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不同程度低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和HIF-1αmRNA表达的影响张昱;黄以哲;刘瑞欣;张伟【期刊名称】《青海医学院学报》【年(卷),期】2013(034)002【摘要】目的探讨不同低氧环境对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖和HIF-1α mRNA表达的影响.方法采用原代培养大鼠PASMCs,分别在常氧、低氧(10% O2,85% N2,5% CO2)和缺氧(1% O2,94% N2,5% CO2)条件下进行培养,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖水平,通过不同低氧环境培养48 h 后,用RT-PCR检测PASMCs HIF-1α mRNA表达水平.结果连续7 d MTT监测结果表明,低氧组细胞的生长和常氧组相比无显著性差异.缺氧组的PASMCs 2 d后明显增殖,与常氧组相比有显著性差异(P＜0.01),5 d后细胞数达到顶峰,6 d后缺氧组细胞开始出现空泡化和死亡,细胞数开始减少.不同低氧条件下PASMCs培养48 h 后,低氧组PASMCs的HIF-1αmRNA表达水平和常氧组相比没有显著性差异,缺氧组PASMCs HIF-1α mRNA表达水平显著升高(P＜0.01).结论 HIF-1α是PASMCs 低氧增殖的关键因子,在低氧环境下且造成PASMCs 的 "缺氧"后才能使细胞HIF-1α mRNA表达升高,促进细胞增殖.【总页数】6页(P73-78)【作者】张昱;黄以哲;刘瑞欣;张伟【作者单位】青海大学医学院;青海省武警总队医院;青海大学医学院;青海大学医学院【正文语种】中文【中图分类】R322.121;R329.24【相关文献】1.不同模式低氧耐力训练对大鼠肝组织HIF-1α、HO-1 mRNA表达的影响 [J],徐建方;冯连世;路瑛丽;张漓;王雪冰2.Gax基因转染对低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖及c-fos、c-jun mRNA表达的影响 [J], 夏世金;钱桂生;白莉;胡明冬3.不同低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响 [J], 张昱;黄以哲;刘瑞欣;张伟4.不同低氧环境对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响 [J], 张昱;张伟5.RNA干扰沉默低氧诱导因子-1α对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响 [J], 张伟;曹越;张昱;马祁生;马兰;格日力因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用马兰;刘川川;杨全余;马燕【摘要】[目的]观察miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用并探讨其可能的机制.[方法]原代分离和培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC),并给予3％低氧处理后,用Real-time PCR法检测miR-34a和Notch1mRNA在大鼠PASMC中的表达;低氧条件下用细胞转染法过表达和抑制miR-34a、沉默Notch1基因的表达后用EDU法观察细胞增殖情况,并用Real-time PCR和Western blot法检测细胞核增殖抗原PCNA的表达.[结果]分离和培养大鼠PASMC并给予3％低氧处理后,大鼠PASMC中miR-34a表达明显降低,且低氧48 h降低较明显,组间差异有统计学意义(P<0.05).而Notch1的表达明显增高,且48 h增高较明显,组间差异有统计学意义(P<0.05).此外,过表达miR-34a和沉默Notch1后会显著抑制低氧引起的细胞增殖,抑制miR-34a的表达后则会促进细胞增殖,且组间差异有统计学意义(P<0.05).[结论]在低氧诱导的PASMC细胞增殖过程中miR-34a参与了PASMC的增殖过程,且可能是通过上调Notch1引起了细胞增殖.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】7页(P525-531)【关键词】miR-34a;肺动脉平滑肌细胞;低氧【作者】马兰;刘川川;杨全余;马燕【作者单位】青海大学医学院高原医学研究中心,青海西宁810001;青海省高原医学应用基础重点实验室,青海西宁810001;青海大学医学院高原医学研究中心,青海西宁810001;青海大学医学院高原医学研究中心,青海西宁810001;青海省高原医学应用基础重点实验室,青海西宁810001;青海大学医学院高原医学研究中心,青海西宁810001;青海省高原医学应用基础重点实验室,青海西宁810001【正文语种】中文【中图分类】R363低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary artery hypertension，HPH）是由于长期低氧引起肺血管收缩和肺血管重建从而导致肺动脉压力持续升高的一种常见的慢性高原病［1］。
MicroRNA-21对肺高压血管r平滑肌细胞增殖的影响吴翔;卓书伟;郑才玲;高戈【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2018(028)021【摘要】目的研究microRNA-21(miRNA-21)在Wnt/β-catenin信号通路中抑制肺高压(PH)血管平滑肌细胞增殖的可能机制.方法复制外源性miRNA-21干扰的野百合碱大鼠肺高压原代肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)模型,分别用Western blot和实时荧光定量PCR检测外源性miRNA-21对Wnt通路中β-catenin、Cyclin D1和拮抗剂DDK1表达的影响.结果外源性抑制miRNA-21表达时,PASMCs中β-catenin、Cyclin D1表达水平增高,拮抗剂DDK1表达降低,拮抗作用减弱;而外源性上调miRNA-21表达时,PASMCs中β-catenin、Cyclin D1表达水平降低,拮抗剂DDK1表达增高,拮抗作用增强.结论miRNA-21的早期干预可通过调控Wnt通路的拮抗剂DKK1作用与Wnt/β-catenin信号通路参与PH肺血管重构.【总页数】4页(P28-31)【作者】吴翔;卓书伟;郑才玲;高戈【作者单位】海南省中医院检验科,海南海口570203;海南省中医院检验科,海南海口570203;海南省中医院检验科,海南海口570203;中南大学医学检验系,湖南长沙 410013【正文语种】中文【中图分类】R544.1【相关文献】1.乙酰水杨酸姜黄素酯对血管紧张素II诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响及相关机制 [J], 孙四玉;杨冬梅;戴娜;夏伯候;庹勤慧2.清达颗粒对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响 [J], 余娜;李琼瑜;陈友琴;Thomas Joseph SFERRA;褚剑锋;林珊;彭军3.血浆microRNA-21水平与左室射血分数保留的心力衰竭相关性肺高压的关系[J], 吴美华;曾建斌;熊向阳4.三七皂苷R1对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响 [J], 方芳;樊光辉5.黄芪和当归配伍对大鼠血管内膜增生血管平滑肌细胞增殖的影响 [J], 阎卉芳;徐昊;彭熙炜;朱嘉欢;邓常清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2021.02.002miR⁃448靶向SIRT1对血管平滑肌细胞增殖㊁凋亡和运动能力的调节作用①朱彦彬 李 立② 王贤芝 仲 伟 张富钊 (川北医学院附属医院血管外科,南充637000) 中图分类号 R743.3 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2021)02⁃0134⁃05①本文为四川省科技厅资助项目(2017JY0570)㊂②遂宁中心医院心血管外科,遂宁629000㊂作者简介:朱彦彬,男,住院医师,主要从事血管外科基础与临床方面的研究㊂[摘 要] 目的:探讨miR⁃448靶向SIRT1对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖㊁凋亡和运动能力的调节作用㊂方法:20只SD 大鼠随机分为对照组和模型组,建立大鼠颈动脉损伤模型,造模成功后分离大鼠颈总动脉,分离培养大鼠原代VSMCs,RT⁃PCR 和Western blot 检测大鼠颈总动脉组织VSMCs miR⁃448和SIRT1表达㊂体外培养VSMCs 分为miR⁃448mimic 组㊁miR⁃448inhibitor 组和对照组,分别转染miR⁃448mimic 和miR⁃448inhibitor,测定各组细胞miR⁃448和SIRT1表达,采用荧光素酶实验验证靶向关系㊂体外培养VSMCs 分为miR⁃448组㊁miR⁃SIRT1组㊁SIRT1组和对照组,将miR⁃448mimic 转染至miR⁃488组和miR⁃SIRT1组,SIRT1转染至miR⁃SIRT1组和SIRT1组,EDU 法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell 检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot 检测各组细胞Ki67㊁PCNA㊁Caspase⁃3㊁Caspase⁃9㊁MMP⁃2和MMP⁃9蛋白表达㊂结果:动脉损伤组织VSMCs 中miR⁃448表达明显高于对照组(P <0.05),SIRT1表达明显低于对照组(P <0.05);miR⁃448可靶向负调控SIRT1,增强细胞增殖活性(P <0.05),上调Ki67和PCNA 表达(P <0.05),降低细胞凋亡率(P <0.05),下调Caspase⁃3和Caspase⁃9表达(P <0.05),提高细胞侵袭率和迁移率(P <0.05),上调MMP⁃2和MMP⁃9蛋白表达(P <0.05)㊂结论:miR⁃448可靶向负调控SIRT1,促进VSMCs 增殖㊁侵袭和迁移㊂[关键词] miR⁃448;SIRT1;血管平滑肌细胞Regulatory effects of miR⁃448⁃targeting SIRT1on proliferation ,apoptosis and motility capacity of vascular smooth muscle cellsZHU Yan⁃Bin ,LI Li ,WANG Xian⁃Zhi ,ZHONG Wei ,ZHANG Fu⁃Zhao .Department of Vascular Surgery ,Affiliated Hospital of North Medical College ,Nanchong 637000,China[Abstract ] Objective :To explore regulatory effects of miR⁃448⁃targeting SIRT1on proliferation,apoptosis and motility capacity of vascular smooth muscle cells (VSMCs).Methods :20SD rats were randomly divided into control group and model group,established carotid artery injury model.After successful modeling,common carotid arteries of rats were separated.Rats primary VSMCs were isolated and cultured,and expression levels of miR⁃448and SIRT1in common carotid arteries VSMCs of rats were detected by RT⁃PCR and Western blot.VSMCs cultured in vitro were divided into miR⁃448mimic group,miR⁃448inhibitor group and control group,miR⁃448mimic and miR⁃448inhibitor were transfected respectively.Expression levels of miR⁃448and SIRT1in cells were measured in each group,and fluorescein assay was used to verify targeting relationship.VSMCs cultured in vitro were divided into miR⁃448group,miR⁃SIRT1group,SIRT1group and control group,and miR⁃448mimic was transfected into miR⁃488group and miR⁃SIRT1group,and SIRT1was transfected into miR⁃SIRT1group and SIRT1group.Proliferation was detected by EDU method,apoptosis was detected by flow cytometry,invasion ability was detected by Transwell,and migration ability was detected by scratch assay.Western blot was used to detect protein expressions of Ki67,PCNA,Caspase⁃3,Caspase⁃9,MMP⁃2and MMP⁃9.Results :Expression level of miR⁃448in arterial injury tissues VSMCs were significantly higher than those in control group (P <0.05),and expression level of SIRT1was significantly lower than that in control group (P <0.05).miR⁃448could targeting hegatively regulated SIRT1,increase cell proliferation activity (P <0.05),up⁃regulate expression levels of Ki67and PCNA (P <0.05),decrease apoptosis rate (P <0.05),down⁃regulate expression levels of Caspase⁃3and Caspase⁃9(P <0.05),increase cell invasion rate and migration rate (P <0.05),and up⁃regulate protein expression levels of MMP⁃2and MMP⁃9(P <0.05).Conclusion :miR⁃448can targeting negatively regulate SIRT1and promote proliferation,invasion and migration of VSMCs.[Key words ] miR⁃448;SIRT1;Vascular endothelial cells 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)是动脉中膜的重要组成部分,是执行血管收缩功能的重要物质基础[1]㊂临床研究表明,VSMCs异常增殖与多种心血管疾病(动脉粥样硬化㊁冠心病和冠脉支架内再狭窄等)的发生发展相关[2]㊂研究调节VSMCs 细胞生物学行为的关键因子对心血管疾病治疗具有重要意义㊂沉默信息调节蛋白1 (silencing information regulatory protein1,SIRT1)是Sirtuin家族成员,可调节氧化应激㊁炎症和自噬等生理过程,对动脉粥样硬化㊁缺血再灌注损伤等具有预防保护作用[3]㊂研究显示,SIRT1可抑制VSMCs增殖及血管炎症反应,但其上游调节机制尚未明确[4⁃5]㊂miR⁃448属于miRNA家族,可与靶mRNA 的3′UTR互补结合抑制多种蛋白翻译,调控细胞增殖㊁分化和凋亡过程[6]㊂miR⁃448可调节SIRT1表达,参与2型糖尿病发生发展,但其对VSMCs的作用及机制报道较少[7]㊂本研究分析miR⁃448和SIRT1的靶向关系及其对VSMCs细胞生物学行为的调节作用,为心血管疾病治疗提供参考㊂1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠20只,体重250~280g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2017⁃0022,饲养于我院动物中心实验室,每12h更换光照条件,保持室温恒定为25℃,自由摄食与饮水㊂1.1.2 仪器 FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD 公司);荧光显微镜(日本Olympus公司)㊂1.1.3 试剂 DMEM培养基㊁胎牛血清及转染试剂(赛默飞世尔);荧光素酶检测试剂盒(美国Promega 公司);EDU试剂盒(广东锐博生物科技有限公司); MTT检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司); Transwell小室㊁Matrigel基底膜(美国BD公司); RNA提取试剂盒㊁反转录试剂盒㊁荧光定量试剂(日本TaKaRa公司);抗GAPDH抗体㊁抗α⁃SMA抗体㊁抗Ki67抗体㊁抗PCNA抗体㊁抗Caspase⁃3抗体㊁抗Caspase⁃9抗体㊁抗MMP⁃2抗体及抗MMP⁃9抗体(美国Santa Cruz公司)㊂1.2 方法1.2.1 造模 SD大鼠预饲养1周后,随机分为对照组和模型组,每组10只㊂参考文献[8]建立颈动脉损伤模型:大鼠腹腔注射10%水合氯醛(6ml/kg)麻醉,剃除颈部皮毛,75%酒精局部消毒,分离皮下组织和肌肉,暴露颈内动脉㊁颈外动脉㊁颈总动脉,颈外动脉远心端打死结,动脉夹临时结扎颈内动脉和颈总动脉近心端,显微剪在颈外动脉剪1个小口,沿颈外动脉将2.0F球囊送至颈总动脉,注射生理盐水充盈球囊,反复抽拉3次后放气,撤出球囊,待颈动脉血流恢复后依次缝合,对照组仅暴露颈动脉后即缝合伤口㊂术后14d腹腔麻醉处死大鼠,分离颈全部总动脉㊂1.2.2 大鼠颈动脉组织VSMCs细胞分离培养与鉴定 将颈总动脉放入D⁃Hanks液中洗清残血,血管放入2mg/mlⅡ型胶原酶和高糖细胞培养基(1∶1)中, 37℃温浴15min,剥去血管表面筋膜和纤维层,置于含1%青霉素⁃链霉素和10%胎牛血清的高糖培养基,37℃孵育过夜,分别加入1mlⅡ型胶原酶(2mg/ml)和弹力蛋白酶(0.25mg/ml)于6孔板,剪碎,37℃孵育1h,枪头吹打后离心,重悬,细胞生长至80%融合(7~10d)传代㊂采用α⁃SMA单克隆抗体进行免疫荧光鉴定,取培养到第2代的对数期细胞,弃培养基,加入1ml4%多聚甲醛固定20min,加入0.25%Triton X⁃100室温透膜1h,加入含10%山羊血清的封闭液室温封闭1h,加入羊抗鼠α⁃SMA一抗(1∶200)4℃孵育过夜,加入Alex488兔抗羊二抗(1∶1000)4℃孵育过夜,加入DAPI染核,室温避光10min,倒置荧光显微镜下观察㊂1.2.3 RT⁃PCR㊁Western blot检测大鼠颈动脉组织VSMCs miR⁃448和SIRT1表达 