双向电泳所需试剂

双向凝胶电泳实验方法实验方案1.样品制备(Sample preparation)1.1仪器高速离心机1.2试剂NS(制备好的);Citrated human plasma ;溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法1).吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37°下孵化5min。

NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。

2)孵化后，将样品高速离心，离心转速为，时间为。

3)除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。

4)将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。

2.第一相等电聚焦(IEF)2.1固定化 pH 剃度胶条的水化(IPG strip rehydration) 2.1.1仪器IPGphor2.1.2试剂水化液(8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液) 水化液需当天新鲜配制2.1.3实验步骤A. 加样品溶涨1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。

蛋白质上样浓度(Q:如何确定上样浓度,)不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。

2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。

表1 IPG胶条所需水化液体积3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。

双向电泳一、材料样品：人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH二、试剂SDS-PAGE所需试剂1、30％Acry-Bis (w/v)29.2％Acry 29.2g0.8％Bis 0.8g加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，PH<7，数月后重配2、10％的SDS贮液(w/v)RT保存，因SDS在4℃会析出3、Tris-HCl buffer①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer100ml含Tris 18.171g，加DDW至80ml，用浓HCl调PH8.8，再定容至100ml，4℃保存②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer：50ml 含Tris 6.057g，加DDW至40ml，用浓HCl调PH6.8，再定容至50ml，4℃保存4、TEMED以游离碱形式发挥作用，催化AP形成自由基，故PH较低时，聚合反应受抑制，易吸湿，被氧化，从无色变为黄色，故因密闭4℃保存5、10％AP1g的AP溶于10ml水中，4℃保存，隔周新鲜配置6、PH8.3 电泳缓冲液1L，RT保存终浓度Tris碱3g 250mMGly（25.05）14.4g 250mMSDS 1g 0.1% (192mM)加水至1L，可不调PH7、甘油液4℃31ml丙三醇 5.5mlDDW 25.5ml8、考马斯亮蓝染液CBB （RT，50%甲醇+冰醋酸+R250）总体积100ml 终浓度甲醇Methanal 45ml 45%水45ml冰醋酸10ml 10%R250 0.25g 0.1%改进：（0.12% G250, 10% (NH4)2SO4, 10% H3PO4, 20% 甲醇）100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状(NH4)2SO4（边搅拌边加）先溶解，然后加入1.2g G250再溶解（不能真正溶解），定容至800ml，边搅拌边加200ml甲醇，终体积1000ml（可至少保存半年）。

2-D Protocol一、蛋白提取（一）TCA/acetone buffer提取法（1）加入1mL 10%TCA/丙酮(w/v)溶液，混匀，4°C中沉淀1h；（2）17000g，4°C 离心30min，去上清（取沉淀）；（3）加入1mL 含20 mM DTT 的20%TCA/丙酮(w/v)溶液，超声波破碎，每次2s，间隙3s，破碎时间2min，静置于4°C中30min；（4）17000g，4°C离心30min，去上清（取沉淀）；（5）上述沉淀用80%丙酮with 20 mM DTT 洗2-3 次。

每次加入1 mL ，4°C 中静置30min 后17000g，4°C 离心30min，取沉淀；（6）上述沉淀用100%丙酮with 20 mM DTT 洗1-2 次。

每次加入1 mL，4°C 中静置30min后17000g，4°C 离心30min，取沉淀；（7）沉淀干燥后，重新溶解于溶胀液。

（二）Lysis-buffer 提取法（1）2⨯106个藻细胞中加入0.5mL Lysis-buffer（7M urea, 2M Thiourea, 2% CHAPS （w/v），2% Triton-X100（v/v）, 1% DTT(w/v)，2% carrier ampholytes, 1% protease inhibitor），超声波破碎，每次2s，间隙3s，破碎时间2-3min（冰浴，破碎前先用70%乙醇清洗探头，破碎后镜检观察破碎率）；（2）至少17000g ，6 ︒C离心30min（注：低于该温度会出现结晶现象）；（3）将上清转移至干净的离心管，加入1.5mL 20%TCA/丙酮(w/v)，混匀，静置于4︒C中至少30min ；（4）至少17000g ，4︒C离心30min，去上清；（5）上述沉淀用含20 mM DTT的100%丙酮洗3次。

