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双向凝胶电泳实验方法实验方案1.样品制备(Sample preparation)1.1仪器高速离心机1.2试剂NS(制备好的);Citrated human plasma ;溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法1).吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37°下孵化5min。
NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。
2)孵化后，将样品高速离心，离心转速为，时间为。
3)除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。
4)将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。
2.第一相等电聚焦(IEF)2.1固定化 pH 剃度胶条的水化(IPG strip rehydration) 2.1.1仪器IPGphor2.1.2试剂水化液(8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液) 水化液需当天新鲜配制2.1.3实验步骤A. 加样品溶涨1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。
蛋白质上样浓度(Q:如何确定上样浓度,)不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
表1 IPG胶条所需水化液体积3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。
双向电泳一、材料样品：人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH二、试剂SDS-PAGE所需试剂1、30％Acry-Bis (w/v)29.2％Acry 29.2g0.8％Bis 0.8g加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，PH<7，数月后重配2、10％的SDS贮液(w/v)RT保存，因SDS在4℃会析出3、Tris-HCl buffer①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer100ml含Tris 18.171g，加DDW至80ml，用浓HCl调PH8.8，再定容至100ml，4℃保存②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer：50ml 含Tris 6.057g，加DDW至40ml，用浓HCl调PH6.8，再定容至50ml，4℃保存4、TEMED以游离碱形式发挥作用，催化AP形成自由基，故PH较低时，聚合反应受抑制，易吸湿，被氧化，从无色变为黄色，故因密闭4℃保存5、10％AP1g的AP溶于10ml水中，4℃保存，隔周新鲜配置6、PH8.3 电泳缓冲液1L，RT保存终浓度Tris碱3g 250mMGly（25.05）14.4g 250mMSDS 1g 0.1% (192mM)加水至1L，可不调PH7、甘油液4℃31ml丙三醇 5.5mlDDW 25.5ml8、考马斯亮蓝染液CBB （RT，50%甲醇+冰醋酸+R250）总体积100ml 终浓度甲醇Methanal 45ml 45%水45ml冰醋酸10ml 10%R250 0.25g 0.1%改进：（0.12% G250, 10% (NH4)2SO4, 10% H3PO4, 20% 甲醇）100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状(NH4)2SO4（边搅拌边加）先溶解，然后加入1.2g G250再溶解（不能真正溶解），定容至800ml，边搅拌边加200ml甲醇，终体积1000ml（可至少保存半年）。
2-D Protocol一、蛋白提取（一）TCA/acetone buffer提取法（1）加入1mL 10%TCA/丙酮(w/v)溶液，混匀，4°C中沉淀1h；（2）17000g，4°C 离心30min，去上清（取沉淀）；（3）加入1mL 含20 mM DTT 的20%TCA/丙酮(w/v)溶液，超声波破碎，每次2s，间隙3s，破碎时间2min，静置于4°C中30min；（4）17000g，4°C离心30min，去上清（取沉淀）；（5）上述沉淀用80%丙酮with 20 mM DTT 洗2-3 次。
每次加入1 mL ，4°C 中静置30min 后17000g，4°C 离心30min，取沉淀；（6）上述沉淀用100%丙酮with 20 mM DTT 洗1-2 次。
每次加入1 mL，4°C 中静置30min后17000g，4°C 离心30min，取沉淀；（7）沉淀干燥后，重新溶解于溶胀液。
（二）Lysis-buffer 提取法（1）2⨯106个藻细胞中加入0.5mL Lysis-buffer（7M urea, 2M Thiourea, 2% CHAPS （w/v），2% Triton-X100（v/v）, 1% DTT(w/v)，2% carrier ampholytes, 1% protease inhibitor），超声波破碎，每次2s，间隙3s，破碎时间2-3min（冰浴，破碎前先用70%乙醇清洗探头，破碎后镜检观察破碎率）；（2）至少17000g ，6 ︒C离心30min（注：低于该温度会出现结晶现象）；（3）将上清转移至干净的离心管，加入1.5mL 20%TCA/丙酮(w/v)，混匀，静置于4︒C中至少30min ；（4）至少17000g ，4︒C离心30min，去上清；（5）上述沉淀用含20 mM DTT的100%丙酮洗3次。
双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。
3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。
参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。
用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。
离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。
