关于发酵染菌及防治课件
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发酵染菌及防治课件
• 2、应用
• （1）空气过滤系统。 • （2）液体培养基。 • （3）噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
（二）平板划线培养或斜面培养检
查法
• １、平板划线培养
• 固体平板置培养箱中37℃，保温24h，检查无菌 即可使用。将需要检查的样品在无菌的平板上划 线，分别置37℃、27℃培养，以适应嗜中温和低 温菌的生长，一般在8h后即可观察。
• （1）原因：产生菌孢子和种子质量不好、发酵条 件差、培养基质量差（灭菌不当）等。
• （2）措施：补充合适的氮源，或磷酸盐，提高发 酵温度。
• 2、pH异常
• 发酵过程中一般pH是有一定规律的。如不符合规 律则是发酵异常。
• （1）原因：培养基原料差、灭菌不彻底、加糖过 于集中等。
• （2）措施：可通过加酸或碱调节。最好加入一些 生理酸性或碱性盐或缓冲液来调节。
3、溶氧水平异常（p164）
• 正常发酵过程的溶氧水平是由一定规律的 。如果溶氧水平与一般规律不一致即发生 了异常变化。
• （1）原因：染菌。染菌的种类：好氧菌 、厌氧菌。菌体代谢异常、某些设备或工 艺发生故障或变化。
• （2）措施：检查无菌空气、管道是否渗 漏。搅拌设备是否正常运行等。
4、泡沫过多
（一）显微镜检查
• 1、细菌用革兰氏染色，必要时进行芽孢染色 和鞭毛染色，霉菌、酵母菌可直接观察。
（二）肉汤培养检查法
• 1、方法
• 液体培养基的检查:将需要检查的样品接入经灭菌， 并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置37℃和27℃ 分别培养24h，进行观察，观察肉汤是否浑浊。并 取样镜检。
• 无菌空气的检查:将葡萄糖酚红肉汤培养基装在吸气 瓶中，灭菌后，37℃培养24h，若培养液未变浑浊 ，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，把过滤后的空 气引入吸气瓶中，培养后，若培养液变混或变黄色 ，表明空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题。
发酵技术基础—发酵染菌及其防治
培养基营养营养丰富，生产菌防御杂菌能 力低，容易污染杂菌。
如在此阶段染菌，应根据情况进行处理。
（2）发酵前期染菌
发酵前期最易染菌，且危害最大。
原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且 还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。
在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。
措施
可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值， 缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基 养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种 再用。
2 染噬菌体的检测 采用双层琼脂平板法：
在培养皿上倒入培养生产菌的培养 基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加 入20％～30％培养好的种子液，再加入怀 疑染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。 培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑。
3.污染噬菌体后的措施
❖ 并罐法。 ❖ 轮换使用菌种或使用抗性菌株。 ❖ 放罐重消法 ❖ 罐内灭噬菌体法
1 、发酵染菌对不同品种的影响
放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此
不 染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染 同 菌 酵母菌为多。
青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接
不 同
产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱
产 导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或
品 后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青
本章小结
➢ 染菌对发酵的影响 ➢ 发酵染菌对提炼和产品质量的影响 ➢ 染菌的原因分析 ➢ 无菌状况的检测 ➢ 染菌情况分析 ➢ 染菌的防止 ➢ 发酵染菌后的措施
➢ 染噬菌体的防治
污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异， 如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难 过滤。
由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液 储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。 染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤 收率，直接影响提炼总收率。
如在此阶段染菌，应根据情况进行处理。
（2）发酵前期染菌
发酵前期最易染菌，且危害最大。
原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且 还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。
在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。
措施
可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值， 缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基 养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种 再用。
2 染噬菌体的检测 采用双层琼脂平板法：
在培养皿上倒入培养生产菌的培养 基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加 入20％～30％培养好的种子液，再加入怀 疑染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。 培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑。
3.污染噬菌体后的措施
❖ 并罐法。 ❖ 轮换使用菌种或使用抗性菌株。 ❖ 放罐重消法 ❖ 罐内灭噬菌体法
