显微切割技术章

第七章显微切割技术人体组织是由相互作用的不同的细胞群体组成的，这些细胞群体彼此组成复杂的三维结构，每种细胞均有自己的独特的mRNA与蛋白质表达（表现型）。

因此在复杂的组织中取得同质性的样本是相当困难的。

尤其在肿瘤的病理学研究中，样本的同质性是经常遇到的问题。

例如，霍奇金病的肿瘤细胞——Reed-Sternberg细胞和Hodgkin细胞（R-S/H细胞），通常单个分散在大量的反应性细胞（如淋巴细胞、组织细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞）组成的背景之中，给R-S/H细胞起源的研究带来很大的困难。

随着分子病理学研究的深入，需要分离的样本越来越小，从大块的组织精确到单个的细胞，甚至细胞器或者染色体。

常规的研究方法对此无能为力，而显微切割技术的出现解决了上述难题。

在显微切割技术（microdissection technique）发展之前，进行原位的细胞表型的研究方法是免疫组化和原位杂交。

但是免疫组化和原位杂交方法一般只能局限于一种或是几种基因表达的分析，而且难以进行DNA、mRNA和蛋白质的定量分析（如突变、缺失）。

显微切割技术能够对于组织病理学上确定的细胞群（甚至精确到一个特定的细胞，或特定的细胞器或特定的染色体）进行分子病理学研究，达到高度敏感性和高度特异性的统一。

尤其是在需研究的细胞只占样本中细胞的少数时，以及需研究的细胞呈散在分布时，显微切割的重要性尤为明显。

加之现在的免疫组织化学和原位杂交等技术可以在切片上特异性定位所需的细胞，因此显微切割技术在最近几年中得到了迅速地发展。

由于和高通量（high-throughput）基因分析（基因芯片）以及蛋白分析技术结合，显微切割技术显示出良好的发展前景（图7-1）。

图7-1一、显微切割技术发展的回顾组织显微切割的概念尤为简单，即直接在光学显微镜下从异质性的组织样本中选取某一特定的细胞群。

实际上，要达到这一目的在技术上经历了以下几个阶段：早期是从冰冻组织切片上在肉眼下用解剖刀刮去不需要的部分，剩下感兴趣的组织。

如1965年，Baxter对肾小管进行的显微切割的研究[1]。

后来发展成在显微操作仪（micromanipulator）引导下使用带有粘附尖端的解剖针或者吸管，进行手动切割和提取（图7-2），使得精确性和实用性大为增强。

如上个世纪90年代初德国Hansmann等使用这一方法对R-S/H细胞的研究[2]。

这些方法基本上为手动，精确性低，费时费力，可重复性差，而且不能完全避免污染。

1992年美国国立癌症研究院的Liotta等人研发的选择性紫外辐射分离技术（selective ultraviolet radiation fractionation，SURF）带来技术上的重大突破，该方法在切片上先用墨水选择性的覆盖需要的细胞或组织，然后用高能量的紫外激光束破坏周围无关组织中的DNA。

墨水覆盖区的细胞的DNA得以保存，再用解剖针采集[3]。

1995年Liotta教授等进一步发展的膜覆盖组织的非接触性激光显微切割技术（non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue）使得显微切割实现了高度精确、无污染、快速和自动化。

将热敏的乙酸乙烯薄膜覆盖在组织切片上，用激光束（100mJ～200mJ）直接照射需要的细胞群，薄膜受热而与下面的组织紧紧粘住，掀开薄膜就可将靶组织粘在薄膜上（图7-3），可用于PCR[4]。

另一种激光捕获显微切割术（laser capture microdissection，LCM）的原理是将薄膜预先覆盖在切片上，然后将组织切片或其他材料裱在薄膜之上，在显微镜下由紫外激光进行切割。

计算机控制的激光可以按照操作者的要求沿监视器上选定的细胞的边缘切割，切割下的细胞或组织直接落入下面的Eppendorf管内（彩图7-1）。

既避免了污染，又不会损害DNA、RNA或蛋白质。

Leica公司和Olympus 公司等已研发出计算机控制的激光捕获显微切割装置供应市场。

实现了快速、简单、精确的显微切割和无污染的提取靶细胞。

在国内目前上海肿瘤医院、浙江大学附属第二医院等单位均购置了此类设备。

图7-2图7-3二、显微切割的材料用于显微切割的材料十分广泛，可以是冰冻组织切片、石蜡切片、细胞涂片、细胞铺片、细胞爬片、分裂中期的染色体铺片等。

如用于DNA的提取，福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片可以满足大部分要求，但提取单个细胞的DNA进行PCR还需要冰冻切片。

如用于RNA的提取，则需要冰冻切片或者细胞涂片。

如用于蛋白质的分析，仍以冰冻切片为好。

三、显微切割的标记方法显微切割的切片或者涂片可以仅作常规的甲苯胺蓝或者甲基绿染色后，按照细胞形态学进行切割和提取。

对于特定的切割对象，可用免疫组织化学、原位杂交（包括FISH）、原位末端标记、原位PCR方法等先行定位后再进行切割。

这样切割的靶细胞或者靶组织可以保证高度的精确性和同质性。

例如在对于人R-S/H细胞的研究中，先使用CD30单克隆抗体标记R-S/H细胞，再作显微切割[2,5]。

以保证切割的精确性。

四、目前使用的主要的显微切割技术方法（一）液压控制手动显微切割（显微操作仪）采用液压式显微操作仪（如日本的Narishige，德国的Eppendorf）进行。

可通过液压系统进行三维控制，切割精度高。

在一定放大倍率的显微镜下,用显微操纵器（micromanipulator）探头挟持的微吸管（micropipette）或者30号针头，仔细分离出靶细胞并将其转移至Eppendorf管中,用蛋白酶K消化后作PCR扩增。

