子Ⅱ效价测定法276 3518 人凝血因子Ⅶ效价测定法277 3519 人凝血因子Ⅸ效价测定法278 3520 人凝血因子Ⅹ效价测定法279 3521 人凝血因子Ⅷ效价测定法280 3522 重组人促红素体内生物学活性测定法281 3523 干扰素生物学活性测定法282 3524 重组人白介素-2生物学活性测定法283 3525 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法284 3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法285 3527 重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法286 3528 重组人表皮生长因子生物学活性测定法287 3529 重组链激酶生物学活性测定法288 3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法289 3531 尼妥珠单抗注射液生物学活性测定法290 3532 重组人白介素-11生物学活性测定法291 3533 注射用A型肉毒毒素成品效价测定法（平行线法）2923600 特定生物原材料/动物293 3601 无特定病原体鸡胚质量检测要求294 3602 实验动物微生物学检测要求295 3603 实验动物寄生虫学检测要求296 3604 新生牛血清检测要求297 3605 细菌生化反应培养基2983700299 3701 生物制品国家标准物质目录3008000 试剂与标准物质301 8001 试药302 8002 试液303 8003 试纸304 8004 缓冲液305 8005 指示剂与指示液306 8006 滴定液307 8061 对照品对照药材对照提取物308 8062 对照品标准品3099000 指导原则310 9001 原料药物与制剂稳定性试验指导原则311 9011 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则312 9012 生物样品定量分析方法验证指导原则313 9013 缓释、控释和迟释制剂指导原则314 9014 微粒制剂指导原则315 9015 药品晶型研究及晶型质量控制指导原则316 9101 药品质量标准分析方法验证指导原则317 9102 药品杂质分析指导原则318 9103 药物引湿性试验指导原则319 9104 近红外分光光度法指导原则320 9105 中药生物活性测定指导原则321 9106 基于基因芯片的药物评价技术与方法指导原则322 9107 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则323 9201 药品微生物检验替代方法验证指导原则324 9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则325 9203药品微生物实验室质量管理指导原则326 9204 微生物鉴定指导原则327 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则328 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则329 9301注射剂安全性检查法应用指导原则330 9302 中药有害残留物限量制定指导原则331 9303 色素测定法指导原则332 9304 中药中铝、铬、铁、钡元素测定指导原则333 9305 中药中真菌毒素测定指导原则334 9501 正电子类放射性药品质量控制指导原则335 9502 锝［99mTc］放射性药品质量控制指导原则336 9601 药用辅料功能性指标研究指导原则337 9621 药包材通用要求指导原则338 9622 药用玻璃材料和容器指导原则339 9901 国家药品标准物质制备指导原则。
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K／M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(k g•h)表示。
其中注射剂，K=5EU／(k g•h)；放射性药品注射剂，K=2．5EU ／(k g•h)；鞘内用注射剂，K=0.2EU／(k g•h)。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以m1／(k g•h)、mg／(k g•h)、U／(k g•h)表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于l小时的按l小时计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积计量乘以0.027即可转换为每千克体重计量［即M=(最大给药剂量/(m2·h)×1.62m2)/60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVD＝CL/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。
当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／m1或U／m1。
作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-073细菌内毒素检查法第2页共18页第二版批准李忠华初审吴雅凝起草吴雅凝λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C：λ／L。
盐酸替罗非班原料药细菌内毒素检查法的建立摘要目的：建立盐酸替罗非班原料细菌内毒素的检查方法。
方法：依据2015年版《中国药典》“细菌内毒素检查法”项下凝胶法的要求，通过干扰试验确定样品最大无干扰浓度，并进行方法学验证。
结果：样品浓度在0.05mg/ml或以下时对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰作用。
结论：所建立的方法可用于盐酸替罗非班原料的细菌内毒素检查。
关键词盐酸替罗非班；细菌内毒素检查，凝胶法；干扰试验Establishment of Bacterial Endotoxin Test Method for Tirofiban HydrochlorideLIU xiaoyun（ChiataiQingchunbao Pharmaceutical Co..Ltd.，Zhejiang Hangzhou 310023,China）ABSTRACT OBJECTIVE：To establish the Bacterial Endotoxin Test Method for Tirofiban Hydrochloride .METHODS：According to the appendix of the gel methodunder“bacterial endotoxin test method”in Chinese Pharmacopiea（2015 edition），the maximal non-interference concentrations of samples were determined by interference test ,and then methodology validation was conducted.RESULTS:The agglutination of LAL with bacterial endotoxin had no interference when the samplewas diluted to 0.05mg/ml or below. CONCLUSIONS: The established method can be used to detect the bacterial endotoxin of Tirofiban Hydrochloride.KEYWORDS Tirofiban Hydrochloride; Bacterial endotoxin test; Gel method; interference test抗血小板治疗在冠状动脉粥样硬化性心脏病治疗中起着十分重要的作用。
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
作者简介：钮晓淑，主管药师；研究方向：抗生素药品检验和药理学检验。
Ｔｅｌ：１８１６８５５５２９９；Ｅ ｍａｉｌ：５４９２１７７６７＠ｑｑ ｃｏｍ酚磺乙胺注射液细菌内毒素检查方法的建立钮晓淑（泰州市食品药品检验所，江苏泰州２２５３００）摘要 目的：建立酚磺乙胺注射液细菌内毒素检查质量标准。
方法：依据《中国药典》２０１５年版四部通则中细菌内毒素检查法，拟定细菌内毒素检查限值，采用２个不同厂家的鲎试剂进行干扰试验，确认是否存在抑制因素的影响。
结果：确定酚磺乙胺注射液细菌内毒素限值Ｌ为０ ３ＥＵ·ｍｇ－１；在规定实验条件下，将酚磺乙胺注射液稀释至５ｍｇ·ｍＬ－１时，对灵敏度为０ ２５ＥＵ·ｍＬ－１的鲎试剂无干扰作用。