取各组大鼠VSMCs, Trizol法提取组织总RNA,RT⁃PCR反应,以GAPDH 为内参,参考文献[9⁃10]设计引物㊁反应体系及条件㊂采用细胞裂解液严格按照蛋白裂解步骤提取总蛋白,将50μg蛋白样品经SDS⁃PAGE电泳转至PVDF膜,加入一抗4℃孵育过夜,加二抗37℃孵育2h,ECL显色㊂Photoshop软件分析蛋白条带灰度值㊂1.2.4 miR⁃448和SIRT1靶向关系研究 将体外分离培养的正常大鼠VSMCs接种于细胞培养板,24h 后分别转染miR⁃448mimic和miR⁃448inhibitor㊂RT⁃PCR测定各VSMCs中miR⁃448表达㊂Western blot检测SIRT1蛋白表达㊂荧光素酶报告基因系统研究miR⁃448和SIRT1靶向关系,miRNA靶点预测软件提示,miR⁃448的可能结合位点为SIRT1mRNA的3′UTR位点906~913,体外合成含该位点的DNA片段(wt)及含该位点突变体(mut)的DNA片段,亚克隆至双荧光素酶启动子载体㊂将该质粒转染于miR⁃448组和miR⁃448inhibitor组细胞,培养48h,荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性㊂1.2.5 细胞培养与转染 将体外分离培养的正常大鼠VSMCs分为miR⁃448组㊁miR⁃SIRT1组㊁SIRT1组和对照组㊂采用Lipofectamine2000转染miR⁃448 mimic,转染前24h接种细胞,将miR⁃448mimic转染于miR⁃488组和miR⁃SIRT1组细胞;将SIRT1构建至pc⁃DNA3.1载体过表达后转染至miR⁃SIRT1组和SIRT1组细胞,按照转染试剂操作步骤进行转染㊂1.2.6 EDU染色检测细胞的增殖 取转染后各组VSMCs,按照EDU试剂盒说明书进行EDU染色,于荧光显微镜下观察细胞增殖情况,Image⁃pro Plus软件计算㊂Western blot检测Ki67㊁PCNA蛋白表达㊂1.2.7 流式细胞术检测细胞的凋亡 取转染后各组VSMCs,离心管收集细胞培养液及胰酶消化后的细胞,2000r/min离心5min,弃上清,PBS重悬并计数㊂取5×104~1×105个/ml重悬细胞,1000r/min 离心5min,弃上清,依次加入195μl Annexin V⁃FITC结合液重悬细胞,5μl Annexin V⁃FITC轻轻摇匀,10μl Propidium Iodide染色液混匀㊂室温避光孵育30min,流式细胞术检测㊂Western blot检测Caspase⁃3和Caspase⁃9蛋白表达㊂1.2.8 Transwell检测细胞侵袭 取100μl稀释好的基质胶均匀覆盖于Transwell小室底部㊂取转染后各组细胞,0.2%胰蛋白酶消化,以含1%小牛血清的培养液调整细胞浓度为2×105个/ml㊂取100μl稀释好的细胞悬液加于上室,下室为500μl 含10%胎牛血清培养基,37℃㊁5%CO2培养48h,取出小室,按照Hemacolor Kit说明书固定㊁染色,下室面表面细胞为侵袭细胞,显微镜下拍照㊁计数,共计数5个视野,取平均值㊂实验设置3个平行小室,重复3次,以穿膜的肿瘤细胞数评价其侵袭能力㊂1.2.9 划痕实验检测细胞迁移 取转染后各组VSMCs接种于96孔板,待细胞长满单层弃培养基,灭菌移液枪头在皿底划一直线,洗涤3次,尽量清洗掉被划下的细胞,更换无血清培养基常规培养,显微镜下观察划痕处细胞生长情况,根据划痕宽度计算细胞迁移率㊂Western blot检测MMP⁃2和MMP⁃9蛋白表达㊂1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据分析,计量资料以x±s表示,进行正态分布检验,如各组数据均满足正态分布且两组间方差齐性,采用t检验比较两组间差异,单因素方差分析比较多组间差异;若以上条件不满足则考虑非参数Mann⁃Whitney U检验,以P<0.05表示差异有统计学意义㊂2 结果2.1 各组大鼠动脉损伤组织VSMCs分离鉴定 正常组织和动脉损伤组织VSMCs中均可见α⁃SMA阳性信号,表明所分离细胞为VMSCs㊂见图1㊂2.2 miR⁃448和SIRT1在动脉损伤组织VSMCs中的表达 与对照组相比,动脉损伤组织VSMCs中miR⁃448表达明显上调(P<0.05),SIRT1表达明显下调(P<0.05)㊂见图2㊂2.3 miR⁃448靶向抑制SIRT1表达 与对照组相比,miR⁃448组miR⁃448表达明显上调(P<0.05), SIRT1表达明显下调(P<0.05),miR⁃448inhibitor 组miR⁃448表达明显下调(P<0.05),SIRT1表达明显上调(P<0.05)㊂荧光素酶报告系统实验结果显示,共转染野生型荧光素酶质粒和miR⁃448,荧光素酶活性显著降低(P<0.01),表明miR⁃448可靶向负调控SIRT1,见图3㊂2.4 miR⁃448靶向抑制SIRT1促进VSMCs增殖 EDU细胞增殖实验显示,与对照组相比,miR⁃448组细胞数明显增多(P<0.05),SIRT1组细胞数明显减少(P<0.05);与SIRT1组相比,miR⁃SIRT1组细胞数明显增多(P<0.05)㊂Western blot显示,与对照组相比, miR⁃448组Ki67和PCNA蛋白表达明显上调(P< 0.05),SIRT1组Ki67和PCNA蛋白表达明显下调(P<0.05);与SIRT1组相比,miR⁃SIRT1组Ki67和PCNA蛋白表达明显上调(P<0.05),见图4㊂2.5 miR⁃448靶向抑制SIRT1抑制VSMCs凋亡 流式细胞术结果显示,与对照组相比,miR⁃448组细胞凋亡率明显下降(P<0.05),SIRT1组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与SIRT1组相比,miR⁃SIRT1组细胞凋亡率明显下降(P<0.05)㊂Western blot显示,与对照组相比,miR⁃448组Caspase⁃3和Caspase⁃9蛋白表达明显下调(P<0.05),SIRT1组Caspase⁃3和Caspase⁃9蛋白表达明显上调(P<0.05);与SIRT1组相比,miR⁃SIRT1组Caspase⁃3和Caspase⁃9蛋白表达明显下调(P<0.05),见图5㊂图1 各组大鼠动脉损伤组织中VSMCs分离鉴定Fig.1 Isolation and identification of VSMCs in artery injury tissues ofrats图2 miR⁃448和SIRT1在正常组织与动脉损伤组织VSMCs中的表达Fig.2 Expression levels of miR⁃448and SIRT1in VSMCs of normal tissues and arterial injury tissues Note:Compared with Control,*.P<0.05.图3 miR⁃448对SIRT1表达的靶向调控作用Fig.3 Effect of miR⁃448on targeting expression of SIRT1Note:Compared with Control,*.P <0.05;compared with SIRT1wt,#.P <0.05.图4 miR⁃448靶向抑制SIRT1对VSMCs 增殖的影响Fig.4 Effect of miR⁃448targeting inhibiting SIRT1onproliferation of VSMCsNote:Compared with Control,*.P <0.05;compared with SIRT1,#.P <0.05.图5 miR⁃448靶向抑制SIRT1对VSMCs 凋亡的影响Fig.5 Effect of miR⁃448targeting inhibiting SIRT1onapoptosis of VSMCsNote:Compared with Control,*.P <0.05;compared with SIRT1,#.P <0.05.2.6 miR⁃448靶向抑制SIRT1促进VSMCs 侵袭和迁移 与对照组相比,miR⁃448组细胞侵袭率和迁移率明显升高(P <0.05),SIRT1组细胞侵袭率和迁移率明显下降(P <0.05);与SIRT1组相比,miR⁃图6 miR⁃448靶向抑制SIRT1对VSMCs 细胞侵袭和迁移的影响Fig.6 Effect of miR⁃448targeting SIRT1on inhibit invasion and migration of VSMCsNote:Compared with Control,*.P <0.05;compared with SIRT1,#.P <0.05.SIRT1组细胞侵袭率和迁移率升高(P <0.05)㊂Western blot 显示,与对照组相比,miR⁃448组MMP⁃2和MMP⁃9蛋白表达明显上调(P <0.05),SIRT1组MMP⁃2和MMP⁃9蛋白表达明显下调(P <0.05);与SIRT1组相比,miR⁃SIRT1组MMP⁃2和MMP⁃9蛋白表达明显上调(P <0.05),见图6㊂3 讨论miR⁃448属于miRNAs 家族,参与冠状动脉粥样硬化㊁前列腺癌㊁乳腺癌等多种疾病的发生㊂LI等[11]研究发现,过表达miR⁃448可促进VSMCs 增殖和迁移,在多种心血管疾病(冠心病㊁动脉粥样硬化㊁高血压等)中具有重要作用,但作用机制尚未明确㊂本研究建立大鼠颈动脉损伤模型,分析miR⁃448作用于VSMCs 的机制㊂本研究中,动脉损伤组织VSMCs 中miR⁃448表达明显上调,SIRT1表达明显下调,且经荧光素酶活性实验证实miR⁃448可靶向负调控SIRT1表达,提示miR⁃448可能通过靶向负调控SIRT1表达调控VSMCs 生物学行为,参与动脉组织损伤的病理过程㊂SIRT1作为Sirtuins 家族成员,参与多种细胞过程,如能量代谢㊁DNA 修复㊁氧化应激等[12]㊂研究表明,SIRT1可调节VSMCs 功能紊乱,在血管的生长发育中具有重要作用[13]㊂提示miR⁃448可通过靶向负调控SIRT1表达调节VSMCs 功能,导致动脉组织损伤㊂VSMCs 