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流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
流动注射分析仪试剂配制简表氰化物①0.025M氢氧化钠（载流和吸收液）1g氢氧化钠/升，脱气，保存在塑料瓶中，临用现配。
②缓冲溶液（PH=4.0）97g磷酸二氢钾/升，脱气。
③氯胺-T4g氯胺-T/升，脱气，保存在棕色瓶中，临用现配。
④异烟酸/巴比妥酸显色剂12g氢氧化钠、13.6g无水巴比妥酸、13.6g异烟酸逐一溶解于1升水中，使用国产异烟酸时溶液必须过滤。
⑤蒸馏试剂（PH=3.8）3.3g乙酸锌、13.21g酒石酸、3.5g氢氧化钠逐一溶解于1升水中。
总氰化物①0.025M氢氧化钠（载流和吸收液）1g氢氧化钠/升，保存在塑料瓶中，脱气，临用现配。
②缓冲溶液（PH=4.0）97g磷酸二氢钾/升，脱气。
③氯胺-T4g氯胺-T/升，脱气，保存在棕色瓶中，临用现配。
④异烟酸/巴比妥酸显色剂12g氢氧化钠、13.6g无水巴比妥酸、13.6g异烟酸逐一溶解于1升水中，使用国产异烟酸时溶液必须过滤。
⑤蒸馏试剂50ml磷酸/升。
挥发酚①蒸馏试剂300ml磷酸/升。
②4-氨基安替比林显色剂0.64g4-氨基安替比林/升，脱气，临用现配。
③铁氰化钾缓冲液（PH=10.3）2g铁氰化钾、3.1g硼酸、3.75氯化钾逐一溶解后加1.88g氢氧化钠，调节PH到10.3±0.1，定容到1升并脱气。
④载流去离子水，脱气。
阴离子表面活性剂①载流200ml甲醇/升，脱气。
②碱性硼酸钠28.6g硼酸钠、6g氢氧化钠溶解1升水中。
③亚甲基蓝储备液1.5g亚甲基蓝/升，过滤。
④亚甲基蓝中间液100ml亚甲基蓝储备液、100ml碱性硼酸钠加入到500ml分液漏斗中，再加入20ml 氯仿，震荡摇匀，静置分层，将氯仿放出，重复9次，再用30ml氯仿冲洗分液漏斗内壁，无需震荡，弃去氯仿即可。
将液体转移到一升容量瓶中，加入4ml 硫酸，定容到一升，过滤。
⑤碱性亚甲基蓝60ml亚甲基蓝中间液、200ml甲醇、200ml碱性硼酸钠到1升，脱气。
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 PBS 1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
流式常用试剂配制精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。
2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入 10％的NaN3。
3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA?Na2?2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。
4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至，使用前新鲜配制。
5、消化液：％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或％胰蛋白酶与％ EDTA的混合液。
6、红细胞裂解液：NH4Cl ，KHCO3 ，EDTA?2Na ，溶于100ml水中，调PH 至，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。
7、流式细胞抗体稀释剂：L PBS液（PH ）＋1％BSA＋％Na2N3。
8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH ）＋1％FBS（或BSA）＋％NaN3＋％saponin（Sigma的效果不错）。
9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、％NaN3的PBS（PH ）。
10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。
应用时，10倍稀释，每管加～ PI染液。
11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4?7H2O 2gKCl 8gMgCl?6H2O 2gCaCl2溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4?12H2OKH2PO4葡萄糖溶于800ml双蒸水2）％酚红溶液：取酚红置玻璃研钵中，逐滴加入 NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入 NaOH 10ml。
流式细胞仪检测常用试剂配制1．氯化铵溶血剂(Ammonium chloride lysing solution,)贮存液(10×)：80.2g NH4Cl (1.5M)8.4g NaHCO3(100mM)3.7g EDTA Na2(10mM)蒸馏水900 ml调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH)加蒸馏水至1升4℃保存6个月以内工作液(1×)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存注: 1) 贮存液不可小于10×, 否则会形成碳酸铵而失效2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代3) 有些科研工作者习惯采用1/10浓度的EDTA, 即 1mM EDTA Na2或0.32mM EDTA Na42．PBS(phosphate-buffered saline, 磷酸缓冲液)配制0.23 g NaH2PO4(无水; 1.9 mM)1.15 g Na2HPO4(无水; 8.1 mM)9.00 g NaCl (154 mM)加蒸馏水至 900 ml若需要, 用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4过滤除菌, 4℃保存注: 1) 不调pH值, pH通常约为7.32) 有些实验室将PBS配成 10×浓缩液, 用时稀释3．1% 多聚甲醛(paraformaldehyde)固定液配制0. 5g 多聚甲醛加至45ml蒸馏水中, 加4ml 10N的NaOH, 加温至65℃. 待粉末完全溶解(通常在30分钟以内)后, 加5ml10× PBS, 调节pH值至7.4, 0.2mm滤膜过滤除去未溶颗粒.注: 4℃可保存2周4．用氯化铵溶血剂的溶血方法1)100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀2) 避光孵育10~15分钟3) 离心, 去上清, PBS洗2次4) 抗体染色后, PBS洗5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2℃-直至上机检测5．血小板活化检测1. 