双向免疫扩散试验

实验双向免疫扩散法【原理】可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。

沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。

当抗原、抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。

依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的若干性质，如浓度、特异性等。

【实验材料】0.8%琼脂糖(巴比妥缓冲液配制)巴比妥钠缓冲液(μ=0.05，pH=8.6)：巴比妥钠10.30g、巴比妥1.84g、甘氨酸1.0g、Peg6000 4g，加900ml水加温助溶，待冷，转入1000ml容量瓶内，再加水到刻度，测试pH后装瓶待用。

载玻片打孔器微量加样器及塑料吸头湿盒抗原：人IgG蛋白抗体：兔抗人IgG免疫血清【实验方法】1）将已溶化的0.8%琼脂糖管放90~95℃水浴箱中平衡温度备用；2）将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂约4mL，使成厚度约1.5~2mm琼脂板；（注意：倾注速度不要过快，以免琼脂溢出载玻片；倾注过程要连续以保证琼脂板均匀平滑）；3）琼脂凝固后，用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型，本次试验采用梅花型。

梅花型即七个孔构成一组，孔径3mm，孔距4mm；梅花型打孔可以依据模板。

为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶的边缘打孔或切角标记。

打孔完毕后，将载玻片在酒精灯的火焰上过几遍，可防止漏液。

4）免疫血清的稀释：取5只干净的小试管，各加入70μL的生理盐水。

取70μL免疫血清加入第一支试管，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:2稀释血清；再从第一支试管中吸取70μL的1:2稀释血清加入第二只试管中，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:4稀释血清；依次操作，即可得到1:8、1:16、1:32的倍比稀释血清。

4）用微量加样器加6~8µL抗原于中央孔中，周围各孔分别各加6~8µL不同稀释度的免疫血清；注意每加一样品均需更换吸头，以防止交叉污染，影响实验结果；加样时，不要使样品溢出加样孔。

免疫双扩散实验报告实验目的本次实验的目的是通过普尔钦斑实验，观察和分析金属在不同浓度的硫酸溶液中的腐蚀现象，研究金属的耐腐蚀性能。

实验原理普尔钦斑实验是一种常用的评价金属耐腐蚀性能的方法。

实验中，将金属试样置于不同浓度的硫酸溶液中，观察其表面是否产生普尔钦斑或者其他腐蚀现象。

普尔钦斑是由于金属表面部分区域缺乏保护性的氧化膜而发生的电化学腐蚀。

实验材料和设备- 金属试样（铁、铜、铝等）- 实验盒- 硫酸溶液（不同浓度）实验步骤1. 准备实验盒，并将其清洗干净。

2. 准备不同浓度的硫酸溶液，如5%、10%、15%等。

3. 将金属试样放置于实验盒内，并分别注入不同浓度的硫酸溶液。

4. 观察金属试样的表面，记录下是否产生普尔钦斑或其他腐蚀现象。

5. 完成观察后，将金属试样取出，用清水冲洗干净并进行干燥。

实验结果与分析实验中使用的金属试样分别为铁、铜和铝。

观察不同浓度的硫酸溶液中金属试样的表面，得出以下结果：1. 铁试样：在5%浓度的硫酸溶液中，铁试样表面未发生明显的腐蚀现象；而在10%以上的浓度下，铁试样表面出现了普尔钦斑，随着浓度的增加，普尔钦斑的数量和大小也增加。

2. 铜试样：铜试样在5%浓度的硫酸溶液中无明显腐蚀现象，但在10%以上的浓度下，铜试样表面开始出现腐蚀现象，但无明显的普尔钦斑。

3. 铝试样：铝试样在5%和10%浓度的硫酸溶液中无明显腐蚀现象，但在浓度达到15%以上时，铝试样表面出现了片状的腐蚀和普尔钦斑。

通过以上结果分析，可以得出以下结论：1. 铁的耐腐蚀性能较差，容易在高浓度的硫酸溶液中发生腐蚀。

2. 铜的耐腐蚀性能相对较好，在低浓度的硫酸溶液中不容易发生腐蚀。

3. 铝的耐腐蚀性能较为优良，只有在浓度较高的硫酸溶液中才有可能发生腐蚀和普尔钦斑。

这些结果可以为我们在实际工程应用中选择合适的材料提供参考。

实验结论通过本次普尔钦斑实验，观察了三种不同金属在不同浓度硫酸溶液中的腐蚀表现。

根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. 铁的耐腐蚀性能较差，在高浓度硫酸溶液中容易产生普尔钦斑。