异常增殖是高血压㊁动脉粥样硬化㊁冠心病等疾病发生发展的细胞病理学基础[14]㊂本研究发现,miR⁃448可靶向抑制SIRT1表达上调Ki67和PCNA蛋白表达,促进VSMCs细胞增殖㊂Ki67和PCNA为细胞增殖蛋白,是目前反映肿瘤细胞增殖活性和增殖速率最可靠的指标,与多种恶性肿瘤的发展及预后有关[15]㊂提示miR⁃448可通过抑制SIRT1表达上调细胞增殖蛋白表达,促进VSMCs增殖㊂WANG等[16]研究发现,SIRT1可抑制损伤的VSMCs增殖,促进其凋亡,与本研究结果基本相符,提示miR⁃448可通过靶向抑制SIRT1表达㊂促进VSMCs增殖,增加高血压㊁冠心病等心血管疾病发生风险㊂本研究中,miR⁃448可靶向抑制SIRT1表达,下调Caspase⁃3和Caspase⁃9蛋白的表达,抑制细胞凋亡,提示miR⁃448可靶向抑制SIRT1表达,抑制细胞凋亡的级联反应,抑制VSMCs凋亡㊂临床研究表明,损伤诱导的VSMCs由中膜向内膜迁移㊁增殖㊁分泌大量细胞外基质等是导致血管重构的重要病理基础[17]㊂本研究发现,miR⁃448可靶向抑制SIRT1表达,上调MMP⁃2和MMP⁃9蛋白表达,抑制VSMCs侵袭和迁移㊂MMP⁃2和MMP⁃9所有MMPs中分布最广,可特异性降解Ⅳ型胶原纤维,其中MMP⁃9还可以释放血管内皮生长因子参与血管生成,在调节细胞增殖㊁侵袭㊁转移及血管生成等方面具有重要作用[18⁃19]㊂KITADA等[20]研究表明, SIRT1在VSMCs侵袭和迁移中具有重要作用,与本研究结论基本相符,提示miR⁃448可靶向抑制SIRT1表达,上调MMP⁃2和MMP⁃9表达,促进VSMCs侵袭和迁移,增加血管重构风险㊂综上所述,miR⁃448可靶向负调控SIRT1表达,促进VSMCs增殖㊁侵袭和迁移,抑制其凋亡,为心血管疾病的研究和防治提供了理论基础㊂参考文献:[1] 熊 玮,骆 瑜,董少红,等.微小RNA⁃146a上调cyclinD1表达诱导大鼠血管平滑肌细胞的增殖[J].中国免疫学杂志, 2016,32(7):974⁃978.DOI:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2016.07.009.[2] LI Y,HUANG J,JIANG Z,et al.MicroRNA⁃145regulates platelet⁃derived growth factor⁃induced human aortic vascular smooth muscle cell proliferation and migration by targeting CD40[J].Am J Transl Res,2016,8(4):1813⁃1825.[3] RYALL J G,DELL′ORSO S,DERFOUL A,et al.The NAD(+)⁃dependent SIRT1deacetylase translates a metabolic switch into regulatory epigenetics in skeletal muscle stem cells[J].Cell Stem Cell,2015,16(2):171⁃183.DOI:10.1016/j.stem.2014.12.004.[4] 杨 蓉,朱 旭,段智娟,等.Sirt1抑制氧化型低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞炎症反应[J].中华医学杂志,2017,97(21):1659⁃1663.DOI:10.3760/cma.j.issn.0376⁃2491.2017.21.014.[5] ZHANG M J,ZHOU Y,CHEN L,et al.Impaired SIRT1promotesthe migration of vascular smooth muscle cell⁃derived foam cells [J].Histochem Cell Biol,2016,146(1):33⁃43.DOI:10.1007/s00418⁃016⁃1408⁃9.[6] 沈 旭,朱 文,李建新,等.微小RNA⁃448抑制剂对人前列腺癌细胞增殖和迁移的影响[J].临床与实验病理学杂志, 2018,34(6):640⁃643.DOI:10.13315/ki.cjcep.2018.06.012.[7] WANG Y,WANG D S,CHENG Y S,et al.Expression ofmicroRNA⁃448and SIRT1and prognosis of obese Type2diabetic mellitus patients after laparoscopic bariatric surgery[J].Cell Physiol Biochem,2018,45(3):935⁃950.DOI:10.1159/000487287.[8] 赵然尊,朱江兰,王冬梅,等.降钙素基因相关肽调节间充质干细胞存活对大鼠颈动脉损伤后血管修复的作用[J].上海医学,2014,34(9):774⁃778.[9] SEULKI P,RAKKYUN S,JIAE K,et al.Oligonol promotes anti⁃aging pathways via modulation of SIRT1⁃AMPK⁃autophagy pathway [J].Nut Res Pract,2016,10(1):3⁃10.DOI:10.4162/nrp.2016.10.1.3.[10] LYU,LEI Y,HU Y,et al.miR⁃448negatively regulates ovariancancer cell growth and metastasis by targeting CXCL12[J].ClinTransl Oncol,2015,17(11):903⁃909.DOI:10.1007/s12094⁃015⁃1325⁃8.[11] LI W,ZHANG R,SUI L,et al.MiR⁃448promotes vascular smoothmuscle cell proliferation and migration in through directlytargeting MEF2C[J].Environ Sci Pollut Res,2017,24(28):22294⁃22300.DOI:10.1007/s11356⁃017⁃9771⁃1. [12] HERSKOVITS A Z,GUARENTE L.SIRT1in neurodevelopmentand brain senescence[J].Neuron,2014,81(3):471⁃483.DOI:10.1016/j.neuron.2014.01.028.[13] GANO L B,DONATO A J,PASHA H M,et al.The SIRT1activator SRT1720reverses vascular endothelial dysfunction,excessive superoxide production,and inflammation with aging inmice[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2014,307(12):1754⁃1763.DOI:10.1152/ajpheart.00377.2014.[14] GOUSSEVA N,KUGATHASAN K,CHESTERMAN C N,et al.Early growth response factor⁃1mediates insulin⁃inducible vascularendothelial cell proliferation and regrowth after injury[J].J CellBiochem,2015,81(3):523⁃534.DOI:10.1002/1097⁃4644(20010601)81:3<523::aid⁃jcb1066>3.0.co;2⁃e. [15] LI N,DENG W,MA J,et al.Prognostic evaluation of Nanog,Oct4,Sox2,PCNA,Ki67and E⁃cadherin expression in gastriccancer[J].Med Oncol,2015,32(1):1⁃9.DOI:10.1007/s12032⁃014⁃0433⁃6.[16] WANG W R,LIU E Q,ZHANG J Y,et al.Activation of PPARalpha by fenofibrate inhibits apoptosis in vascular adventitialfibroblasts partly through SIRT1⁃mediated deacetylation of FoxO1[J].Exp Cell Res,2015,338(1):54⁃63.DOI:10.1016/j.yexcr.2015.07.027.[17] ZHU T,YAO Q,WANG W,et al.iNOS induces vascularendothelial cell migration and apoptosis via autophagy inischemia/reperfusion injury[J].Cell Physiol Biochem,2016,38(4):1575⁃1588.DOI:10.1159/000443098.[18] ELLENRIEDER V,ALBER B U,HENDLER S,et al.Role ofMT⁃MMPs and MMP⁃2in pancreatic cancer progression[J].Int JCancer,2015,85(1):14⁃20.DOI:10.1002/(sici)1097⁃0215(20000101)85:1<14::aid⁃ijc3>3.0.co;2⁃o. [19] 郑 茜,张 勇,杨东伟.MiR⁃126通过MAPK信号通路抑制oxLDL处理的血管平滑肌细胞增殖和迁移[J].中国免疫学杂志,2018,34(2):192⁃198.DOI:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2018.02.007.[20] KITADA M,OGURA Y,KOYA D.The protective role of Sirt1invascular tissue:Its relationship to vascular aging andatherosclerosis[J].Aging,2016,8(10):2290⁃2307.DOI:10.18632/aging.101068.[收稿2019⁃06⁃12 修回2019⁃08⁃15](编辑 周文瑜)。
