离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定
【实验目的】
1.了解离心分离技术的原理与分类。
2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。
【实验原理】
1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分。因此
用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。
2.用过氧化物酶标记的抗IgM，在一定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与
B细胞表面的IgM结合，通过DAB显色，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。
【实验步骤】
一.细胞分离
1.将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上，加入8ml的生理盐水，用磨棒磨碎脾脏后过滤，即
获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积至4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离心液（比重1.088）的试管一支，用移液器加入细胞混合液4ml。
5.将试管离心1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离心后取出试管，观察细胞分层，底层为红色的红细胞，依次向上为细胞分离液和生理
盐水，在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。
7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管，并加2ml PBS洗涤一次，1500rpm
离心5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上，自然干燥后，
可进行细胞类型鉴定。
二.细胞鉴定
1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片，自然干片
2.在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔标出细胞范围，蒸馏水洗三次。
3.配制封闭液。室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片，滴加适量
的封闭液于右侧涂片（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
5.滴加DAB显色液，37 ℃显色30分钟，蒸馏水洗3次，干片后，显微镜下观察。
【注意事项】
1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入，使脾细胞混合悬液与分离液形成
明显的界面，小心放取试管，保持界面完整，避免打乱界面，影响分离效果。
2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性结果。
3.DAB潜在致突变作用，请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。
【实验结果】
如下图：
如图所示，计数出B细胞含量在43%左右。
【实验讨论】
脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。在脾脏中B淋巴细胞约占55%，根据实验结果，可能是由于操作精确，或染色不许够彻底等因素，导致结果略偏低。