结论：本文建立的酚磺乙胺注射液的细菌内毒素检查方法合理有效，可对该注射剂中细菌内毒素进行质量控制。
关键词：酚磺乙胺注射液；细菌内毒素；干扰试验中图分类号：Ｒ９２１ ２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－３６５６（２０２０）－３－０２０２－４ｄｏｉ：１０ １９７７８／ｊ ｃｈｐ ２０２０ ０３ ００４ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒＥｔａｍｓｙｌａｔｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎＮＩＵＸｉａｏｓｈｕ（ＴａｉｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，Ｔａｉｚｈｏｕ２２５３００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｏｆＥｔａｍｓｙｌａｔｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｂａｃ ｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｌｉｍｉｔｗａｓｓｅｔａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄｉｎＣｈＰ２０１５ＶｏｌⅣ Ｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒ ｅｎｃｅｔｅｓｔｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｗｉｔｈＴＡＬｓｆｒｏｍｔｗｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓｔｏｃｏｎｆｉｒｍｗｈｅｔｈｅｒａｎｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｅｘｉｓｔｅｄ Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｌｉｍｉｔｏｆＥｔａｍｓｙｌａｔｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎｗａｓｓｅｔａｓ０ ３ＥＵ·ｍｇ－１ＷｈｅｎＥｔａｍｓｙｌａｔｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎｗａｓｄｉｌｕ ｔｅｄｔｏ５ｍｇ·ｍＬ－１，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｎＴＡＬｗｉｔｈａｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆ０ ２５ＥＵ·ｍＬ－１ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｅｄｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｍｅｔｈｏｄｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｆｏｒＥｔａｍｓｙｌａｔｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎｉｓｒｅａ ｓｏｎａｂｌｅａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｉｎＥｔａｍｓｙｌａｔｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥｔａｍｓｙｌａｔｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎ；ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔｅｓｔ 酚磺乙胺，又名止血敏，为我国的基本药物，在我国上市已有３０余年，临床用于预防和治疗各种术中和术后出血，也可用于血小板功能不良、血管脆性增加而引起的胃肠道出血、脑出血及泌尿道出血等多种出血，常与其他药物配伍使用。
细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06起草人：审核人：批准人：批准日期：年月日目录1 概述 12 验证目的及范围 13 验证小组人员组成及职责 14 验证依据 25 验证前准备 26 验证的实施 27 偏差处理 58 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 510 再验证及周期 511 验证文件及归档 512 附件 51 概述细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。
2 验证目的和方法本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。
3.验证小组人员组成及职责：3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。
3.2 验证小组组成及职责列表4 验证依据《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法5.验证前准备5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。
培训人员记录见附件1。
5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。
6 验证的实施6.1实验材料及用具6.1.1电子天平6.1.2. 电热干燥箱6.1.3. 恒温恒湿箱6.1.4.水银温度计6.1.5. 旋涡混合器6.1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号）6.1.7.细菌内毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品)6.1.8.细菌内毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用。
雷贝拉唑钠细菌内毒素检验方法的建立雷小平*陈青连**（杭州澳亚生物技术有限公司杭州 310018）摘要目的：建立控制雷贝拉唑钠中细菌内毒素限度的方法。
方法：按照《中国药典》2015年版建立雷贝拉唑钠细菌内毒素凝胶法检验方法。
结果：使用灵敏度为0.06 EU/ml的鲎试剂进行试验，得到雷贝拉唑钠最高不干扰浓度为0.24 mg/ml。
结论：对雷贝拉唑钠可采用凝胶法进行细菌内毒素检验，其限度定为1 EU/mg，供试品检测浓度为0.06 mg/ml，使用鲎试剂的灵敏度为0.06 EU/ml。
关键词雷贝拉唑钠细菌内毒素凝胶法中图分类号：R927.12; R975.6 文献标志码：A 文章编号：1006-1533(2019)21-0075-05Establishment of a method suitable for the bacterial endotoxin testin rabeprazole sodiumLEI Xiaoping*, CHEN Qinglian**(Hangzhou Ausia Biological Tech Co., Ltd., Hangzhou 310018, China)ABSTRACT Objective: To establish a method for the control of the limit of bacterial endotoxin in rabeprazole sodium. Methods: The gel-clot method for the bacterial endotoxin test in rabeprazole sodium was established according to Chinese Pharmacopoeia (2015 ed.). Results: The test was carried out with tachypleus amebocyte lysate with sensitivity of 0.06 EU/ml. The maximum non-interference concentration of rabeprazole sodium was 0.24 mg/ml. Conclusion: Gel-clot method can be used to test bacterial endotoxin in rabeprazole sodium. The limit is 1 EU/mg. The detection concentration of the sample is 0.06 mg/ml and the sensitivity of tachypleus amebocyte lysate reagent is 0.06 EU/ml.KEy WORDS rabeprazole sodium; bacterial endotoxin; gel-clot method雷贝拉唑钠是一种新型的质子泵抑制剂，可于治疗酸相关性疾病，如消化性溃疡、胃食管反流性疾病、卓-艾氏综合征等，具有选择性强烈抑制幽门螺杆菌（Hp）作用，在临床使用中有显著性优势[1-3]。