一、实验目的1. 掌握双向琼脂扩散试验的原理。

2. 熟悉双向琼脂扩散试验的操作方法。

3. 学会分析双向琼脂扩散试验的结果。

二、实验原理双向琼脂扩散试验（Double immunodiffusion test）是一种经典的免疫学实验方法，用于检测抗原与抗体之间的特异性结合。

该实验基于抗原与抗体在琼脂凝胶中相互扩散的原理。

当抗原和抗体在琼脂凝胶中相遇时，如果两者浓度比例合适，就会在两者相遇处形成白色沉淀线，称为沉淀反应。

三、实验材料1. 抗原：待检测的样品。

2. 抗体：已知抗体。

3. 琼脂粉：精制琼脂粉。

4. 生理盐水。

5. 载玻片。

6. 打孔器（直径3mm）。

7. 湿盒。

8. 吸管。

四、实验方法1. 制备琼脂板：用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。

2. 打孔：待琼脂凝固后，按图所示用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂（孔距为5mm）。

3. 加样：在孔中加抗体，在孔的周围加抗原。

加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

4. 扩散：将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱中放置24小时后观察结果。

五、实验结果1. 观察孔间沉淀线的数目与特征。

2. 分析沉淀线的形状、大小、位置等特征，判断抗原与抗体之间的特异性结合。

六、结果分析1. 若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。

2. 若在72小时仍未出现沉淀线，则为阴性反应。

3. 结果分析时，需考虑抗原特异性、抗原浓度、沉淀线形状等因素。

七、讨论双向琼脂扩散试验是一种简单、灵敏、特异的方法，可用于检测抗原与抗体之间的特异性结合。

该实验在临床医学、生物学等领域有广泛的应用，如病原体检测、药物过敏检测、肿瘤标志物检测等。

在本实验中，我们成功进行了双向琼脂扩散试验，并观察到了清晰的沉淀线。

这表明抗原与抗体之间存在特异性结合，验证了实验结果的准确性。

一、实验目的1. 理解并掌握双向双扩散实验的原理。

2. 学习操作双向双扩散实验的方法和技巧。

3. 观察和分析实验结果，提高对免疫学实验技术的认识。

二、实验原理双向双扩散实验是一种定性试验，利用可溶性抗原与相应抗体在琼脂凝胶中各自向四周扩散的特性。

当抗原和抗体在凝胶中相遇时，若二者比例为适当，则在二者比例适当处形成白色沉淀线；若抗原和抗体无关，则不会出现沉淀线。

该实验可用于检测抗原或抗体的纯度、滴定抗体的效价，以及用已知抗原（抗体）检测和分析未知抗体（抗原）。

三、实验材料1. 琼脂凝胶：生理盐水、1%琼脂粉。

2. 试剂：已知抗原、待检血清、生理盐水、稀释液等。

3. 仪器：打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪瓷盒、显微镜等。

四、实验步骤1. 制备琼脂凝胶：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水，煮沸使之溶解。

待溶解的琼脂温度降至60℃左右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。

注意勿产生气泡。

2. 打孔：待琼脂凝固好后，用打孔器打孔，孔径和孔距依不同疫病检疫规程而定，一般孔径3-5mm，孔间距4-7mm。

孔型多为7孔，中央1孔，周围6孔（如梅花孔）。

用针头挑出孔内琼脂。

3. 封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感受微烫即可。

4. 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加入已知抗原，于周围孔加倍比稀释的血清，每个稀释度加1孔。

5. 加样：加样时不要使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

6. 扩散：将琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24-48小时。

7. 观察结果：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原-抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。

