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原生质体紫外诱变选育D—核糖高产菌株的研究以枯草芽孢杆菌XB02为出发菌株，采用紫外诱变原生质体的方法，获得了1株D-核糖高产菌株T32，其摇瓶发酵产糖达103.6g/L。
遗传性状稳定良好。
标签：D-核糖；草芽孢杆菌；原生质体；紫外诱变D-核糖是一种五碳糖，是RNA等的组成糖，在医药中间体、医疗保健、运动营养等领域具有广泛的用途。
发酵法是目前最先进的D-核糖生产方法，D-核糖高产菌株的选育一直是国内外从业者关注的问题[1]。
去除了细胞壁的原生质体经诱变更易发生突变[2]，本实验旨在对D-核糖产生菌进行原生质体诱变，以期获得高产菌株。
1 材料与方法1.1 菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）转酮醇酶变异株XB02。
1.2 培养基1.2.1 完全培养基牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.1%，NaCl 0.5%，琼脂2.0%，pH6.7-7.0。
1.2.2 再生培养基完全培养基加入0.5mol/L的蔗糖和0.02mol/L的MgCl2，pH6.7-7.0。
1.2.3 筛选培养基[3]完全培养基中加入6.0%的D-核糖，pH6.7-7.0。
1.2.4 发酵培养基葡萄糖20%、玉米浆3%、（NH4）2SO4 0.6%、CaCO3 3.6%、MnSO4·4H2O 0.005%。
pH 6.7-7.0。
1.3 溶液1.3.1 高渗缓冲液丁二酸钠42.57g/L，蔗糖170.0g/L，MgCl2 4.06g/L，pH 6.7，115℃灭菌20min1.3.2 蛋清溶菌酶溶液高渗溶液配制浓度为1mg/ mL的蛋清溶菌酶液，微孔过滤除菌。
1.4 方法1.4.1 出发菌株的培养出发菌株接种于20mL /250mL完全培养基培养基的三角瓶，220r/min，36℃培养。
定时测定OD590nm，用对数中后期的菌体进行原生质体制备及诱变。
1.4.2 原生质体制备取5mL培养液，4500r/min，离心15min，弃上清。
D-核糖的菌种选育及发酵研究的开题报告
一、研究背景
D-核糖是一种重要的有机化合物，广泛应用于医药、生物工程、食品等领域，但目前仍然存在着生产成本高、生产周期长、纯度不高等问题，因此需要开展相关研究以提高其生产效率和质量。
本研究旨在选育一种高效产生D-核糖的菌种，探究其发酵特性及优化发酵条件，为D-核糖生产提供理论依据和实践指导。
二、研究目的
1. 选育一种高效产生D-核糖的菌种；
2. 探究该菌株的发酵特性；
3. 优化该菌株的适宜发酵条件，提高D-核糖产量和纯度；
4. 探究各因素对D-核糖产量和纯度的影响，建立相应的反应模型，为进一步提高D-核糖产量和纯度提供参考。
三、研究方案
1. 选择具有D-核糖生产潜力的微生物菌株进行筛选和选育；
2. 分别在液态和固态培养基上进行发酵试验，观察不同培养条件下D-核糖产量和纯度的变化，确定最佳培养条件；
3. 通过优化发酵条件和营养成分组成，提高D-核糖产量和纯度；
4. 考察温度、pH、培养时间及其他因素对D-核糖产量和纯度的影响，建立相应的反应模型。
四、预期成果
1. 选育出高效产生D-核糖的菌株；
2. 确定最佳发酵条件，提高D-核糖产量和纯度；
3. 建立D-核糖产量和纯度的影响因素模型，为生产实践提供参考。
D-核糖发酵生产工艺技术D-核糖，原料药，是生产抗肿瘤药物以及抗艾滋病药物的前体，市场价格在16万-20万/吨现转让D-核糖，D-ribose的年产2000吨生产线项目的全套核心技术经验及数据资料，包括三级发酵详细配方、菌种室详细操作技术、带操作规范的批记录模板、后提取相关技术、工程图纸及详细参数、项目资金详细申请报告等一、项目背景1、D－核糖产品发展现状及市场前景D-核糖是生物体内核糖核酸（RNA），脱氧核糖核酸（DNA）以及若干辅酶、维生素及核苷酸的组成成份，在医药、医疗、食品、饲料等领域用途广泛。
同时，目前它作为一种新型的运动营养保健品已风行欧美，具有广阔的市场前景及显著的经济效益。
在食品工业上，D－核糖可用来合成多种呈味物质。
核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，D-核糖是许多核酸类药物的重要中间体，可用于三氮唑核苷、腺苷、胸苷、胞苷、氟腺嘧啶核苷、2-甲基腺苷、威他毒素、吡唑毒素、腺苷旦氨酸等许多药物的生产中。
随着生物制药和抗病毒、抗癌及核酸类药物的深入研究，核酸药物的发展，在抗病毒、抗肿瘤方面的独特作用的D－核糖作为原料药的需求量将会越来越大，具有广阔的市场前景。