记录编码：LZ-B00-TJL-2011-010-A序号：
灵泽医药技术开发
一次性肠外营养输液袋
细菌毒素检查法验证方案
编制：树权日期：2012.11.7
审核：日期：
批准：日期：
1.验证目的
为公司产品细菌毒素检测方法提供依据。
2.验证依据
3.《中华人民国药典》 2010年版第二部附录Ⅺ E 细菌毒素检查法
4.验证条件
无菌操作间（万级）
5.验证准备
4.1 试验设备
5.2试剂
5.3样品：
4.4 实验前准备：
1) 实验用具移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮、耐热器皿须经180℃烘烤120min。
若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无毒素并且对实验无干扰的器械。
2) 使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，置30%双氧水中浸泡4小时，再用细菌毒素检查用水充分冲洗后60℃烘干备用。
或用一次性无热源吸头。
5. 样品制备（供试液溶液）
将20ml毒素检查用水注入到一次性肠外营养输液袋，37℃孵育60min。
作为供试品溶液。
6.鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
因此要验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰实验或供试品细菌毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。
6.1实验操作
6.1.1 细菌毒素标准溶液的制备：
1) 取细菌毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶；
2) 按照标准品说明书，加入规定量的细菌毒素检查用水溶解其容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15min。
然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌毒素标准溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程请参见标准品使用说明书）。
6.1.2 待复核鲎试剂的准备：
取规格为0.1mL/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开备用。
每支加入0.1mL检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使容物充分溶解，避免产生气泡。
若待复核鲎试剂的规格不是0.1mL/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1mL分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。
6.1.3 加样
将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），每支分别加入0.1mL 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的毒素标准溶液；1列2支（管），每支分别加入0.1mL检查用水。
6.1.4 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入（37±1）℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温(60±2)min。
6.1.5 观察并记录结果。
将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
6.1.6 实验结果计算
如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）：
λc=antilg( ∑X/4 )；
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）,反应终点浓度是系列递减的毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
6.1.7 结果判断
当λc 在0.5λ～2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
7. 毒素干扰试验
7.1 试验溶液配置：
注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示的灵敏度的对照系列；
D为阴性对照试验
将已充分溶解的鲎试剂28支（管）放在试管架上，排成10列，其中A列2支管，每支加入0.1ml的供试品溶液，B为4列B1-B4每列4支（管），每支分别加入0.1mL 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的用供试品溶液稀释的毒素溶液；C为4列C1-C4每列2支（管），每支分别加入0.1mL 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的毒素标准溶液，D列2支（管），每支分别加入0.1mL检查用水。
7.2加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入（37±1）℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温(60±2)min。
7.3观察并记录结果。
将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。
7.4结果判断：只有溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果符合鲎试剂灵敏度复核实验要求时，实验方为有效。
按下式计算系列溶液C和B
的反应终点浓度的几何平均值（Ea和X1）。
Es=antilg( ∑Xs/4 )
Et=antilg( ∑Xt/4 )
式中 Xs和Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（lg）.
当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）及在Et在0.5Es～2.0Es(包括0.5Es 和2.0Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对实验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
7.5实验结论：
8. 样品检验
8.1 阳性对照溶液的制备
用检查用水将标准品稀释制成2.0λ浓度的毒素标准溶液。
8.2 供试品阳性对照溶液的制备
用待检测的供试品溶液将毒素标准品制成2.0λ浓度的毒素溶液。
8.3 阴性对照液即细菌毒素检查用水。
8.4 鲎试剂的准备方法同6.1.2。
8.5 加样
取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2 支加入0.1mL供试品溶液作为供试品管。
2支加入0.1mL阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1mL 检查用水作为阴性对照，2支加入0.1mL供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。
8.6 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入（37±1）℃水浴或适宜恒温器中，保温(60±2)min。
保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
8.7 结果判断
1) 当阳性对照都为阳性，供试品阳性对照都为阳性，且阴性对照都为阴性时，实验方法有效；
2) 若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；
3) 如供试品2管均为阳性，应认为不符合规定；
4) 如2管中1管为阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。
8.8实验结论：
10方案评审记录。