若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。

五、实验结果与分析1. 观察到的沉淀线：在实验中，观察到中央孔周围的孔中出现了白色沉淀线，表明已知抗原与待检血清中的抗体发生了特异性结合。

2. 结果分析：通过观察沉淀线的位置、数量和形态，可以判断抗原和抗体的纯度、效价以及是否存在交叉反应。

双向免疫扩散试验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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双相免疫扩散试验
实验原理：抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周凝胶中扩散，当二者发生特异性反应时，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。

本实验用于检测免疫成功与否及所产生的抗体的效价，抗体效价以出现明显沉淀线时的抗体的最高稀释度为判定终点。

一般来说，当效价≥1:16时（可在1:64以上），即可放血收集血清。

试剂和器材：
1.待测血清（抗体）
2.0.4%BSA（抗原）
3.琼脂粉、生理盐水
4.载玻片、吸管、滴管、打孔器、湿盒等
步骤和方法：
1.制备琼脂凝胶：生理盐水配制浓度为12g/L的琼脂，完全溶化至澄清
2.浇板：将载玻片置于水平台上，吸取琼脂加在玻片上，盖满、平整、无气泡
3.打孔：待琼脂凝固后，按下图打孔
4.加样：中心孔加入抗原，1-6孔所加血清的稀释度分别为：
1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256,每孔加样10μl
5.扩散：将加好样的琼脂板放入湿盒中，室温放置1-3d观察结果
结果判定：肉眼观察是否产生乳白色沉淀线
注意事项：
1. 加样时不要溢出空外
2. 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性，时间过短，则沉
淀线不出现或不清楚。

实验(三) 双向免疫扩散法
双向扩散法（double diffusion）又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应，扩散作用使分处两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原—抗体复合物，比例合适时将出现沉淀现象。

一. 实验目的：测定免疫血清的效价
二. 器材与试剂
1. 载玻片
2. 打孔器
3. 微量取液器
4. 稀释板
5. 培养器或带盖培养皿
6. 抗原
7. 免疫血清（抗血清）
8. 琼脂糖（或进口分装琼脂粉）
9. pH 7.2磷酸缓冲生理盐水（PBS）100ml
三. 实验方法
1.琼脂凝胶板的制作
称取0.6g琼脂粉放入三角瓶中，加入50ml PBS, 加热溶解成1.2%的琼脂溶液（冬天则琼脂的浓度为1%），用5~10ml小量筒量取4ml 倾入洁净水平放置的载玻片中，凝固后用打
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实验一双向免疫扩散试验一、实验目的1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术二、实验原理在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。

免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。

抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。

利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。

而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。

因为大多数抗原和抗体的分子量都在20 万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。

而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。

双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。

当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。

如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。

三、实验仪器和试剂1、仪器设备载玻片、打孔器和挑针、湿盒、恒温箱、三角瓶、移液管、微量移液器2、试剂和材料（1）生理盐水（2）1.2%琼脂胶：称取1.2 g 琼脂糖，加100mL 生理盐水，加热溶解（3）抗原及相应免疫血清：抗原为人IgG，抗体为羊抗人IgG 免疫血清四、实验步骤1、制备琼脂玻片：将已加热溶化的1.2%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室温自然冷却凝固。

1. 掌握双向琼脂扩散试验的原理和操作方法。

2. 了解抗原与抗体在琼脂凝胶中相互扩散的规律。

3. 学会观察和分析实验结果，为后续实验奠定基础。

二、实验原理双向琼脂扩散试验是一种检测抗原与抗体相互作用的实验方法。

该实验原理为：将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶板上的小孔中，抗原和抗体在琼脂凝胶中各自向四周扩散，当两者相遇时，在适当的比例处形成白色沉淀线。