1 、发酵染菌对不同品种的影响
放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此
不 染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染 同 菌 酵母菌为多。
青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接
不 同
产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱
产 导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或
品 后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青
本章小结
➢ 染菌对发酵的影响 ➢ 发酵染菌对提炼和产品质量的影响 ➢ 染菌的原因分析 ➢ 无菌状况的检测 ➢ 染菌情况分析 ➢ 染菌的防止 ➢ 发酵染菌后的措施
➢ 染噬菌体的防治
污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异， 如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难 过滤。
由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液 储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。 染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤 收率，直接影响提炼总收率。
最新发酵工程精品课件(7)第七章 发酵染菌及其防治
先置于37℃培养6h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。
4、双层平板培养法
• 用于噬菌体的检查。
注意点
无菌试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（红色→ 黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌 落的出现，即可判断为染菌。 有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项 参数确有可疑染菌，并经镜检等其它方法确认连续三次 样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。 一般来讲，无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至 本批（罐）放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。 无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品，以便能及 早发现染菌。
青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因
此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青 霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严 重。 核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营 养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰 富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的
干扰生产菌的代谢，影响产物的生成 。
发酵后期染菌
•
影响相对较小 。
8
三、不同染菌原因对发酵的影响
种子带菌
将导致染菌范围不断扩大，使生产蒙受重 大损失。 使发酵大面积染菌。
空气带菌 培养基或设备 灭菌不彻底
一般不具延续性，使单个（批）发酵罐 发酵失败。
设备渗漏
•
染菌几率较大。
9
四、不同染菌程度对发酵的影响
大。
发酵过程
青霉素的发酵 链霉素的发酵 四环素的发酵 谷氨酸的发酵 柠檬酸的发酵
危害最大的杂菌种类
细短产气杆菌 细短杆菌、假单孢杆菌 双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌 噬菌体 青霉菌
•
7
《发酵过程控制染菌》课件
总结词
生产设备未彻底清洗干净
详细描述
该制药企业在进行某抗生素发酵生产时，由于生产设备未彻底清洗干净，导致染 菌。染菌后，菌体迅速繁殖，消耗培养基中的营养物质，导致发酵产物产量下降 。同时，菌体代谢产物对发酵产物产生拮抗作用，进一步影响产量。
案例二：某生物制品企业发酵染菌案例
总结词
操作人员失误
详细描述
利用特异性抗体与染菌细胞表 面抗原的结合反应，通过抗原
-抗体反应检测染菌。
分子生物学检测法
利用染菌细胞中特定基因或核 酸序列的检测，判断是否存在
染菌。
察细胞形态、大 小、排列等特征，判断是否存
在染菌。
流式细胞术
利用流式细胞仪对细胞进行快 速计数和分选，通过细胞表面 抗原和荧光染色判断染菌情况 。
05
总结与展望
当前控制染菌的不足之处
技术局限性
对新型染菌的应对不足
当前控制染菌的方法仍有许多局限性 ，如无法完全消除染菌、操作复杂、 成本高等问题。
随着微生物种类的增多和变异速度的 加快，现有控制方法对新出现的染菌 应对不足，缺乏有效的防控手段。
缺乏系统性的研究
目前对染菌控制的研究较为分散，缺 乏系统性的研究和理论支持，难以形 成有效的防控策略。
选择合适的检测方法
根据实际情况选择适合的检测方法，以提高 检测准确性和可靠性。
及时处理染菌
一旦发现染菌，应及时采取措施处理，以避 免对发酵过程产生不良影响。
03
发酵过程控制染菌的措施
工艺控制措施
灭菌措施
在发酵开始前，对培养基和设备进行 彻底的灭菌，以消除潜在的微生物污 染源。
无菌过滤
对于某些发酵过程，可以使用无菌过 滤技术来确保培养基和其他添加物的 无菌状态。
生产设备未彻底清洗干净
详细描述
该制药企业在进行某抗生素发酵生产时，由于生产设备未彻底清洗干净，导致染 菌。染菌后，菌体迅速繁殖，消耗培养基中的营养物质，导致发酵产物产量下降 。同时，菌体代谢产物对发酵产物产生拮抗作用，进一步影响产量。
案例二：某生物制品企业发酵染菌案例
总结词
操作人员失误
详细描述
利用特异性抗体与染菌细胞表 面抗原的结合反应，通过抗原
-抗体反应检测染菌。
分子生物学检测法
利用染菌细胞中特定基因或核 酸序列的检测，判断是否存在
染菌。
察细胞形态、大 小、排列等特征，判断是否存
在染菌。
流式细胞术
利用流式细胞仪对细胞进行快 速计数和分选，通过细胞表面 抗原和荧光染色判断染菌情况 。
05
总结与展望
当前控制染菌的不足之处
技术局限性
对新型染菌的应对不足
当前控制染菌的方法仍有许多局限性 ，如无法完全消除染菌、操作复杂、 成本高等问题。
随着微生物种类的增多和变异速度的 加快，现有控制方法对新出现的染菌 应对不足，缺乏有效的防控手段。