置于冰上裂解2h。
13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。
用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。
3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。
1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。
加入300μL沉淀剂。
振荡或倒置搅匀。
冰浴中（4~5℃）培育15min。
2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。
3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。
保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。
后离心5min，去上清。
4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。
将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。
在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。
-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。
5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。
小心地将上清液移走弃去。
此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。
6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。
振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。
双向凝胶电泳（2-DE）双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
双向电泳所需试剂配方及器材清单附录Ⅰ溶液配制1. 100 mmol/L PMSF母液PMSF 0.087g异丙醇5ml使用前配制，4℃保存。
2. 10%（w/v）TCA/丙酮提取液TCA 10 g丙酮100 mlPMSF 1mmol/L 1ml母液（用前现加）DDT 0.1%（w/v）0.1g （用前现加）TCA和丙酮使用前配制，棕色瓶中-20℃预冷至少2h。
3. 80%丙酮洗液丙酮80mlddH20 20mlPMSF 1mmol/L 1ml母液（用前现加）DDT 0.1%（w/v）0.1g （用前现加）丙酮和ddH20使用前配制，棕色瓶中-20℃预冷至少2h。
4.水化液尿素7mol/L硫脲2mol/LCHAPS 4%（w/v）DDT 65mmol/L （用前现加）Biolyte (pH3-10) 0.3%（v/v）（用前现加）用容量瓶定容后分装后在-20℃保存，用前室温溶解。
5.蛋白浓度测定（1）1mg/ml BSA配制在1ml水化液中加入0.01g BSA为10x浓缩液，再将其稀释10倍。
（2）考马斯亮蓝G-250溶液100mg G-250溶于50ml 95%乙醇，再加入120ml 85%磷酸，于容量瓶中定容至1L。
室温保存，用前过滤。
（3）标准曲线建立按下表中数值配制建立标准曲线所需的各个溶液对照 1 2 3 4 5 6 BSA水化液（μl）0 10 20 40 60 80 100 水化液（μl）100 90 80 60 40 20 0 BSA浓度（μg/μl）0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 G-250染液（ml） 5 5 5 5 5 5 56. 1%溴酚蓝母液溴酚蓝1%Tris 50mmol/L用容量瓶定容后在4℃保存。
7. SDS-PAGE 12%分离胶的配制试剂体积（volume）（reagent）30%（w/v）丙烯酰胺（acrylamide）66.7ml和0.8%（w/v）甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）1.5 mol/L Tris-HCl,pH8.8 40.0mL去离子水（ddH2O）50.1mL10%十二烷基磺酸钠（SDS） 1.6mL四甲基乙二胺（TEMED）35.0μL10%过硫酸氨（APS） 1.6mL共计(Total) 160.0mL8. 12.5% 丙烯酰胺凝胶配制ddH20 62.7ml30% 丙烯酰胺83.3ml1.5M Tris- HCl pH8.8 50ml10% SDS 2ml10% APS 2mlTEMED 35.6μl共计200ml其中APS在加入前配制成溶液后再加入到全部溶液中。
双向试剂第一向等电聚焦：胶条、水化液、矿物油。
第二向SDS PAGE：30% Acrylamide/Bis Solution,37.5:1,10% (w/v)SDS Solution, 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8，Ammonium Persulfate，TEMED,Tris/Glycine/SDS。
染色：考马斯亮蓝染色。
双向电泳中溶液配制水化上样缓冲液（I）：尿素8M 4.805gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
（一般推荐先用这个）水化上样缓冲液（II）：尿素7M 4.2g硫脲2M 1.52gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
水化上样缓冲液（III）：尿素5M 3.0g硫脲2M 1.52gCHAPS 2% 0.2gSB 3-10 2% 0.2gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液母液：尿素6M 36gSDS 2% 2gTris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl）甘油20% 20mlMilliQ水定容至100ml；分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液I：胶条平衡缓冲液母液10mlDTT 0.2g 充分混匀，用时现配。