根据沉淀线的特征和位置，可以判断抗原与抗体的特异性和浓度。

三、实验材料1. 琼脂凝胶：1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化。

2. 抗原和抗体：已知抗原和抗体，如羊抗人全血清、小牛血清、正常人混合血清等。

3. 打孔器：直径3mm。

4. 吸管：用于加样。

5. 湿盒：用于保持琼脂凝胶湿润。

6. 温箱：用于恒温培养。

四、实验步骤1. 准备琼脂凝胶板：用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化。

用吸管吸取3.5ml琼脂液，趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。

待琼脂凝固后，用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂（孔距为5mm）。

2. 加样：在中央孔中加入抗体，周围孔中加入各种抗原。

加样时注意不要使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

3. 置入湿盒：将加好样品的琼脂板置于湿盒内。

4. 培养观察：将湿盒放入37℃温箱中培养24～48小时。

5. 结果观察：观察凝胶中抗原抗体孔间沉淀线的数目与特征，分析实验结果。

实验中，将羊抗人全血清作为抗体，小牛血清和正常人混合血清作为抗原，分别加入琼脂凝胶板上的小孔中。

经过24小时培养，观察结果如下：1. 中央孔与周围孔之间出现白色沉淀线，表明抗原与抗体发生了特异性结合。

2. 沉淀线清晰，表明抗原与抗体之间的比例适宜。

3. 沉淀线长度与抗原浓度成正比，可以用于半定量分析。

六、实验分析1. 双向琼脂扩散试验是一种检测抗原与抗体相互作用的常用方法，具有操作简便、结果直观等优点。

2. 实验结果表明，羊抗人全血清与羊抗人全血清、小牛血清和正常人混合血清之间具有特异性结合。

一、实验目的1. 掌握双向琼脂扩散试验的原理和操作方法。

2. 学习利用双向琼脂扩散试验检测抗原和抗体的特异性结合。

3. 熟悉实验结果的观察和判定。

二、实验原理双向琼脂扩散试验是一种常用的免疫学实验方法，主要用于检测抗原和抗体的特异性结合。

该实验原理如下：将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶板上的相邻小孔中，抗原和抗体在琼脂凝胶中各自向四周扩散。

当抗原和抗体浓度比例适宜时，二者相遇并在最适当的位置结合，形成白色沉淀线。

沉淀线的形成说明抗原和抗体之间存在特异性结合。

三、实验材料1. 抗原和抗体：如蛋白质、多糖等。

2. 琼脂凝胶：精制琼脂粉、生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）等。

3. 载玻片、打孔器、微量进样器、湿盒、37℃恒温箱等。

四、实验步骤1. 配制琼脂凝胶：按照说明书比例称取琼脂粉，加入适量的生理盐水和磷酸盐缓冲液，隔水煮沸使溶化。

2. 倒制琼脂板：将熔化的琼脂凝胶趁热倒入载玻片上，厚度约为2-3mm。

3. 打孔：待琼脂凝固后，用直径3mm的打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为5mm。

4. 加样：用微量进样器将抗原和抗体分别加入相邻的孔中，注意加样时勿使样品外溢或形成气泡。

5. 扩散：将加好样品的琼脂板置于湿盒内，放入37℃恒温箱中扩散24-48小时。

6. 观察结果：观察琼脂凝胶中是否出现白色沉淀线，并记录沉淀线的特征。

五、实验结果1. 正常情况下，琼脂凝胶中会出现一条清晰的白色沉淀线，说明抗原和抗体之间存在特异性结合。

2. 若抗原和抗体浓度比例不适宜，可能不会出现沉淀线。

3. 若琼脂凝胶中存在其他抗原抗体系统，可能形成多条沉淀线。

六、实验讨论1. 双向琼脂扩散试验是一种简单、灵敏、特异的免疫学实验方法，广泛应用于抗原和抗体的检测。

2. 实验过程中，加样、扩散等操作需注意细节，以确保实验结果的准确性。

3. 通过观察沉淀线的特征，可以初步判断抗原和抗体的特异性结合情况。

七、实验总结本次实验通过双向琼脂扩散试验，成功检测了抗原和抗体的特异性结合。

第1篇一、实验目的1. 了解双向扩散试验的原理和操作步骤。

2. 掌握双向扩散试验在抗原抗体检测中的应用。

3. 学会通过观察沉淀线判断抗原与抗体之间的反应关系。

二、实验原理双向扩散试验是一种经典的血清学检测方法，主要用于抗原与抗体的定性检测。

该实验原理基于抗原与抗体在琼脂凝胶中的扩散和沉淀反应。

将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶平板的小孔中，随着琼脂的凝固，抗原和抗体在琼脂凝胶中向四周扩散。