2、市场分析D-核糖的应用主要集中在医药及医药中间体、医疗保健、运动营养等领域。
但是D－核糖长期以来作为昂贵的系列生化试剂。
随着用微生物发酵法可大规模生产D－核糖，价格低廉，解决了核黄素、病毒唑等药物的原料来源。
随着核酸药物的发展，特别是它在抗病毒、抗肿瘤方面的独特作用，D－核糖作为各种核酸药物的起始原料，具有很大的潜在市场。
目前D-核糖国际市场的需求量已从2001年的1,000吨增长到2006年的2,500吨，从2004年开始，呈迅速增长趋势。
预计未来五年，世界市场对D-核糖的年需求量将达到8,000吨：从供给方面看，由于发酵法生产D-核糖项目技术含量高，目前只有几家公司掌握与垄断，行业进入壁垒很高，既要掌握优良菌种又要掌握良好的工艺才能进入该领域。
补料发酵生产d-核糖工艺的研究
补料发酵生产d-核糖是一种重要的工艺过程，其主要目的是通过微生物的代谢作用将底物转化为d-核糖。
当前，常见的补料发酵生产d-核糖工艺主要包括两种，即批次发酵和连续发酵。
批次发酵是指将底物一次性加入反应器中，并在适宜的温度、pH 值和压力条件下进行发酵过程。
该过程的关键是选择合适的微生物菌株和富含营养物的工艺基质，以提高d-核糖的产率和纯度。
此外，加入一定量的调节剂和抗生素，可有效地控制微生物的生长速度和代谢产物的质量。
连续发酵则是将底物分为多个部分，在不停顿地补充基质的情况下进行发酵过程。
该过程能够实现稳定的d-核糖产量和纯度，但需要更高的技术要求和反应器连续工作的持久性。
总的来说，补料发酵生产d-核糖工艺是一项复杂的技术工作。
需要综合考虑工艺基质、微生物菌株的选择和调控，以及恰当的使用调节剂和抗生素等方面的因素，才能实现高效的d-核糖生产。
代谢控制发酵试题库1. 脱敏作用：变构酶经特定处理后，不丧失酶活性而失去对变构效应物的敏感性。
注：处理方法：①使变构酶解聚，②基因突变2．分解代谢物阻遏：当细胞具有一优先利用的底物（通常是，但并不总是葡萄糖）时，很多其他分解反应途径受到阻遏3. 营养缺陷型：就是指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。
P32 最典型例子：高丝氨酸营养缺陷型（Hom﹣）或苏氨酸营养缺陷型（Thr﹣）菌株达到赖氨酸的积累4. 平衡合成：底物A经分支合成途径生成两种终产物E与G，由于a酶活性远大于酶b ,结果优先合成E。
E过量后就会抑制a酶，使代谢转向合成G。
G过量后，就会拮抗或逆转E的反馈抑制作用，结果代谢流又合成E，如此循环。
5. 优先合成：底物A经分支合成途径生成两种终产物E与G，由于a酶活性远大于酶b ,结果优先合成E。
E过量后就会抑制a酶，使代谢转向合成G。
G合成达到一定浓度时就会对c酶产生抑制作用。
6. 限量补充培养法：将经适当稀释的浓缩处理液涂布于含有微量蛋白胨或0.1%完全培养基成分的基本培养基平板上。
经培养后，野生型细胞迅速生长成较大菌落，而缺陷型细胞生长缓慢只能形成小菌落。
这些小菌落大多数为营养缺陷型，将其转接到完全培养基斜面保存待测。
7. 代谢互锁指从生物合成途径来看，酶受一种与此代谢途径完全无关的终产物的控制，它只是在较高浓度下才发生，而且这种抑制(阻遏)作用是部分性的，不完全的。
8. 反馈抑制的调节类型可以分为以下几种：（1）单功能途径中酶活性的调节类型：①前体激活，②补偿性激活。
（2）多功能途径中酶活性的调节类型：①协作反馈抑制或称多价反馈抑制②合作反馈抑制③积累反馈抑制④顺序反馈抑制⑤假反馈抑制：指结构类似物的反馈抑制⑥同功酶9. 转导指利用转导噬菌体为媒介而将供体菌的部分DNA导入受体菌中，从而使受体菌获得部分遗传性状的现象。
Vol.26No.12000-02华 东 理 工 大 学 学 报 J ournal of Eas t China University of Science and Tech nology **现在苏州市宏达集团有限公司工作。
收稿日期:1999-08-30作者简介:高淑红(1975～),女,山东淄博人,硕士,研究D -核糖产生菌的选育及发酵单位的提高。
文章编号:1006-3080(2000)01-0037-04D -核糖产生菌的选育及发酵高淑红, 邱蔚然*, 丁庆豹, 蔡 华**, 孙 强**(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237) 摘要:以枯草芽孢杆菌D -2为出发菌株,经紫外诱变,得到一株莽草酸缺陷型突变株D -202,摇瓶发酵D -核糖产量可达到52.6g /L 。
该菌遗传稳定性良好。
通过发酵条件的优化,最高产量可达65g /L 。
经2t 发酵罐中试,发酵单位达到50g /L 。