血管平滑肌细胞增殖及其调控
秦旭平;廖端芳;李元建
【期刊名称】《中国动脉硬化杂志》
【年(卷),期】2001(9)5
【摘要】血管壁受损是导致血管平滑肌细胞增殖的起始原因。
损伤刺激通过细胞内的信号转导可引起许多原瘤基因的表达和细胞因子生成 ,从而使血管平滑肌细胞增殖和凋亡的平衡被打破 ,导致血管平滑肌细胞过分增殖。
通过干预细胞内信号转导通路或和调节相关基因的表达以阻断血管平滑肌细胞增殖可望成为治疗此类心血管疾病的有效途径。
【总页数】5页(P450-454)
【关键词】增殖;信号转导;血管平滑肌;动脉粥样硬化
【作者】秦旭平;廖端芳;李元建
【作者单位】中南大学湘雅医学院药理学教研室;南华大学药物药理研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R543.5
【相关文献】
1.茯苓提取物以miR-649/Akt1通路调控AngⅡ诱导血管平滑肌细胞的增殖、迁移和侵袭机制 [J], 姚卫;黄伟;张斌
2.附子多糖调控miR-135b-5p对脂多糖诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响[J], 刘雪琼;黄会芳
3.E3泛素连接酶32调控血管平滑肌细胞增殖及迁移的作用机制 [J], 冯菲菲;谷敏;甘雪晴;李霜;孙雄山;杨大春
4.转录因子c-Jun对人血管平滑肌细胞增殖的调控作用及其机制的实验研究 [J], 吴琼;刘洁琳;刘雅;辛毅;曾荣;程文立;王佐广
5.长链非编码RNA NONRATT011842的调控对高血压血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响 [J], 高刚利;史东东;张栋;蓝剑;李娇娇
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低氧肺血管重建中肺动脉平滑肌细胞表型转换相关信号通路研究进展陈杨【摘要】低氧肺血管重建(hypoxia pulmomary vascular remodeling,HPVR)是多种血管性疾病的主要病理特征,肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的表型转换是HPVR病理过程中的基本病理变化.文中就HPVR中PASMCs表型转换相关通路研究进展作一综述.【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2013(026)009【总页数】4页(P984-987)【关键词】低氧肺血管重建;肺动脉平滑肌细胞;表型转换;信号通路【作者】陈杨【作者单位】400038,重庆,第三军医大学附属西南医院麻醉科【正文语种】中文【中图分类】R543.20 引言肝源性肺疾病又称肝肺综合征(hepatopulomonarry sysdrome，HPS)，可导致肺血管重塑，使肺微血管内皮细胞异常增殖和肌样分化［1］，引起肺微血管扩张，从而导致血管中层PASMCs处于低氧环境，并进一步导致HPVR。
HPVR是除HPS外其他多种疾病(如慢性阻塞性肺疾病、慢性肺源性心脏病、高原肺水肿、肾源性肺疾病等)的主要病理特征。
此病理过程中，PASMCs的表型转换是HPVR的基本病理变化［2］。
在低氧刺激下，PASMCs发生表型转换，进而迁移至内膜并大量增殖，致使相关疾病发生、发展;在此期间有多条信号通路参与调控。
研究多条信号通路调控PASMCs表型转换的机制，已成为研究热点，在此基础上探索新的有价值的治疗靶点，对防治多种相关疾病有重要意义。
本文就PASMCs表型转换相关信号通路研究进展综述如下。
1 表型转换表型转换(phenotype modulation)是指在各种病理因素如低氧刺激下，PASMCs 从高分化的收缩型转换为未分化的合成型，并获得增殖、迁移和合成、分泌大量细胞外基质的能力。
高原肺动脉高压发病机制研究进展谭秀娟【摘要】高原肺动脉高压主要是由于高原习服不适应或不良适应而产生的高原疾病并发症.高原低氧环境下,低氧导致肺血管收缩,持续低氧能够诱导低氧性肺动脉高压的产生和发展.慢性低氧造成肺血管重构和右心室肥厚等病理生理现象,进而会导致肺水肿、脑水肿等高原病.因此,明确高原性肺动脉高压发病机理为高原病的预防和治疗奠定基础.现就近几年对高原性/低氧肺动脉高压发病机制方面的相关研究进行综述.【期刊名称】《心血管病学进展》【年(卷),期】2018(039)004【总页数】4页(P674-677)【关键词】肺动脉高压;血管收缩;血管重构【作者】谭秀娟【作者单位】西南交通大学附属成都市第三人民医院/西南交通大学医学院,四川成都610031【正文语种】中文【中图分类】R544.1+6目前，很多肺动脉高压的定义是指在静息状态下肺动脉平均压≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)[1-3]。
根据最新的肺动脉高压分类指南，高原肺动脉高压(highaltitude pulmonary hypertension，HAPH)属于其第三类[2]。
HAPH患者在行动时具有呼吸困难、头痛，并易感到疲劳等症状。
随着病程的发展，会出现心脏代谢性失常，甚至危及生命[3]。
HAPH是由于高原低氧(缺氧)环境下，代偿性地使肺换气增加、血管收缩引起的[4]，常见于高原习服不适应，或者不良适应而发生的一种高原疾病。
其病理生理机制还不完全清楚。
氧化应激[5-6]、内皮细胞功能紊乱、肺血管平滑肌细胞增殖、肺血管重构[7]、肺血管纤维化以及心脏早期适应性增厚[8]等是促进HAPH发展的主要病理生理变化。
据统计大约有1.4亿人是永远生活在高海拔地区上的，海拔高度一般在2 500 m以上，这些长期居住在高原的人及其后代，其基因表型发生了适应性变化[9]，这些变化使得生存在高原环境中的人与健康平原居民相比，也具有相似的肺动脉血压、心率和血氧饱和度[10-11]，以适应极端环境而生存下来。
低氧对大鼠不同级别肺动脉平滑肌细胞功能的影响国桓;王望;孙然;刘杰;王军【期刊名称】《首都医科大学学报》【年(卷),期】2014(000)002【摘要】目的培养鉴定大鼠不同级别肺动脉平滑肌细胞( pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs),探讨其对缺氧刺激反应性的不同。
方法酶消化法分离大鼠不同级别PASMCs并分为3组：大肺动脉组,包括肺动脉干及肺内一级主干；中动脉组,包括肺内主干的第二级和第三级分支；小肺动脉组,包括肺内主干四级分支后的更细小分支。
分别给予常氧( DMEM+2%FBS、5%CO2、21%O2、37益)和低氧( DMEM+2%FBS、5%CO2、3%O2、37益)培养48 h,用四甲基偶氮唑盐( methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法和Western blotting检测增生细胞核抗原( proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的蛋白表达水平的方法检测细胞的增生能力；应用伤口愈合实验检测细胞的迁移能力。
结果倒置显微镜下PASMCs呈现长梭形,免疫荧光法检测平滑肌细胞标志物即平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)为阳性,生理情况下(常氧),3组肺动脉平滑肌细胞增生及迁移能力均较一致；低氧培养48 h后,中小肺动脉平滑肌细胞的增生与迁移能力均显著高于大动脉,PCNA结果与MTT结果一致,差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论在低氧条件刺激下,不同级别肺动脉平滑肌细胞反应性不同,中小肺动脉平滑肌细胞的增生及迁移能力均显著高于大肺动脉平滑肌细胞。
%Objective To explore the effects of hypoxia on the proliferation and migration of rat pulmonary artery smooth muscle cells ( PASMCs) isolated and cultured from different orders of pulmonary arteries. Methods The pulmonary artery brancheswere gently isolated from male Sprague-Dawley rats(250-350 g) from Capital Medical University and eventually cut into three groups according to the vascular grading:the proximal pulmonary arteries ( pulmonary trunk and the first order branches of the intrapulmonary arteries ) , the middle pulmonary arteries ( second to third order intrapulmonary arteries ) , and the distal pulmonary arteries ( forth to fifth order intrapulmonary arteries). Primary PA SMCs were cultured from the pulmonary arteries and α-smooth muscle actin(α-SMA) in the cells was identified by immunofluorescence. PASMCs were cultured under normoxia( DMEM+2%FBS, 5%CO2 , 21%O2 , 37 ℃) and hypoxia (DMEM+2%FBS, 5%CO2, 3%O2, 37 ℃). Cell proliferation was quantified by using 0. 