当抗原与抗体相遇并达到适当比例时，二者结合形成不溶性的复合物，从而在琼脂凝胶中形成可见的沉淀线。

三、实验材料1. 琼脂凝胶平板2. 抗原和抗体样品3. 打孔器4. 微量加样器5. 生理盐水6. 酒精灯7. 温箱8. 显微镜四、实验步骤1. 制备琼脂凝胶平板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水，煮沸使之溶解。

待溶液冷却至60℃左右时，倒入平皿中，厚度为2-3mm。

注意避免产生气泡。

2. 打孔：待琼脂凝固后，用打孔器在平板上打孔，孔径和孔距根据实验要求确定。

3. 加样：用微量加样器将抗原和抗体样品分别加入孔中。

4. 封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感受微烫即可。

5. 培养：将加好样品的琼脂板置于湿盒内，放入温箱中培养24小时。

6. 观察：取出琼脂板，用显微镜观察沉淀线形成情况。

五、实验结果通过观察琼脂凝胶平板上的沉淀线，可以判断抗原与抗体之间的反应关系：1. 若抗原与抗体对应，则形成清晰的沉淀线，表明两者之间存在特异性结合。

2. 若抗原与抗体不对应，则无沉淀线形成，表明两者之间无特异性结合。

3. 若沉淀线模糊不清，表明抗原与抗体浓度不适宜或存在其他干扰因素。

六、实验讨论1. 双向扩散试验是一种简单、快速、可靠的抗原抗体检测方法，在临床医学、疾病诊断、疫苗研究等领域具有广泛应用。

2. 实验过程中，应注意以下几点：a. 琼脂凝胶平板的制备应确保无气泡，以保证抗原和抗体在琼脂中的均匀扩散。

b. 加样时，应避免样品溢出，以免影响沉淀线的形成。

免疫双扩散法的基本原理免疫双扩散法（Immune Double Diffusion）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测特定抗原与抗体之间的相互作用。

