淋巴细胞分离实验

细胞计数

试剂和仪器 实验步骤 注意事项
试剂和仪器

血球计数板，盖玻片，Hanks液， RPMI1640，2ml（5ml）吸管，华氏 管，移液尖，微量移液器，显微镜
实验步骤



1、准备计数板： 2 、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞 悬液 3 、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许 细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4 、计数：在显微镜下，用 10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数

淋巴细胞分层液（ Ficoll ，低温避光保 存），Hanks液，RPMI1640，PBS，小 牛 血 清 ， 华 氏 管 ， 50ml 离 心 管 ， 2ml （5ml）吸管，水平离心机
注意事项




1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释 2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加， 以免冲散界面 4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上 清液或分层液而导致血小板污染
实验步骤

3.20℃，1500r/min，离心30min

4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入 另一试管中
实验步骤



5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min 离心10min ，弃上清 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min， 弃上清 7.适量的培养基重悬细胞 ，计数
试剂和仪器
淋巴细胞 单核细胞
外周血
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
1.075~1.090 1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀 释 外 周 血
稀释的血浆、 血小板
1500rpm, 20℃ , 30min
PBMC
Ficoll
Ficoll
红细胞 粒细胞
实验步骤


1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的 管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）
免疫学实验一
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离 原理 试剂和仪器 实验步骤 注意事项

原理

外周血各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
红细胞
ຫໍສະໝຸດ Baidu
1.093 1.092
实验要求


华氏管中加入血样后，用记号笔作好 标记 实验完毕后，请清洗试管、吸管和计 数板
试验报告要求

试验内容 (原理、步骤), 结果 试验注意事项
实验步骤

5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项



1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带 气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀 释不当，需重新制备细胞悬液、计数