5 g/L methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay. Western blotting was used for detecting the protein expression level of proliferating cell nuclear antigen ( PCNA ) in PASMCs. Wound healing test was explored to assess the migration function of the cells. Results Cells isolated from different orders of pulmonary arteries from rats tended to be long spindle and grew in the “peak-valley” mode under microscope. Immunofluorescence results showed that all of the three groups of cells are positively expressα-SMA which is a marker of smooth muscle cells. Under physiological condition (normoxic), three groups of PASMCs have the similar ability of proliferation and migration. While after incubation under hypoxia(3%O2 , 48 h) , all cells from the three groups showed increased proliferation ability( assessed by MTT and PCNA expression) as well as the migration ability. Moreover, compared to the proximal pulmonary arteries, PASMCs from the middleand distal pulmonary arteries showed much more sensitive to hypoxia stimulus. Conclusion These results suggest that PASMCs from middle and distal pulmonary arteries have higher ability of proliferation and migration than those from proximal under hypoxia condition. This will help to give us some information about the possible mechanism of different responses of different orders of pulmonary arteries under the same pathophysiological stimulus.【总页数】6页(P231-236)【作者】国桓;王望;孙然;刘杰;王军【作者单位】首都医科大学基础医学院生理学教研室，北京100069;首都医科大学基础医学院生理学教研室，北京100069;首都医科大学基础医学院生理学教研室，北京100069;首都医科大学基础医学院生理学教研室，北京100069;首都医科大学基础医学院生理学教研室，北京100069【正文语种】中文【中图分类】R332【相关文献】1.不同程度低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和HIF-1α mRNA表达的影响 [J], 张昱;黄以哲;刘瑞欣;张伟2.不同低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响 [J], 张昱;黄以哲;刘瑞欣;张伟3.不同低氧环境对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响 [J], 张昱;张伟4.白藜芦醇对低氧条件下肺动脉平滑肌细胞OPN表达及细胞功能的影响 [J], 李小静;刘川川;鲍金;刘辉琦;刘杰;曹学锋;王生兰5.白藜芦醇对低氧条件下肺动脉平滑肌细胞OPN表达及细胞功能的影响 [J], 李小静;刘川川;鲍金;刘辉琦;刘杰;曹学锋;王生兰;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
miR-216a、miR-301a调控BMPR2促进缺氧环境下肺动脉平滑肌细胞的增殖林潇;郑炜平;李鸿茹;陈愉生;周梦【期刊名称】《江苏大学学报:医学版》【年(卷),期】2022(32)3【摘要】目的:探讨miR-216a、miR-301a对缺氧环境下人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary arterial smooth muscle cells,HPASMC)增殖的影响并研究其发生机制。
方法:采用CCK8法检测常氧和不同缺氧时间培养下HPASMC的增殖活力,qRT-PCR检测各组miR-216a、miR-301a和骨形成蛋白2型受体(bone morphogenetic protein receptor type 2,BMPR2)mRNA表达。
CCK8和蛋白免疫印迹法分别检测转染了miR-216a或miR-301a抑制物后HPASMC的增殖能力及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达水平。
双荧光素酶报告分别检测BMPR2与miR-216a、BMPR2与miR-301a之间的关系。
CCK8和蛋白免疫印迹法分别检测同时转染miR-216a或miR-301a联合BMPR2过表达质粒后HPASMC的增殖能力及BMPR2、PCNA的表达水平。
结果:随着缺氧时间的延长,HPASMC的增殖活力和miR-216a表达增加,BMPR2 mRNA表达逐渐下降,miR-301a在缺氧24 h表达水平最高。
下调miR-216a和miR-301a均显著抑制HPASMC的增殖活力及PCNA表达。
双荧光素酶报告测定证实BMPR2分别是miR-216a和miR-301a的靶点。
同时转染miR-216a或miR-301a联合BMPR2过表达质粒,BMPR2表达下降,细胞增殖活力及PCNA表达增加。
结论:缺氧环境下,miR-216a、miR-301a通过抑制BMPR2促进HPASMC增殖,引发肺动脉高压的形成。
㊃论 著㊃D O I :10.3760/c m a .j.i s s n .1673-436X.2015.07.008基金项目:国家自然科学基金(81100037㊁81360049);云南省应用基础研究计划项目(2011F B 154㊁2013F Z 231)作者单位:650032昆明医科大学第一附属医院呼吸内一科(杨姣㊁张力燕);650051昆明医科大学附属延安医院呼吸内一科(吴绪伟㊁李艳丽㊁张钰旋㊁张红艳㊁邢西迁)通信作者:邢西迁,E m a i l :x i n g x i qi a n m d @y a h o o .c o m 不同低氧时间诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞m i R -199a 表达的动态变化杨姣 吴绪伟 张力燕 李艳丽 张钰旋 张红艳 邢西迁ʌ摘要ɔ 目的 观察并分析m i c r o R N A -199a (m i R -199a )在不同低氧时间诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(P A S M C s )中表达的变化,为探讨m i R -199a 对P A S M C s 增殖的调控作用及机制奠定基础㊂方法 原代培养的P A S M C s 分别于常氧和低氧下培养6h ㊁12h ㊁24h 和48h ,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(M T T )检测各组细胞增殖情况,实时荧光定量P C R 检测各组细胞m i R -199a 的表达情况㊂结果 ①M T T 检测结果显示低氧组各时间点P A S M C s 吸光度(A 值)均显著高于相对应的常氧组(P <0.05);②低氧组P A S M C s 的m i R -199a 表达随时间的延长呈持续降低趋势,N 48h 组㊁H 6h 组㊁H 12h 组㊁H 24h 组㊁H 48h 组的P A S M C s 的m i R -199a 表达量分别为5.55ʃ0.52㊁4.73ʃ0.25㊁3.41ʃ0.38㊁1.32ʃ0.07㊁0.84ʃ0.16㊂与N 48h 组比较,H 6h 组㊁H 12h 组㊁H 24h 组㊁H 48h 组P A S M C sm i R -199a 的表达均显著下降(P 值均<0.05);除低氧48h 组与低氧24h 组比较,m i R -199a 的表达差异无统计学意义(P =0.10)外,其余各组之间P A S M C sm i R -199a 的表达差异均有统计学意义(P 值均<0.05)㊂结论 低氧诱导后m i R -199a 在P A S M C s 中的表达下调,且随着低氧时间的延长,m i R -199a 的表达有降低的趋势,推测其可能参与了低氧诱导的P A S M C s 增殖的调控㊂ʌ关键词ɔ M i c r o R N A -199a;低氧;肺动脉平滑肌细胞;增殖T h e e x p r e s s i o n c h a n g e s o fm i R -199a i nh y p o x i c -i n d u c e d p u l m o n a r y a r t e r ys m o o t hm u s c l e c e l l s o f r a t s Y a n g J i a o *,W u X u w e i ,Z h a n g L i y a n ,L iY a n l i ,Z h a n g Y u x u a n ,Z h a n g H o n g y a n ,X i n g X i qi a n .