双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。

这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。

其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。

2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。

(测量过程要在一个小时内完成)。

3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。

在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。

3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。

3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。

参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。

用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。

离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。

置于冰上裂解2h。

13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。

用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。

3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。

1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。

加入300μL沉淀剂。

振荡或倒置搅匀。

冰浴中（4~5℃）培育15min。

2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。

3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。

保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。

后离心5min，去上清。

4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。

将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。

在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。

-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。

5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。

小心地将上清液移走弃去。

此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。

6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。

振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。

双向凝胶电泳（2-DE）双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。

分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。

在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。

80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。

由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。

此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。

这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。

第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。

其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。

用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。

蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。

最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。

现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。

双向电泳所需试剂配方及器材清单附录Ⅰ溶液配制1. 100 mmol/L PMSF母液PMSF 0.087g异丙醇5ml使用前配制，4℃保存。

2. 10%（w/v）TCA/丙酮提取液TCA 10 g丙酮100 mlPMSF 1mmol/L 1ml母液（用前现加）DDT 0.1%（w/v）0.1g （用前现加）TCA和丙酮使用前配制，棕色瓶中-20℃预冷至少2h。

3. 80%丙酮洗液丙酮80mlddH20 20mlPMSF 1mmol/L 1ml母液（用前现加）DDT 0.1%（w/v）0.1g （用前现加）丙酮和ddH20使用前配制，棕色瓶中-20℃预冷至少2h。

4.水化液尿素7mol/L硫脲2mol/LCHAPS 4%（w/v）DDT 65mmol/L （用前现加）Biolyte (pH3-10) 0.3%（v/v）（用前现加）用容量瓶定容后分装后在-20℃保存，用前室温溶解。

5.蛋白浓度测定（1）1mg/ml BSA配制在1ml水化液中加入0.01g BSA为10x浓缩液，再将其稀释10倍。

（2）考马斯亮蓝G-250溶液100mg G-250溶于50ml 95%乙醇，再加入120ml 85%磷酸，于容量瓶中定容至1L。

室温保存，用前过滤。

（3）标准曲线建立按下表中数值配制建立标准曲线所需的各个溶液对照 1 2 3 4 5 6 BSA水化液（μl）0 10 20 40 60 80 100 水化液（μl）100 90 80 60 40 20 0 BSA浓度（μg/μl）0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 G-250染液（ml） 5 5 5 5 5 5 56. 1%溴酚蓝母液溴酚蓝1%Tris 50mmol/L用容量瓶定容后在4℃保存。

7. SDS-PAGE 12%分离胶的配制试剂体积（volume）（reagent）30%（w/v）丙烯酰胺（acrylamide）66.7ml和0.8%（w/v）甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）1.5 mol/L Tris-HCl,pH8.8 40.0mL去离子水（ddH2O）50.1mL10%十二烷基磺酸钠（SDS） 1.6mL四甲基乙二胺（TEMED）35.0μL10%过硫酸氨（APS） 1.6mL共计(Total) 160.0mL8. 12.5% 丙烯酰胺凝胶配制ddH20 62.7ml30% 丙烯酰胺83.3ml1.5M Tris- HCl pH8.8 50ml10% SDS 2ml10% APS 2mlTEMED 35.6μl共计200ml其中APS在加入前配制成溶液后再加入到全部溶液中。

双向试剂第一向等电聚焦：胶条、水化液、矿物油。

第二向SDS PAGE：30% Acrylamide/Bis Solution,37.5:1,10% (w/v)SDS Solution, 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8，Ammonium Persulfate，TEMED,Tris/Glycine/SDS。

染色：考马斯亮蓝染色。

双向电泳中溶液配制水化上样缓冲液（I）：尿素8M 4.805gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。

（一般推荐先用这个）水化上样缓冲液（II）：尿素7M 4.2g硫脲2M 1.52gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。

水化上样缓冲液（III）：尿素5M 3.0g硫脲2M 1.52gCHAPS 2% 0.2gSB 3-10 2% 0.2gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液母液：尿素6M 36gSDS 2% 2gTris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl）甘油20% 20mlMilliQ水定容至100ml；分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液I：胶条平衡缓冲液母液10mlDTT 0.2g 充分混匀，用时现配。