该方法基于抗原和抗体在凝胶中扩散的原理，通过观察扩散过程中形成的免疫沉淀线来确定样品中是否存在目标抗原。

免疫双扩散法的基本原理是基于抗原与抗体之间的可逆结合。

在实验中，首先将待测抗原和已知抗原分别与相应的抗体混合，形成抗原-抗体复合物。

然后，将这些混合物分别加入含有琼脂糖的凝胶孔中，使其扩散。

当抗原-抗体复合物扩散到凝胶孔中时，它们会与在凝胶中预先添加的相应抗体结合。

这种结合会导致免疫沉淀的形成，形成可见的沉淀线。

沉淀线的长度和密度与待测抗原的浓度成正比，可以通过比较不同样品中沉淀线的形成情况来定量测定目标抗原的含量。

免疫双扩散法的优势在于其简单性和灵敏性。

无需复杂的仪器和设备，只需一些基本的实验器材即可进行实验。

此外，该方法可以同时检测多个样品中的抗原，因此在高通量的实验中具有一定的优势。

在实际应用中，免疫双扩散法被广泛用于医学诊断、生物学研究和药物研发等领域。

例如，通过检测血清中特定抗原的含量，可以帮助医生诊断某些疾病。

在疫苗研发中，该方法可以用于检测疫苗中抗原的含量和纯度。

此外，免疫双扩散法还可以用于检测抗体的结合特异性以及抗原的相互作用。

然而，免疫双扩散法也存在一些局限性。

首先，该方法对于低浓度的抗原检测较为困难，因为低浓度的抗原很难与抗体有效结合形成免疫沉淀。

其次，该方法的定量结果受到多种因素的影响，如温度、孔的大小和凝胶的浓度等。

因此，在实验过程中需要进行严格的控制和标准化操作。

免疫双扩散法是一种简单而有效的免疫学实验方法，可以用于检测特定抗原与抗体之间的相互作用。

通过观察免疫沉淀线的形成情况，可以定量测定抗原的含量。

尽管存在一些局限性，但免疫双扩散法仍然被广泛应用于医学和生物学领域，为科学研究和临床诊断提供了有力的工具。

沉淀试验——双向免疫扩散试验一、目的要求1. 掌握双向免疫扩散试验的原理和用途；2. 熟悉双向免疫扩散试验的操作方法;二、实验原理可溶性抗原如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等与相应的抗体结合后,在适量电解质存在下,形成肉眼可见的白色沉淀线,称为沉淀试验precipitation;在生理条件下,抗原抗体均带负电荷,使极化的水分子在其周围形成水化膜,成为亲水胶体;当抗原与抗体结合后,表面电荷减少,水化膜变薄；而且由于抗原抗体复合物形成后,与水接触的表面积减少,由亲水胶体转化为疏水胶体;在电解质作用下,各疏水胶体之间靠拢,形成可见的抗原抗体复合物;如果抗原成分不纯,免疫动物后可以产生针对不同抗原成分的多种抗体,于是就形成多条沉淀线,如图2-1所示;图2-1双向免疫扩散试验原理示意图双向免疫扩散试验double agar immunodiffusion test：将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔内,由于抗原和抗体各自向四周扩散,故称双向琼脂扩散试验;若抗原与抗体相对应,两者相遇即发生特异性结合形成抗原抗体复合物,由于该复合物的体积大于琼脂的微小孔隙,于是不能扩散,并逐步聚集在一起形成白色沉淀线;每一对应抗原和抗体可出现一条沉淀线,出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即为抗体效价;由于抗原抗体在琼脂内的扩散受到浓度、分子量大小与表面电荷的影响,所以沉淀线可以出现在抗原孔与抗体孔之间的不同位置;当抗体浓度过高时,沉淀线就靠近抗原孔,为前带；相反,则沉淀线靠近抗体孔,为后带;如果抗原与抗体的比例合适,则沉淀线位于两孔中间,为等价带,如图2-2所示;图2-2 抗原-抗体结合的沉淀带形成原理示意图三、实验用途：沉淀试验广泛应用于病毒抗原、细菌毒素或寄生虫抗原等的诊断图2-3,以及各种免疫血清效价和毒素、抗毒素的测定等;四、材料：1耗材：小平皿、1.5mL的离心管、吸头；2试剂：琼脂糖、8.5% 高渗盐水、待检血清、鸡卵白素ovalbumin, OVA、兔抗OVA阳性血清；3仪器：高压锅、打孔器、移液器、湿盒、恒温箱;五、实验方法：1. 琼脂板的制备：1克琼脂粉溶于100 mL 8.5% 高渗盐水,电陶炉溶解,待温度降至55℃左右时,倾注于平皿中,制成厚约3mm左右的琼脂板;2. 打孔：在琼脂板上打梅花孔如下图所示,孔径为5mm,中间空和周围孔间的距离大约为5mm;将孔内琼脂挑出;用酒精灯火焰封底;3. 加样：将待检血清作倍比稀释,即1：2、1：4、1：8、1：16,分别加至周围孔中,中间加OVA;4. 作用：将琼脂板放置湿盒中,在37℃恒温箱中作用24 h;5. 结果观察：抗原抗体在凝胶为扩散,在两孔之间比例最适合的位置出现沉淀带,出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即抗体效价;五、结果观察若待检血清孔A～F与抗原孔Ag之间产生沉淀线,并与阳性对照所产生的沉淀线吻合成一线,则表示阳性;如无沉淀线或与阳性血清沉淀线交叉,则表示阴性;图2-3 双向免疫扩散试验用于传染病诊断六、注意事项打孔加样时,不要将琼脂划破,以免影响沉淀线的形成;孔间距要相等;加样时注意换吸头;七、思考题1. 双向琼脂扩散实验中怎样通过沉淀线来判断抗原与抗体是否对应2. 双向琼脂扩散实验中怎样判断待检血清标本中的抗原或抗体的含量3. 双向扩散试验怎样分析抗原、抗体纯度4. 什么是带现象什么是前带什么是后带其临床意义是什么。