*F i r s t D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ,t h eF i r s t H o s p i t a lA f f i l i a t e dt o K u n m i n g M e d i c a lU n i v e r s i t y ,K u n m i n g 650032,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :X i n g X i q i a n ,E m a i l :x i n g x i qi a n m d @y a h o o .c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o o b s e r v ea n d a n a l y s i st h ec h a n g e s of m i c r o R N A -199a (m i R -199a )e x p r e s s i o n i n r a t p u l m o n a r y a r t e r y s m o o t hm u s c l e c e l l s (P A S M C s )i n d u c e db y d i f f e r e n t h y po x i a t i m e ,a n d l a y t h e f o u n d a t i o n t o e x p l o r e t h e e f f e c t a n d m e c h a n i s m o f r e gu l a t i o n o f m i R -199a o n P A S M C s p r o l i f e r a t i o n .M e t h o d s T h e p r i m a r y c u l t u r e dP A S M C s r e s p e c t i v e l y c u l t u r e du n d e r n o r m o x i c a n dh y po x i c 6h ,12h ,24h ,48h ,u s i n g m e t h y l t h i a z o l y l t e t r a z o l i u mc o l o r i m e t r i c (M T T )d e t e c t i o n o f c e l l pr o l i f e r a t i o n ,r e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eP C Rd e t e c t i o no fm i R -199ae x p r e s s i o n i ne a c h g r o u p P A S M C s .R e s u l t s ①M T T t e s t r e s u l t s s h o w e dt h a t t h eP A S M C sa b s o r b a n c e (Av a l u e )o f t h eh y p o x i c g r o u p a t e a c ht i m e p o i n t i s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h e c o r r e s p o n d i n g n o r m o x i c g r o u p (P <0.05).②T h e e x pr e s s i o no fm i R -199a i nh y p o x i a g r o u p P A S M C sw a ss u s t a i n e d w i t ht i m ed e c r e a s e da p a r t f r o m h y p o x i ch y p o x i a24h g r o u p c o m p a r e d t h e e x p r e s s i o n o fm i R -199a 48h g r o u p w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P =0.10),t h e e x p r e s s i o n o fm i R -199aa m o n g o t h e r g r o u p s P A S M C s w a ss i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (P <0.05).T h ee x p r e s s i o n q u a n t i t y o fm i R -199a o fN 48h g r o u p ,H 6h g r o u p ,H 12h g r o u p ,H 24h g r o u p ,H 48h g r o u p i s5.55ʃ0.52,4.73ʃ0.25,3.41ʃ0.38,1.32ʃ0.07,0.84ʃ0.16,r e s p e c t i v e l y .C o n c l u s i o n s T h ee x p r e s s i o no f m i R -199a i nP A S M C s d e c r e a s e s a f t e r i n d u c t i o no f h y p o x i a .W e s p e c u l a t e d t h a tm i R -199am a y be i n v o l v e d ㊃715㊃国际呼吸杂志2015年4月第35卷第7期 I n t JR e s p i r ,A pr i l 2015,V o l .35,N o .7i n t h e r e g u l a t i o no f h y p o x i a-i n d u c e dP A S M C s p r o l i f e r a t i o n.ʌK e y w o r d sɔ M i c r o R N A-199a;H y p o x i a;P u l m o n a r y a r t e r y s m o o t hm u s c l e c e l l s;P r o l i f e r a t i o n研究表明一些微小R N A s(m i c r o R N A s, m i R N A s)参与了肺动脉高压的发生发展,并发挥重要作用[1-2]㊂肺动脉平滑肌细胞(p u l m o n a r y a r t e r y s m o o t hm u s c l e c e l l s,P A S M C s)增殖是肺动脉高压形成的重要因素,但m i c r o R N A-199a(m i R-199a)是否参与低氧诱导的P A S M C s增殖,尚未见研究报道㊂本研究选取大鼠P A S M C s作为研究对象,观察并分析m i R-199a在低氧诱导的P A S M C s中动态表达变化,为进一步研究m i R-199a对P A S M C s的调控作用及机制奠定基础㊂1材料与方法1.1实验动物健康雄性S D大鼠,4周龄,体质量约180~200g,购自昆明医科大学动物实验部㊂1.2实验试剂和仪器 D M E M/F12培养基㊁胎牛血清㊁胰蛋白酶㊁青链霉素和Dᶄ-H a n k s缓冲液(G I B C O,进口分装),二甲基亚砜(D M S O)购于S i g m a公司,小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白抗体㊁山羊抗小鼠I g G㊁即用型S A B C免疫组织化学染色试剂盒㊁D A B显色试剂盒均购于s a n t ac r u z公司㊁磷酸盐缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司), T R I z o l(I n v i t r o g e n,美国);m i R N e a s y M i n i K i t (Q i a g e n,德国),m i R N A Q-P C R D e t e c t i o n K i t (G e n e C o p o e i a,美国);氯仿㊁异丙醇及无水乙醇等均为国产分析纯㊂R e a l t i m e-P C R仪(A B I7500型),水平电泳槽(北京君意东方仪器公司,Y-S P C), D G-Ⅲ双稳数显电泳仪(北京鼎国生物技术发展中心),高速离心机(S I GMA,1-13),二氧化碳培养箱(德国H e r e u s),倒置相差显微镜(日本O L YM P U S),超净工作台(S W-C J-I F D型,苏州安泰空气技术有限公司)㊂1.3方法1.3.1大鼠P A S M C s原代培养及鉴定取2只大鼠,采用5%戊巴比妥钠按60m g/k g行腹腔注射麻醉后,无菌条件下开腹放血,然后开胸迅速取出心肺置于盛有无菌P B S的培养皿中,在解剖显微镜直视下分离出各级肺动脉,选取肺动脉主干以下的小动脉,用弯头眼科镊小心仔细地剥除外膜的纤维脂肪层,并用眼科剪沿血管外侧纵向剪开,在汉克斯(H a n k s)缓冲液中漂洗3次,将血管内膜面向上,铺于小木板上,用棉签自上而下擦拭2次去除内皮细胞,用眼科剪剪碎放置预先盛有2~3m l消化液的容器中,放置摇摆仪(37ħ,25次/m i n)振摆40m i n㊂待小块组织消化溶解后,离心(1000r/m i n)7m i n,弃上清液,向细胞沉淀中加入新鲜配制的含20%小牛血清的D M E M培养液,轻轻吹打后,按每瓶3ˑ104活细胞数接种在25m l培养瓶里,放入37ħ孵箱里静置培养㊂细胞免疫荧光鉴定:使用α-S M-a c t i n单克隆抗体,滴加c y3标记的荧光二抗A n t i-M o u s e I g G,用D A P