双向电泳完整操作流程仪器：Eppendorf 冷冻离心机 (Eppendorf)、Beckman Coulter 高速冷冻离心机（Beckman Coulter）、IPGhor 等电聚焦仪（GE Healthcare）、DALT-SIX SDS-PAGE电泳仪（GE Healthcare）、ImageScanner扫描仪（GE Healthcare）、ImageMaster 2D Platinum 7.0分析软件（GE Healthcare）、电子天平、分光光度计、旋涡混和器、PH计、真空冷冻干燥机、液氮、离心管、研钵主要溶液配置：三氯乙酸-丙酮沉淀液：10%三氯乙酸、0.07%巯基乙醇溶于100%丙酮丙酮洗涤液：0.07%巯基乙醇溶于丙酮样品裂解液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT样品水化液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT、少量溴芬兰定量染色液：0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和4.75%乙醇标准蛋白溶液：1mg/ml牛血清蛋白平衡缓冲液1：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，1%DTT，痕量溴酚兰平衡缓冲液2：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，4%碘乙酰胺，痕量溴酚兰12%SDS-PAGE凝胶溶液：12%丙烯酰胺、0.32%双丙烯酰胺、0.375mol/L Tris-HCL（pH=8.8）、0.1%SDS、0.05%过硫酸铵、0.05%TEMED 电泳缓冲液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS封胶液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS、0.5%琼脂糖考染固定液：12%（W/V）三氯醋酸考染染色液：0.12%G-250、10%（NH4）2SO4、10% H3PO4、20%甲醇。

双向电泳实验过程及相关溶液配置一、实验过程1、蛋白质干粉的制备（酚抽法）约1g材料置于液氮中研磨，向研钵中加入4ml提取液，待其熔化后，继续研磨数分钟，转移至离心管中（离心管容量依具体情况而定），加入等体积的pH8.0Tris-饱和酚，涡旋，离心（10000r/min，4℃）10min。

取酚层，加入6倍体积0.1mol/L乙酸铵甲醇溶液，－20℃沉淀2h以上。

离心（15000r/min，4）20min，弃上清液，沉淀用－20℃预冷甲醇洗涤1次，再以丙酮（含2％β－巯基乙醇，－20℃预冷）洗涤2次，－20度干燥，所得干粉置－20度保存待用。

2、样品的溶解取蛋白干粉10mg于1.5ml的离心管中，加入200－250ml裂解液（先加100-200ul左右，用小棒研磨后，再逐次加入余量裂解液，冲洗小棒），振荡1min左右，于35℃水浴2.5小时，15000rpm离心15min，取上清液作为实验备用。

3、Bradford法测蛋白含量1)、将牛血清白蛋白(BSA)配成1mg/ml的溶液贮存于4℃冰箱2)、设7个浓度梯度制作标准曲线，每个梯度设3个重复，依下表加入1mg/ml BSA、Lysis buffer、ddHO。

(均使用10ml离心管)2管号 1 2 3 4 5 6 71mg/ml BSA(ul) 0 10 20 30 40 50 60 Lysis buffer(ul) 20 20 20 20 20 20 20 ddHO(ul) 980 970 960 950 940 930 920 2BSA含量(ug) 0 10 20 30 40 50 603)、每管加入5ml Bradford工作液，摇匀，5min后测波长595nm下的吸光值。

测定过程中，每测完1管，比色皿用95%乙醇冲洗后再用蒸馏水冲洗3次，然后取少量下1管的溶液润洗比色皿2次。

关系的标准曲线方程式：4)、制作BSA含量与OD595Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。

A. 裂解液 (lysis solution) (8M Urea, 4%CHAPS, 2% Pharmalyte3-10, 40 ml)Final concentrationAmountUrea(Fw60.06)8M19.2gCHAPS4%(w/v)1.6gPharmalyte3-102%800μlDouble distilledH2OTo 40ml新鲜配制或者分装贮存于-20℃ ① 如果需要，尿素的浓度可以调高到 9或者9.8M，也可用 7M Urea，2M Thoiurea。