双向扩散法—抗原分析原理双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法;沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例,而且与其分子大小及扩散速度相关;当抗原抗体存在多种系统时,可呈现多条沉淀线以至交叉反应;材料生理盐水1%琼脂管每管约4ml载玻片打孔器及打孔模板微量加样器及塑料吸头抗体及抗原1、2、3、4、5、6;湿盒方法1．将已溶化的1%琼脂盐水管放56~60℃水浴箱中平衡温度备用;2．将载玻片置于水平桌面上,倾注已溶化琼脂~4ml,使成厚度约琼脂板;3．凝固后,将打孔模板置于琼脂板下,然后用打孔器打孔,根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型;本次实验采用三角型,即每一个三角型的三个孔为一组;因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成两组;否则,如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出,如制成三角型三组,因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果;4．用微量加样器加抗体各10μl;各组所余两孔各按抗原1、2为一组,3、4为二组,5、6为三组,分别各加入10μl;注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头,以防止交叉现象影响实验结果;5．作好记录,放湿盒中,置37℃温箱,24小时后观察结果;结果说明：1融合性沉淀弧,说明两孔中抗原相同,为同一性反应;2两沉淀线独自形成并形成交叉,说明两孔中的抗原完全不同,为非同一性反应;3融合性沉淀弧出现支线,或同时有另一条或两条沉淀线,说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分,此为部分同一性反应;单向免疫扩散法Single radil immunodiffusion—正常人群IgG正常值检测原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔,并在孔中加入定量的抗原,当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合,既形成白色沉淀环,其直径或面积与抗原浓度呈正相关;同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线,即可用以定量检测未知标本的抗原浓度mg/ml或IU/ml;应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的含量及正常值;材料1．示教部分：2%离子琼脂或生理盐水琼脂内含2‰NaN3标准马抗人IgG血清抗体北京生物制品研究所生产参考蛋白工作标准北京生物制品研究所生产PBS玻璃板或载玻片;打孔器孔径3mm及打孔模板;微量加样器湿盒容器内加湿纱布或泡沫塑料2．实验部分：已制备好的含有马抗人IgG抗体的1%琼脂板;1:50稀释的单人份待检血清标本;打孔器、模板、微量加样器及湿盒等;方法一标准曲线的制备：示教1．按照玻片的大小,以能制做1~厚度的琼脂板的量,分装其1/2量的2%盐水琼脂;例如,用普通载玻片制做时其1%琼脂量为4ml,在分装2%盐水琼脂时既为2ml;溶化后置56~60℃水浴中平衡温度备用;2．稀释抗体：将标准抗人IgG抗体按其效价用 PBS做成1倍稀释;例如,血清效价为1:140,原浓血清既应稀释为1:70;并分装试管,其分装量应与2%盐水琼脂量相等;3．制板：将已稀释的抗人IgG抗体于56℃水浴中预热约半分钟,再倾注于已溶化并维持56~60℃的2%盐水琼脂管中,用拇指将管口堵紧;翻转试管1~2次,将抗体与琼脂混合均匀注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡,迅速倾注于玻片上,待凝固后既制成;4．打孔：将琼脂板置于模板上,在同一直线上用打孔器打孔5个,孔距10mm;5．稀释不同浓度的参考蛋白标准工作标准：应根据制品说明进行稀释,例如：工作标准中免疫球蛋白含量,IgG为100单位/ml,微克/单位,其稀释范围为1:10、1:20、1:40、1:80及1:160;6．加样：将已稀释的不同浓度的工作标准顺序用微量加样器每孔加入10μl注意：每一稀释度均应更换塑料吸头;7．置湿盒中,放37℃温箱,24小时后观察结果;8．用量角规测量并记录沉淀环直径,然后以沉淀环直径为纵座标,不同单位/ml为横座标,绘制成标准曲线;在制做标准曲线时,为尽量减少误差,至少应做两份以上标准板;二正常人血清中IgG值的测定：1．将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上,每一琼脂板可打孔4个孔径3mm,孔距10mm;2．将单份正常人血清用 PBS分别作1:50稀释;3．用微量加样器分别取1:50稀释的单人份血清标本10μl加入孔中,每份标本应各加两孔每份标本均应更换塑料吸头;4．作好标记置湿盒中,放37℃温箱,24小时后观察结果;结果测量各份标本的沉淀环直径并记录结果,然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的单位/ml,并换算为mg/ml;将全班实验结果做出统计及均值,并写出较完整的实验报告;。