重组子筛选与鉴定

第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。

4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。

5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。

二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。

在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。

目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。

Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。

Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。

Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。

Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。

重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。

5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。

7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。

8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。

并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。

9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。

10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。

【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。

重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。

将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。

1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。

其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。

重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项嘿，宝子们！今天咱们来唠唠这个《重组DNA克隆子的筛选及鉴定注意事项》呀。

首先呢，咱得知道啥是重组DNA克隆子哇。

这可是生物技术里超重要的东西呢！在筛选的时候呀，有好多要注意的点呢。

一、筛选方面的注意事项1. 选择合适的筛选标记呀！哎呀呀，这可太关键了呢。

比如说抗生素抗性标记，常见的像氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等等。

你得确保这个标记是准确有效的哇，不然怎么能筛选出咱们想要的克隆子呢？要是标记弄错了，那可就像大海捞针一样乱套了呀！在选择的时候，一定要根据你的载体和宿主细胞的特性来确定呢，可不能瞎选哦！2. 筛选条件要精确呢。

比如说使用抗生素筛选的时候，抗生素的浓度一定要控制好哇！浓度低了呢，那些没有成功重组的细胞可能也会生长，这就达不到筛选的目的啦；浓度高了呢，可能会把一些好不容易重组成功的细胞也给抑制住了呀，这多可惜呢！所以呀，要通过预实验来确定最佳的抗生素浓度呢，这个步骤可不能偷懒哦！3. 筛选的时间也很重要呢！哇，你可别以为把细胞放在筛选培养基里就不管了。

时间太短，可能那些非重组子还没有完全被抑制住；时间太长呢，可能会导致重组子因为营养缺乏或者其他原因生长受到影响呢。

所以要时刻关注细胞的生长状态，确定合适的筛选时间呀。

二、鉴定方面的注意事项1. 酶切鉴定要小心哦。

在进行酶切鉴定的时候呢，首先要选择合适的限制性内切酶呀。

这就像开锁要用对钥匙一样呢。

要是酶选错了，可能就切不出你想要的条带啦，那怎么能鉴定出正确的克隆子呢？而且呀，酶切反应的体系一定要准确无误呢。

各种成分的量，像酶的量、缓冲液的浓度、DNA的量等等，都要严格按照说明书来操作呢，不然很容易出现酶切不完全或者酶切失败的情况呢！2. PCR鉴定也有不少讲究呢。

引物的设计那可是重中之重呀！哇，引物要是设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段呢。

要确保引物的特异性，不能跟其他非目标序列结合呢。

还有呀，PCR反应的条件也要不断优化呢。

转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。

再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。

因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。

一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。

2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。

3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。

4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。

二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。

（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。

（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。

2、根据报告基因筛选转化子。

（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。

由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。

（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。

如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。

3、根据形成噬菌斑筛选转化子。

重组子的筛选的原理
重组子的筛选是指通过某种方法，从混合的DNA或RNA片段中分离出特定长度的重组子（或称为合成子、片段），以进一步进行研究或应用。

其原理主要基于两个关键步骤：构建DNA文库和筛选。

构建DNA文库：首先，通过随机切割或酶切等方法将目标DNA或RNA分子切碎成片段，然后将这些片段与载体DNA或RNA连接，创建所谓的“文库”。

这样一来，文库中就包含了大量不同长度的DNA或RNA重组子。

筛选：筛选是指从文库中筛选出特定长度（或特定的序列）的重组子。

这通常通过以下几个步骤完成：
1. 选择适当的筛选方法：根据实验目的，选择适当的筛选方法。

常见的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选、蛋白质互作筛选等等。

2. 筛选条件设定：根据筛选方法的要求，设置适当的筛选条件，如适当的温度、条件和试剂浓度等，以实现特定重组子的富集。

3. 筛选步骤：根据筛选方法，进行适当的筛选步骤，如杂交、PCR扩增、亲和性层析等操作。

通过这些步骤，特定长度或序列的重组子会得到放大或富集，从而分离出来。

4. 验证与鉴定：对筛选出的重组子进行验证和鉴定，例如使用测序技术验证其序列是否与预期一致，或进行功能分析等。

总的来说，重组子的筛选原理是通过构建DNA文库，并在条件和方法设定下，利用适当的筛选方法和步骤，从文库中选择和富集特定长度或特定序列的重组子。

重组子的筛选方法一、引言重组子筛选是基因工程中的一项关键技术，用于识别和分离含有目的基因的克隆。

随着生物技术的不断发展，重组子筛选方法也日益多样化，为研究者提供了更多选择。

本文将对几种常见的重组子筛选方法进行详细介绍，并比较其优缺点。

二、常见重组子筛选方法1. 蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种基于λ噬菌体载体和lacZ基因的筛选方法。

其基本原理是利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可以将无色底物X-gal转化为蓝色产物。

当载体上含有目的基因时，lacZ基因被破坏，无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。

这种方法操作简便，适用于大量筛选。

2. 抗性筛选法：抗性筛选法是利用标记基因赋予宿主菌抗药性或营养缺陷型特性，从而筛选重组子的方法。

例如，利用卡那霉素抗性基因（neo）对细菌进行筛选。

当载体上含有目的基因时，neo基因被破坏，重组子对卡那霉素产生抗性。

这种方法成本低廉，适用于实验室条件。

3. 荧光标记筛选法：荧光标记筛选法是利用荧光标记探针与目的基因杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来筛选重组子的方法。

该方法灵敏度高，可实现自动化操作。

然而，荧光标记探针制备成本较高，且对实验操作要求较高。

4. 测序法：测序法是通过对目的基因进行测序，比对已知序列来确定重组子的方法。

该方法准确度高，适用于所有基因型重组子的筛选。

然而，测序法成本较高，操作复杂，不适合大量筛选。

三、比较与讨论蓝白筛选法、抗性筛选法和荧光标记筛选法各有优缺点。

蓝白筛选法操作简便、成本低廉，适用于大量筛选；但灵敏度较低，可能会漏掉一些弱阳性克隆。

抗性筛选法成本低、适用范围广；但标记基因可能会影响目的基因的表达，导致结果不准确。

荧光标记筛选法灵敏度高、可自动化操作；但成本较高，对实验操作要求严格。

测序法则准确度高，可适用于所有基因型重组子的筛选；但成本较高、操作复杂，不适合大量筛选。

因此，在选择重组子筛选方法时，应根据具体实验需求和条件进行综合考虑。