先固定后染色1) 将100ml全血加入1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛中(100ml全血至少可做20tests)2) 2℃-8℃固定30分钟. (固定的血小板可保存5天)3) 抗体染色前, 1200g室温离心5分钟4) 去上清, PBS洗1次, 1ml PBS重悬5) 取50ml重悬液, 加适当抗体, 避光孵育15-20分钟6) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2oC-8oC避光30分钟, 但不可超过24小时2. 先染色后固定1) 5ml全血加入适当抗体, 避光孵育15-20分钟2) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2℃-8℃避光30分钟, 但不可超过24小时注: 1) 抗凝剂可选用EDTA或柠檬酸钠, 但不能用肝素, 因肝素对血小板有刺激活化的作用2) 染色或固定应在采血后10分钟内进行3) 先固定后染色可降低血小板的自发活化, 避免标本处理过程中的人为活化, 然而有些血小板活化抗原, 如PAC-1, CD62p等在固定剂的作用下会失活,造成表达率的降低, 因此需要先染色再固定4) 1987年 Shattil SJ等的经典方法：¨ 采血时掌心朝上，轻扎或不扎止血带，肘前静脉采血。
流式细胞仪标本的制备(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。
2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(四)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaN３50ml (终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaN３0.2g (终浓度0.02％)间接抗体的对照问题：间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106 细胞／ml )，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
流式细胞操作步骤：
1.制备脾细胞悬液1 107/ml
2.每个流式管（即样品）放入100ul 细胞悬液
3.每个样品中加入2ul CD4及5ul CD5 ，避光孵育30分钟
4.洗涤：每个样品中加入2ml的流式缓冲液，1200rpm下离心7分
钟，弃上清后漩涡混匀，再重复洗涤一次，共两次
5.每个样品中加入1ml Foxp3 固定/渗透液，混匀后4℃过夜
6.每个样品中加入2ml流式缓冲液
7.室温下1200rpm离心（400g×5min），弃上清
8.重复步骤（6），（7）
9.每个样品中加入小鼠血清2ul，室温下孵育15分钟
10.每个样品中加入2.5ul的Foxp3抗体，室温下孵育30分钟，并用
PE Rat IgG2a在平行管中空白对照
11.每个样品中加入2ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心（400g×
5min），弃上清
12.重复步骤（11）
13.每个样品中加400ul流式缓冲液，上机。
一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。
2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。
3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA?Na2?2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。
4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。
5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。
6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA?2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。
7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。
8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。
9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。
10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。
应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。
11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4?7H2O 2gKCl 8gMgCl?6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4?12H2O 3.04gKH2PO4 1.2g葡萄糖20.0g溶于800ml双蒸水2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入0.1N NaOH 10ml。
一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。
2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入10％的NaN3。
3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA?Na2?2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。
4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至，使用前新鲜配制。
5、消化液：％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或％胰蛋白酶与％EDTA的混合液。
6、红细胞裂解液：NH4Cl ，KHCO3 ，EDTA?2Na ，溶于100ml水中，调PH至，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。
7、流式细胞抗体稀释剂：L PBS液（PH ）＋1％BSA＋％Na2N3。
8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH ）＋1％FBS（或BSA）＋％NaN3＋％saponin（Sigma 的效果不错）。
9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、％NaN3的PBS（PH ）。