②其他的去垢剂(如 Triton X-100，NP-40，还有其它的非离子去垢剂或者双性离子去垢剂)可以取代 CHAPS。

③如果需要，蛋白质酶的抑制剂和或者还原剂可以加入。

B.水化液 (不含有 IPG buffer, Rehydration stock solution without IPG buffer) (8M Urea, 2% CHAPS, bromophenol blue,25ml)Final concentrationAmountUrea (FW60.06)12g12gCHAPS2%(w/v)0.5gBromophenol blue0.002%(w/v)50μlDouble distilled H2OTo 25ml分装贮存于-20℃ ①DTT和 IPG buffer在用之前加入：每 2.5ml 水化液加 7mg DTT。

如果胶内上样，则样品液在用之前加入到 2.5ml的水化液中。

②如果需要，尿素的浓度可以调高到 9或者 9.8M。

③其他的去垢剂(如 Triton X-100，NP-40，还有其它的非离子去垢剂23或者双性离子去垢剂)可以取代 CHAPS。

Final concentrationAmount溴酚蓝储液Bromophenolblue1%100mgTris-base50mM60mgDouble distilled H2OTo 10mlC. 水化液 (含有 IPG buffer，Rehydration stock solution with IPG buffer) (8M Urea，2% CHAPS，0.5% or 2% IPG buffer，bromophenol blue，25ml)Final concentrationAmountUrea (FW 60.06)8M12gCHAPS2%(w/v)0.5gIPG buffer(same pH range as the IPG strip)0.5%or 2%(v/v)125 or500μltd>Bromophenol blue0.002%(w/v)50μl 1% solutionDouble distilled H2OTo 25ml分装贮存于-20℃ ①DTT和 IPG buffer在用之前加入：每 2.5ml 水化液加 7mg DTT。

细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。

Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06)5M3g硫脲(MW 76.12) 2M1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1）40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g95%乙醇 4.7% 50mlH3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100ml H3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。

膜蛋白提取试剂盒（双向电泳用）产品组成：产品组成 BB-3188-1 BB-3188-2规格 50T 100T试剂A 10ml 20ml试剂B 20ml 40ml试剂C 10ml 20ml蛋白酶抑制剂混合物 250μl 500μl储存条件：蛋白酶抑制剂-20℃保存；蛋白提取液A和B 2-8℃保存；试剂C室温保存。

有效期：一年。

产品简介：哺乳动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。

膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。

传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。

去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而妨碍了膜蛋白的功能研究。

贝博双向电泳膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从细胞和动物组织提取双向电泳用膜蛋白样品。

提取过程简单方便，可在1小时内完成。

提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。

提取的蛋白可直接用于双向电泳蛋白研究。

使用方法：A．细胞蛋白提取1.取5-10×106个以上细胞①，在4℃，500g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

2.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3.细胞样品中加入200μl冷的试剂A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10-15分钟。

4.再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，13000×g条件下离心5分钟。

5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，37℃水浴5-10分钟，37℃下②1000g力离心3分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白部分约为20μl。

6.移除上层溶液和界面层，收集下层膜蛋白样品。

一般可直接跳过步骤7和步骤8直接进行步骤9，如果对膜蛋白样品纯度要求极高，可以进行步骤7或者步骤7和8，此时膜蛋白回收率会稍有降低。

7.用150-200μl冰冷的试剂B稀释下层膜蛋白样品，混匀后冰浴2min，37℃水浴5-10分钟，37℃下②1000g力离心3分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白部分约为20μl。

双向电泳实验过程及相关溶液配置A．实验过程一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。

这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、实验步骤：1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul 裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。

其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。

2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。

(测量过程要在一个小时内完成)。

例如：编号蛋白量（ul） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595值1 0 80 4 02 5 75 4 0.0243 10 704 0.0614 15 65 4 0.0915 20 60 4 0.116Bt4 2 78 4 0.079Bt4 4 76 4转Bt4 2 78 4 0.075转Bt4 4 76 4标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。

a、b通过作图输入数据可知相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得OD值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。

蛋白双向电泳样品制备原则样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响2-DE结果好坏。

目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。

当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。

样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。

通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。

在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。

大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条，这样都会造成2-DE的失败。

样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D胶上。

脂类和多糖都可以通过超速离心除去。

透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。

因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。

目前有很多方法适于2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等）。

一、细胞样品1.细胞培养，加药与处理。