关键词:D -核糖;枯草芽孢杆菌;诱变育种;发酵中图分类号:Q 55;TQ 920文献标识码:A D -核糖广泛应用于合成核黄素,抗病毒剂及风味增强剂。
它可以用枯草芽孢杆菌的转酮醇酶(TKT )缺陷型突变株发酵生产[1～2]。
这些突变株能够将部分碳源经由戊糖磷酸途径代谢,转化成D -核糖-5-磷酸。
由于TKT 缺陷,D -核糖-5-磷酸在胞内积累,经脱磷酸生成D -核糖分泌于胞外[3]。
近年来,国内开始研究D -核糖的生产,但产量不高。
用于工业化生产还有一定的局限性[4]。
本实验室利用现有的保藏菌种D -2,对其进行紫外诱变,筛选莽草酸营养缺陷型突变株,并对发酵条件进行了研究。
1 材料和方法1.1 出发菌株枯草芽孢杆菌D -2,本实验室保藏菌种。
1.2 培养基完全培养基(g /L):D -葡萄糖5.0;牛肉膏 2.0;酵母膏 3.0;蛋白胨10.0;硫酸镁 2.0。
基本培养基(g /L ):D -葡萄糖5.0;硫酸铵 2.0;柠檬酸钠 1.0;磷酸氢二钾 6.0;磷酸二氢钾4.0;硫酸镁0.2。
补充培养基:于基本培养基中加入适量莽草酸。
种子培养基(g /L):山梨醇20.0;玉米浆22.0;磷酸氢二钾 3.0;磷酸二氢钾 1.0。
发酵培养基(g /L ):D -葡萄糖200.0;玉米浆22.0;硫酸锰0.5;硫酸铵5.0;碳酸钙20.0。
斜面培养基(g /L):D -葡萄糖10.0;牛肉膏10.0;酵母膏5.0;蛋白胨10.0;Na Cl 5.0。
1.3 菌种诱变将出发菌株接种在完全培养基中培养过夜,使之处于对数生长期。
收集细胞用生理盐水洗涤两次后悬浮于生理盐水中,调整细胞浓度为每m L 108个左右,用紫外线照射后,涂布于完全培养基平板上,32℃培养2d 。
取单菌落分别点于基本培养基和补充培养基平板上,32℃培养2d 后选取在补充培养基上生长良好,而在基本培养基上不生长的菌落作成斜面备用。
1.4 分析方法菌浓度的测定:稀释10倍后于660nm 处测OD 值(752型紫外分光光度计,上海第三分析仪器厂)。
葡萄糖的测定:葡萄糖试剂盒测定法(卫生部上海生物制品研究所)。
D -核糖的测定:苔黑酚法[5]。
2 结果与讨论2.1 紫外诱变结果诱变时间与死亡率及正突变率的关系见表1。
随着紫外照射时间延长,菌死亡率增加,至70s 后,存活菌几乎为零,且正突变率低。
故以下采用40s 进行紫外照射。
将出发菌株D-2纯化分离出单菌落,经紫外照射等连续处理,分离出莽草酸缺陷型突变株,摇瓶复筛最后得到一株D -核糖的高产菌株D-202。
将D-2、D-202培养6h 使其处于对数生长期,经显微镜观察,原种D -2呈8～10个以上细胞组成的长链,而D -202呈2～4个细胞组成的短链,这说明短链细菌37适合于D-核糖发酵。
表1 诱变时间与死亡率及正突变率关系Table1 Rela tio n o f mutatio n time and death r ate,po sitiv e m uta tio n rateM utation time/sDeathrate(%)Positiv e mutationrate(%)Production ofD-ribose/(g·L-1) 0 0 032.9 2043.321.539.33057.340.348.34070.056.849.85085.050.243.67099.030.437.49099.99015.7 D-202经摇瓶培养72h,D-核糖产量52.5g/L,比出发菌株D-2高出60%左右(表2)。
将D-202突变株试管斜面连续传代10次后,核糖产量在50～55g/L之间,没有发生显著变化,说明D-202是一个稳定的突变株。
表2 D-202与出发菌株性状比较Table2 Co mpa riso n o f D-ribose productivity betw een stain D-202a nd pa rent stainStainOD66048h72hD-ribos e fo rm ed/(g·L-1)48h72h D-2 11.74 13.5825.232.9D-2028.309.7641.352.62.2 正交实验设计优化发酵配方实验选择了对D-核糖产量影响最大的5个因素,每个因素取4个水平作正交实验。
其实验与结果列于表3、4。