用户需要准备事项
1.确定电源接地
2.单蒸水
3.操作环境：15–30 °C ±2 °C
4.操作环境湿度要求：相对湿度0–70%*
5.大量筒或烧杯 ( 1L, 500ml,250ml,50ml)
6.去离子水或MilliqQ水
7.提前购买染胶的盒子（30×20cm，最好有盖子）
如需实验：准备样品和如下试剂。
附录 I 溶液
注意请按照实验所需量酌量或减量配制
A. 双向电泳的样品裂解溶液(含有尿素)
（8 M尿素，4% CHAPS，2%两性载体Pharmalyte或IPG缓冲液(载体两性电解质)，40 mM DTT, 25 ml）
最终浓度用量
尿素(FW 60.06) 8 M 12 g
CHAPS 4% (w/v) 1.0 g
两性载体Pharmalyte 或IPG缓冲液(现用现加) 2% (v/v) 500 µl
DTT (FW 154.2) 40 mM 154 mg
双蒸水—至25 ml (需要水约16ml) 分装为 1.0 ml溶液储存于-20℃条件下。
IPG buffer和DTT现用现加。
酌情增减使用量,每个样品使用约1ml. (本次培训需要5ml)
B. 尿素水化储备溶液
（8 M尿素，2% CHAPS，0.5/2%两性载体Pharmalyte或IPG缓冲液，0.002%溴酚蓝, 25 ml）*
最终浓度用量
尿素(FW 60.06) 8M 12g
CHAPS 2%(w/v) 0.5g
0.5%(v/v) 125µl
两性载体Pharmalyte或 IPG缓冲液(与IPG胶
条的范围相同)(现用现加)
1%溴酚蓝储备溶液0.002% 50µl
双蒸水—至25ml(需要水约16ml) 分装为1.0ml溶液储存于-20 ℃条件下。
每个样品使用约1ml. (本次培训需要5ml)
使用前加入DTT和IPG buffer，每1.0ml水化储备溶液中加入2.8mgDTT。
载体两性电解质或IPG缓冲液现用现加。
C. SDS平衡缓冲液
(6 M尿素，75 mM Tris-HCl pH8.8,29.3%甘油, 2%SDS,0.002%溴酚蓝,200ml)*
最终浓度用量
尿素(FW 60.06) 6 M 72.1 g
Tris-HCl, pH 8.8 (参见溶液F部分) 75 mM 10.0 ml
甘油(87% w/w) 29.3% (v/v) 69 ml (84.2 g)
SDS (FW 288.38) 2% (w/v) 4.0 g
1%溴酚蓝储备溶液0.002% (w/v) 400 µl
双蒸水—至200 ml
这是储备溶液。
在使用之前，按照一定量加入1%DTT（100mg/10ml）或2.5%碘乙酰胺（250mg/10ml），分别用于第一次和第二次平衡。
Max用量 10ml/胶条。
分装为20或50ml溶液储存于-20℃条件下。
（本次培训需要100ml）
D. 10× Laemmli SDS电泳缓冲液
(250 mM Tris碱，1.92M甘氨酸，1% SDS，10L)*
最终浓度用量
Tris碱(FW 121.1) 250 mM 303 g
甘氨酸(FW 75.07) 1.92 M 1441 g
SDS (FW 288.38) 1% (w/v) 100 g
双蒸水—至10L
* 不要调节该溶液的pH值。
室温条件下储存。
根据不同型号二向电泳槽，根据电泳槽规格每次实验用量1× Laemmli SDS电泳缓冲液1-10L。
（本次培训配制1L，用量分别为Tris 30.3g, 甘氨酸144.1g, SDS 10g,溶解在1L水里）
E. 30% T, 2.6% C单体储液
(30%丙烯酰胺，0.8% N, N’-甲叉双丙烯酰胺，500ml)
最终浓度用量
丙烯酰胺(FW 71.08) 30% 150 g
N,N’-甲叉双丙烯酰胺(FW 154.17) 0.8% 4 g
双蒸水—至500mL
用0.45μm滤膜过滤溶液，4℃避光储存。
F. 4×分离胶缓冲液
(1.5M Tris碱，pH8.8，500mL)
最终浓度用量
Tris碱(FW 121.1) 1.5 M 90.8g
双蒸水—375 ml
HCl —调至pH8.8
双蒸水—至500mL
用0.45μm滤膜过滤溶液，4℃存储。
G．溴酚蓝储备溶液
最终浓度用量
溴酚蓝1% 100 mg
Tris-碱50 mM 60 mg
双蒸水—至10 mL
H. 10% SDS溶液
(10% SDS, 50 ml)
最终浓度用量
SDS (FW 288.38) 10% (w/v) 5.0 g
双蒸水—至50 ml
用0.45μm滤膜过滤溶液，室温存储。
I. 10%过硫酸铵溶液
(10%过硫酸铵, 10 ml和1 ml)
最终浓度10 ml的用量 1 ml的用
量
过硫酸铵(FW 228.20) 10% (w/v) 1.0 g 0.1 g
双蒸水—至10 ml 至1 ml
新鲜的过硫酸铵在加入水时发出“劈啪”声，若没有声音，请更换过硫酸铵。
在用前配制。
J. 琼脂糖密封液
(25mM Tris碱, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 0.5%琼脂糖, 0.002% 溴酚蓝, 10ml)
最终浓度用量
10 ml
Laemmli电泳缓冲液（见
溶液D）
琼脂糖(NA 或M) 0.5% 0.05 g
1%溴酚蓝储备溶液0.002% (w/v) 20 µl
将所有成分加入到100ml 的烧瓶中。
轻轻地摇晃，使成分混匀。
加热直至琼脂糖完全溶解。
不要让溶液爆沸。
以1.5ml为单位分装至带有螺旋帽的管内，室温保存。
K. 水饱和正丁醇
用量
n, i, or t-butanol 50 ml50 ml
Distilled or deionized water 10ml
Combine in a bottle and shake,use the top phase to overlay gels. Store at room temperature indefinitely.
配12％的分离胶，按下表加入各组分。
一块胶需50ml胶液，两块胶需90ml胶液。
12%SDS－PAGE（单位：ml） 5 10 15 20 25 30 40 50 水 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5 30%丙烯酰胺溶液 2 4 6 8 10 12 16 20
1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3
2.5
3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02。