整个操作全过程能在显微镜直视下或显微电视监视下进行（图7-2）。

这种方法所需的设备较为简单，缺点为效率低，要收集较多的样本费时费力，且可能产生污染。

初学者可能要耗费相当多的时间，经过10至20例的实践之后才能在操作微吸管或者针头的速度和精度上达到协调[5]。

（二）激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）技术由美国NIH的Liotta等人研发的非接触性激光显微切割技术，使用红外激光束切割在薄膜下的组织或者细胞，产生的热量少，不会损伤组织的DNA、RNA 和蛋白质。

可以进行单个细胞、甚至染色体的切割。

系统由倒置显微镜、低能量红外激光器、摄像系统、样品收集系统和计算机等组成。

将热敏的乙酸乙烯薄膜覆盖在裱有组织切片的载玻片上，观察者在显微镜下发现需要的细胞后，用脉冲为5msec的激光束（100mJ～200mJ）照射需要的细胞群，温度可达到90°C。

薄膜受热而与下面的组织紧紧粘住，掀开薄膜就可将靶组织粘在薄膜上（图7-3）。

由于激光束产生的热量非常短暂，可迅速消散，所以不会破坏组织中的DNA、RNA和蛋白质。

激光束的直径可根据所需组织的大小从7.5µm到30µm可调[4,6]。

此种装置已经由Olympus公司生产，命名为LM200-Laser capture microdissection system。

由Leica公司研发的AS LMD显微切割系统是第三代激光显微切割系统。

它由自动显微镜、紫外激光器、摄像系统、样本收集系统和计算机组成。

经过硅化的玻璃载片上蒙上一层PEN薄膜，再裱上组织切片，经过染色（常规甲苯胺蓝染色或免疫组化染色）后，即可用于显微切割。

与NIH的方法不同的是，紫外激光（波长377nm）切割完所需组织或细胞的边界，带膜的组织即可由于重力的原因下落至玻片下的Eppendorf管中，实现真正的无污染切割和提取。

长焦距显微镜可以直接观察到切割下的组织在Eppendorf管中的存在（彩图7-1）。

整个操作可以在监视器上用光标进行，实现自动聚焦、自动切割和自动收集。

其切割精度可以达到单个细胞或者单个染色体。

由于其可以在荧光照射下工作，因此可用于FISH标本的显微切割。

五、显微切割技术的应用显微切割技术的应用日益广泛，主要是用于组织切片上特定组织和细胞的DNA、RNA和蛋白质的精确的、无污染的切割和分离。

切割的组织或细胞可用于DNA、RNA和蛋白质三个层面的研究。

（一）DNA水平DNA的克隆、定量PCR（real time PCR）、DNA文库的构建、Southern印迹杂交，DNA测序、X染色体灭活（X-chromosome inactivation）、比较基因组杂交（comparative genomic hybridization）、双脱氧指纹（dideoxy fingerprinting）和杂合缺失（loss of heterozygosity）等。

（二）RNA水平总RNA和polyA+RNA的分离、RT-PCR、cDNA文库的构建、Northern杂交和靶向分化显示（targeted differential display）等。

（三）蛋白质水平2D-SDS-PAGE、LC MS、免疫印迹、免疫组织化学、表面增强（surface enhanced）、激光解吸附（laser desorption）和离子化（ionization）等。

（四）显微切割技术应用的举例对于霍奇金病的R-S/H细胞的研究。

霍奇金病和一般的肿瘤在组织病理学上的不同在于肿瘤性的R-S/H细胞一般只占肿瘤组织的极少部分（<1%）并分布散在，其余是大量背景细胞，如小淋巴细胞、浆细胞、组织细胞和粒细胞等，这造成对于R-S/H细胞起源研究的困难和结果的混乱。

1993年德国病理学家Hansmann等人使用显微操作仪，从冰冻切片分离出霍奇金病的单个R-S/H细胞进行PCR，检测免疫球蛋白基因的重排，证实了R-S/H细胞实际上是分化上出现异常的B淋巴细胞[2,7]。

国内华西医大李甘地等人的研究进一步发现在R-S/H 细胞中存在免疫球蛋白lambda轻链的重排[8]而不存在T细胞受体基因重排（图7-2）[9]。

国内第四军医大学黄高升等人同样使用类似方法发现R-S/H细胞中存在巨细胞病毒DNA[10]。

NIH的Liotta等人用激光捕获显微切割方法用于研究胃癌进程中各种基因变化启动和持续的时间，并建立了来自同一病人正常胃粘膜上皮、不典型性增生上皮、原位癌和浸润癌的cDNA文库。

通过分析这些cDNA文库可以发现与肿瘤进程相关的基因或基因表达的模式[6]。

NIH的Fend等人报告应用激光捕获显微切割和基因重排等技术，对于3例组合性低度恶性的B细胞淋巴瘤的研究显示3例分别为套细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的组合中，存在双克隆性的免疫球蛋白重链基因重排并用测序加以证实。

这一发现说明，组合性淋巴瘤是由不相干的两个克隆性增生形成的，而使用常规的全组织切片提取DNA的方法则不能发现存在双克隆性的重链基因重排[11]。