I染核,荧光显微镜下拍片㊂鉴定为平滑肌细胞,且比例占97%以上,取3~5代的细胞做实验研究㊂1.3.2细胞处理及分组细胞生长达50%融合后,加入无血清的D M E M/F12培养基,在37ħ培养箱中放置24h,使细胞周期同步化㊂传代培养后,分组设计:常氧组(N48h组),细胞置于21% O2㊁74%N2㊁5%C O2的常氧条件下培养48h,低氧组(H组)细胞H6h组㊁H12h组㊁H24h组㊁H48h 组置于3%O2㊁92%N2㊁5%C O2的混合气体的低氧条件下分别培养6h㊁12h㊁24h㊁48h处理㊂1.3.3四甲基偶氮唑蓝比色法(MT T)检测P A S M C s增殖以每孔5ˑ103个细胞,将P A S M C s接种至96孔板中,每孔设5个复孔,设不加细胞只加培养液的孔为空白孔㊂待铺满60%~ 70%时,换成无血清的D M E M/F12继续培养24h,使细胞周期同步化,再换成含15%胎牛血清的培养液,分别在常氧和低氧条件下培养6h㊁12h㊁24h及48h㊂干预结束后,每孔加入MT T(5m g/m l) 20μl,37ħ继续孵育4h㊂之后弃去培养液,每孔加入150μl的D M S O,水平摇床上避光震荡10m i n㊂选择490n m波长,用酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度值(A值),空白孔调零㊂实验重复3次㊂1.3.4总R N A抽提采用m i R N e a s y M i n i K i t提取总R N A,方法参照说明书㊂以分光光度计测定R N A纯度和浓度㊂1.3.5反转录采用A B I公司T a q M a n M i c r o R N A R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n K i t和特异m i R N A的茎环引物,所有操作均在冰上完成㊂25μl的反应体系包括:2μl的总R N A,1μl的2.5U/μlP o l y A P o l y m e r a s e,1μl的R T a s e M i x, 5μl的5ˑR e a c t i o n B u f f e,补d d H2O(R N a s e/ D N a s ef r e e)至总体积25μl㊂反应条件:37ħ60m i n,85ħ5m i n㊂1.3.6R e a l-T i m e P C R采用G e n e C o p o e i a m i c r o R N A检测试剂盒㊂20μl的反应体系包括:㊃815㊃国际呼吸杂志2015年4月第35卷第7期I n t JR e s p i r,A p r i l2015,V o l.35,N o.710μl 的2ˑA l l -i n -O n e T M Q -P C R M i x ,0.4μl 的50ˑR O XR e f e r e n c eD y e ,2μl 的F o r w a r dP r i m e r ,2μl 的U n i v e r s a l A d a pt o r P C R P r i m e r ,2μl 的c D N A ,补d d H 2O (R N a s e /D N a s ef r e e )至总体积20μl ㊂在定量P C R 仪上扩增和检测,反应条件:95ħ5m i n ,40个扩增循环(95ħ10s ,60ħ20s ,72ħ10s )㊂选取G A P D H 作为内参,m i R -199a 的相对表达量采用2-әәC t计算㊂1.3.7 数据处理 每个样本采用复平行孔,重复3次㊂统计学方法采用S P S S13.0软件包,所有数据用x -ʃs 表示,显著性检验采用单因素方差分析,检验水准α=0.05,P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结果2.1 细胞免疫荧光鉴定结果 细胞免疫荧光显示,胞浆中有较强的红色荧光,呈与细胞纵轴平行的丝状排列,而细胞核未着色,表明为P A S M C s(图1)㊂注:P A S M C s 为肺动脉平滑肌细胞图1 P A S M C s 的细胞免疫荧光鉴定结果,α-S M -a c t i n 显示为细胞浆中红色丝状蛋白 I F ˑ4002.2 各组P A S M C s 增殖情况 常氧下随着时间的递增,P A S M C s 的A 值逐渐增加,低氧组P A S M C s 的A 值亦随着低氧时间的递增而增加㊂各时间点低氧组的P A S M C sA 值均显著高于相对应的常氧组(P <0.05)㊂结果见表1㊂2.3 各组P A S M C sm i R -199a 表达情况 R T -P C R 结果显示:P A S M C s 的m i R -199a 表达随着低氧时间的延长呈下降趋势㊂N 48h 组㊁H 6h 组㊁H 12h组㊁H 24h 组㊁H 48h 组的P A S M C s 的m i R -199a 表达量分别为5.55ʃ0.52㊁4.73ʃ0.25㊁3.41ʃ0.38㊁1.32ʃ0.07㊁0.84ʃ0.16㊂与N 48h 组相比较,H 6h 组㊁H 12h 组㊁H 24h 组㊁H 48h 组P A S M C sm i R -199a 的表达均显著下降(P 值均<0.05);除H 48h 组与H 24h 组比较m i R -199a 的表达差异无统计学意义(P =0.10)外,其余各组P A S M C s m i R -199a 的表达两两之间差异均有统计学意义(P 值均<0.05)㊂结果见图2㊂表1 不同低氧时间对P A S M C s 增殖的影响(M T T 比色法,x -ʃs)组别6h12h 24h 48h常氧组(A 值)0.27ʃ0.020.35ʃ0.030.46ʃ0.050.55ʃ0.06低氧组(A 值)0.36ʃ0.05a 0.46ʃ0.06b 0.57ʃ0.04c 0.69ʃ0.07d 注:P A S M C s 为肺动脉平滑肌细胞;M T T 为四甲基偶氮唑蓝比色法;a 与常氧6h 组比较,t =7.82,P <0.05;b 与常氧12h 组比较,t =7.24,P <0.05;c 与常氧24h 组比较,t =6.58,P <0.05;d 与常氧48h 组比较,t =6.76,P <0.5注:P A S M C s 为肺动脉平滑肌细胞;与其他各组相比较,a P <0.05;与N 组㊁H 6h 组㊁H 12h 组相比较,b P <0.05;与N 组㊁H 6h 组㊁H 12h 组相比较,c P <0.05图2 各组P A S M C sm i R -199a 表达情况3 讨论低氧性肺血管收缩和低氧性肺血管重建是低氧性肺动脉高压病理学改变的两个重要环节[3]㊂慢性低氧条件下,P A S M C s 出现增殖性改变,进而参与低氧性肺血管重建,最终导致低氧性肺动脉高压的发生发展,但目前尚未完全阐明P A S M C s 增殖在低氧性肺动脉高压发生发展中的具体机制㊂虽然国内外已有P A S M C s 的细胞株,但购买细胞株的费用较高,而且细胞株与体内实验有较大的差异性㊂体外原代细胞培养一方面能排除许多因素的共同影响,在特定的条件下研究个别因素的作用,另一方面又更接近于在体实验的结果,因此本实验进行原代提取和培养P A S M C s ㊂α-S M -a c t i n 的细胞荧光免疫方法鉴定发现,第5代P A S M C s 的纯度可达97%以上,说明虽然组织贴壁法培养的原代P A S M C s 的纯度较高,可以满足实验的要求㊂本实验将体外原代培养的P A S M C s 分别暴露于常氧和低氧的条件下,MT T 检测P A S M C s 的增殖情况发现,低氧6h 时P A S M C s 开始增殖,低氧48h 达到增殖最高点,表明一定的低氧时间可以促进P A S M C s 的增殖㊂㊃915㊃国际呼吸杂志2015年4月第35卷第7期 I n t JR e s p i r ,A pr i l 2015,V o l .35,N o .7m i R N A s是一类长度约22个核苷酸大小的内源性非编码R N A,它可通过识别靶基因m R N A的3ᶄ端非编码区,并与之结合阻止翻译或导致m R N A 降解,从而抑制靶基因的表达[4-5]㊂m i R N A s可表现为时间性和空间性的表达模式,调节多种生理过程:如细胞分化㊁增殖㊁凋亡㊁迁移和器官发育㊁造血等[6]㊂m i R-199a在多种肿瘤中的作用已经得到了较深入研究,m i R-199a在多种肿瘤细胞中都有异常表达,参与调控肿瘤细胞增殖代谢㊁侵袭转移㊁血管生成和凋亡等活动㊂卵巢癌[7]㊁结直肠癌[8]㊁乳腺癌[9]㊁睾丸肿瘤[10]和膀胱癌[11]中m i R-199a表达下调,但在胃癌[12]㊁宫颈癌[13]㊁支气管鳞状细胞癌[14]和葡萄膜黑色素瘤[15]中表达上调㊂在不同组织细胞中表达的差异性,提示m i R-199a可能通过不同的促癌或抑癌因子,对不同的肿瘤细胞发挥抑制或促进作用㊂但目前尚未见其在P A S M C s中的表达及其作用的研究报道㊂本实验首次明确了m i R-199a在低氧诱导的大鼠P A S M C s中的动态表达变化,表明随着低氧时间的延长,m i R-199a的表达呈逐渐降低的趋势㊂因此笔者推测m i R-199a可能参与了低氧诱导的P A S M C s增殖过程,提示m i R-199a可能对P A S M C s的增殖调控有重要作用㊂R a n e等[16]学者的研究表明下调心肌细胞的m i R-199a抑制低氧诱导因子-1α的表达,而低氧诱导因子-1α参与血管生成㊁物质代谢㊁细胞凋亡㊁细胞增殖等环节,在低氧性肺动脉高压发生中发挥重要作用,由此可以推测m i R-199a可能通过抑制低氧诱导因子-1α在P A S M C s增殖中发挥作用㊂综述所述,本实验首次明确了m i R-199a在低氧诱导的大鼠P A S M C s中的动态表达变化,为以后进一步研究m i R-199a在P A S M C s增殖中的作用机制提供了实验依据,但需要进一步行低氧性肺动脉高压动物模型体内实验以明确m i R-199a在低氧性肺动脉高压发生发展中的作用及机制㊂参考文献[1] C a r u s oP,M a c L e a n M R,K h a n i nR,e t a l.D y n a m i c c h a n g e s i nl u n 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