表3 各因素的水平设置(单位:g/L)Table3 T he lev el o f each fa ctor(unit:g/L)Factor Glucos e Gluconate CS L*(N H4)2SO4Additive component Th e firs t level10030227——(A)Th e second lev el12040246Yeast extract5.0(B) Th e third lev el14050265Trp0.1(C)Th e fourth level16060284Leu0.1(D) *CSL—Corn steep l iquor表4 正交实验结果Table4 The r esult of o r tho go nal ex perimentNo.FactorGlucose Gluconate CSL(N H4).D-ribose formed/(g·L-1)11111A37.521222B44.531333C40.241444D51.452123D34.962214C44.072341B43.682432A49.993134B36.6103243A37.7113312D38.7123421C47.0134142C30.8144231D42.5154324A44.7164413B50.8k143.435.042.842.742.5k243.142.242.841.043.9k340.041.842.340.940.5k442.449.840.944.241.9Rang e 3.414.8 1.9 3.3 2.038 华 东 理 工 大 学 学 报第26卷 由表3、4中可以看出,最佳培养基配方为(g /L ):葡萄糖100;葡萄糖酸钙60;玉米浆28;硫酸铵4,亮氨酸0.1。
通过极差分析,可知几种因素对D -核糖生产的影响大小顺序如下:B >D>A>E >C 。
其中以葡萄糖酸钙影响最大,其余因素的影响均不大。
考虑到降低成本,可以不添加氨基酸,而使玉米浆的含量略微提高。
故确定最佳培养基配方为(g /L ):葡萄糖100,葡萄糖酸钙60,玉米浆30,(N H 4)2SO 45,M nSO 40.5,pH7.2。
De Wulf [6]等曾通过磷酸戊糖途径的支路,添加葡萄糖酸以提高发酵单位,以100g /L 葡萄糖和100g /L 葡萄糖酸钙经110h 发酵,D -核糖达到60g /L 。
而我们以正交试验得到的最佳培养基经72h 发酵即可产D -核糖65g /L 。
若发酵过程的pH 加以调控,发酵单位尚可进一步提高。
2.3 不同氮源比较实验比较了以玉米浆,玉米粉,酵母膏,牛肉膏,蛋白胨作氮源的差异,结果见表5。
表5 不同氮源比较Table 5 Effect o f nitr og en so urces on the D -ribosepr oduc tiv ityNitrogen sou rce /(g ·L -1)OD 66024h48h72h D -ribose formed /(g ·L -1)24h 48h 72h CL S 30 6.667.568.1020.742.353.7Corn glu ton meal 10 6.957.737.9019.941.955.3Yeast extract 10 4.615.09 5.2323.241.353.9Beef ex tract 10 1.781.67 1.88 8.810.110.6Pepton 102.123.883.976.717.119.9 由表可知,牛肉膏,蛋白胨作氮源,既不利于菌体生长,又不利于D -核糖的生产。
而以玉米浆,玉米粉或酵母膏作氮源,区别不大。
考虑到降低成本,以玉米浆作氮源较好。
我们对所用的玉米浆、酵母膏中的氨基酸含量作了测定,其中芳香族氨基酸的氨基氮与文献值相近,而且,酵母膏中氨基酸的含量大约是玉米浆的3倍,故用玉米浆替代酵母膏作氮源,浓度高出3倍是合适的。
2.4 接种量的影响实验比较了0.5%～10%接种量的差异,结果示于表6中。
由表中可知,接种量对第一天的结果影响最大,D -核糖的产量可相差1倍以上。
但48h 以后,影响已不是很大。
接种量过低不利于D -核糖的生产。
接种量在1%～10%之间相差不大。
其中以5%的接种量为最佳。
表6 不同接种量的比较Table 6 Effect of ino culum v o lume o n th e D -ribo sepro ductivityInoculu m volu me(%)OD 66024h 48h 72h D -ribos e fo rm ed /(g ·L -1)24h 48h 72h 0.1 4.910.2 6.2 8.632.744.41.07.313.413.310.841.452.92.07.213.813.512.643.252.35.08.7 9.9 8.926.054.065.010 11.6 12.412.128.041.053.02.5 发酵罐实验实验采用2t 发酵罐,装液量 1.2t ,转速250r /min ,通风1∶0.6(V /V ),中间不控制pH 值。