10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。
应用时，10倍稀释，每管加～PI染液。
11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4?7H2O 2gKCl 8gMgCl?6H2O 2gCaCl2溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4?12H2OKH2PO4葡萄糖溶于800ml双蒸水2）％酚红溶液：取酚红置玻璃研钵中，逐滴加入NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入NaOH 10ml。
将溶解的酚红吸入100ml量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留的酚红液，并入量瓶中，最后补加双蒸水至100ml。
将1）液和2）液混合，补加双蒸水至1000ml即为原液B。
应用液：原液A 1份原液B 1份双蒸水18份混合后，分装于200ml小瓶中，高压灭菌。
临用前用无菌的％NaHCO3调PH至～。
12、磷酸盐缓冲液的配制（PB）A液（L NaH2PO4水溶液）：NaH2PO4?H2O ，溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。
B液（L Na2HPO4水溶液）：Na2HPO4?7H2O 加蒸馏水溶解，加水至1000ml。
不同PH值PB的配制：A液xml（参照下表）中，加入B液yml，为L的PB。
若再加蒸馏水至200ml，则成L PB。
PH x/ml y/ml13、PBS的配制配制PBS，只要在相应的PB基液中加入L NaCl即可。
二、常用激活剂1、激活剂PMA：用DMSO配制成ml，分装20ul/管，－20度保存。
勿反复融冻。
实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液，终浓度为20ng/ml。
2、激活剂离子霉素：用乙醇配制成浓度为ml的储存液，－20度保存。
实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，终浓度为1ug/ml。
3、Staphylococcal enterotoxin B(SEB) ：用无菌无叠氮钠PBS调节浓度mL，4℃储存，SEB 终浓度10ug/mL。
4、CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。
5、CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml。
6、阻断剂Bregeldin A：用DMSO配制成浓度为5mg/ml的储存液，分装20ul/管，－20度保存。
勿反复融冻。
实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，在激活过程最后4～5小时使用BFA，终浓度为10ug/ml。
7、阻断剂莫能菌素：用DMSO配制成浓度为1mg/ml的储存液，4℃储存至少4个月，实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，终浓度为2umol/L。
三、常用抗体标记荧光染料的特性及其应用1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）可用于荧光显微镜技术4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。
2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。
3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。
4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL4通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。
5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。
5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。
6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）荧光强度高；3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）不易湮灭；3)可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
9、PE-Cy5：激发波长488nm，最大发射波长670nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；4)可与FITC、PE搭配，荧光干扰小、补偿小，但不宜与APC搭配。
5）与单核细胞和粒细胞非特异性结合多。
10、：激发波长488nm，最大发射波长694nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；4)可与FITC、PE、APC搭配，荧光干扰小、补偿小，是APC比较理想的搭配。
11、PE-Alexa Fluor 700：激发波长488nm，最大发射波长723nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）光淬灭性很强，要绝对避光。
12、PE-Cy7：激发波长488nm，最大发射波长767nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）光淬灭性很强，要绝对避光；4）可与FITC、PE搭配，与FITC无光谱重叠，与APC搭配荧光干扰小，补偿小，是比较理想的搭配。
13、TR：激发波长595nm，最大发射波长615nm。
1）其标记的抗体适用于配备Texas Red激光器的流式细胞仪；2）荧光不易淬灭，可用于荧光显微镜。
14、APC：激发波长633/635nm，最大发射波长660nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪；2）在BD细胞仪的FL4通道检测，在Beckman Coulter细胞仪只有配备双激光器的FC500才能检测到。
15、：激发波长633/635nm，最大发射波长668nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪；2）主要用于四色以上的流式细胞术。
16：PerCP：激发波长488nm，最大发射波长677nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）可于FITC、PE搭配，荧光光谱重叠少，对随细胞的特异性结合少，但量子产量较低，适用于较高表达物的检测。