缺乏系统性的研究
目前对染菌控制的研究较为分散，缺 乏系统性的研究和理论支持，难以形 成有效的防控策略。
选择合适的检测方法
根据实际情况选择适合的检测方法，以提高 检测准确性和可靠性。
及时处理染菌
一旦发现染菌，应及时采取措施处理，以避 免对发酵过程产生不良影响。
03
发酵过程控制染菌的措施
工艺控制措施
灭菌措施
在发酵开始前，对培养基和设备进行 彻底的灭菌，以消除潜在的微生物污 染源。
无菌过滤
对于某些发酵过程，可以使用无菌过 滤技术来确保培养基和其他添加物的 无菌状态。
第七章发酵染菌及防治
（3）发酵后期染菌 空气，补料，设备渗漏，泡沫
五、染菌隐患的处理
染菌可造成严重后果，在正式发酵前，必须做到以下几点：
①严格按照生产工艺要求的各项指标、参数、条件进行操作； ②投产前济宁整个发酵系统的无菌测试； ③严格工人的管理，实行操作记录制度；
④加强在线监测技术手段，各种生物传感器、探头要定期校正； ⑤定期对设备进行检修。
噬菌体 ；杂菌 。
理化指标异常 如：氨基酸发酵或某些抗生素发酵中感染杂菌，
培养液pH下降很快，生物热产生多。
代谢 异常
糖、氨基氮等变化不正常，如感染噬菌体。
2.发酵异常
（1）菌体浓度异常 偏离固有规律，种子质量的影响；导致代谢
缓慢；感染噬菌体或杂菌。
（2）pH异常
培养基质量、灭菌效果、补糖等影响；是所有代 谢反应的综合反映。
常见的设备、管道“死角”
渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角
定期除垢
管道安装不当形成的死角
发酵工厂的管路要保持光滑、通畅、密封性好。以减少和 避免管道染菌的机会。
不锈钢衬里的死角
大型发酵罐，一般都采用 不锈钢衬里的方法，即在碳钢 制造的壳体内加衬一层薄的不 锈钢板(厚约1~3毫米)。 不锈钢衬里设备加工时应该 尽可能增加衬里的刚度，减少鼓 起的可能性。操作时要注意避免 罐内发生真空现象。
发酵工艺流程各环节漏洞
发 酵 染 菌 原 因
发酵染菌率
总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之
比乘以100得到的百分率。
设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率，有利于 查找因设备缺陷而造成的染菌原因。 不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的染菌率， 有助于查找不同品种发酵染菌的原因。
第六章6_发酵过程控制6-染菌和防治课件
第六节 染菌和防治
（一）染菌对发酵的影响 3、不同时间染菌对发酵的影响 （3）发酵中期染菌 杂菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌 pH 下降；糖、氮消耗快，发 大量产酸，培养液 大量产酸，培养液pH pH下降；糖、氮消耗快，发 酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有 时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵 液发臭，产生大量泡沫。 措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变 化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放 罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输 送一部分到染菌罐，抑制杂菌。
加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对克 服染菌是极其主要的，也是重要的。
第六节 染菌和防治
设备渗漏的原因：
第六节 染菌和防治
�冷却管的渗漏
发酵罐中最容易渗漏的部件之一 。 最易穿孔的是冷却列管的弯曲处；冷却水的压力通常 大于罐压，如有微孔，冷却水会进入发酵液引起染菌。
�罐体的穿孔
特别是罐底。每年大修时需检查钢板减薄的程度。 有夹套的发酵罐检查罐壁有无渗漏。
五、染菌的防治 5、发酵染菌后的措施 �染菌后的培养基必须灭菌后才可放入下水道。 灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等 化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于 各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直 接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批 染菌。 ，对症下药，该罐也 �染菌的罐要找染菌的原因 染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也 要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。 ，空气用 �染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用 甲醛熏蒸。若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消 毒。
�蒸汽总压是否达到要求标准杂菌数量因季节而有很大差别 。 �环境中的 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别 杂菌数量因季节而有很大差别。
发酵染菌及其防治课件
发酵后期染菌 影响相对较小 。
发酵染菌及其防治课件
回
不同染菌原因对发酵的影响
种子带菌
将导致染菌范围不断扩大，使 生产蒙受重大损失。
空气带菌
使发酵大面积染菌。
培养基或设备 灭菌不彻底
一般不具延续性，使单个（批） 发酵罐发酵失败。
设备渗漏
染菌几率较大。
发酵染菌及其防治课件
回
不同染菌程度对发酵的影响
染菌程度越严重，即在发酵罐内的杂菌数量 就多，对发酵的危害也就越大。但当生产菌在发 酵过程已有大量的繁殖，并已在发酵液中占优势， 如果污染极少量的杂菌，此时对发酵不会带来太 大的影响。
设备渗漏方面原因
渗漏原因 由于发酵罐需要经受温度的升降变化，使用久了难免
会出现夹层盘管的细微腐蚀而出现渗漏，导致染菌的发生。
染菌特点 当设备渗漏时，往往每批染菌发生的时间逐渐提前。
发酵染菌及其防治课件
回
空气过滤系统方面原因
原因分析 进风口、生产环境、空气过滤器（滤芯的灭菌
要彻底，过滤介质要定期检查更换）。
发酵染菌及其防治课件
其它异常现象
还可以根据其他的一些异常现象，如菌体生长 不良、PH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常 增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的 异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的粘度 异常增加等判断染菌。
发酵染菌及其防治课件
回
染菌原因分析
分析目的 总结发酵染菌的经验教训，积极采取必
要的措施，防止生产过程中再次染菌，把发 酵染菌控制在生产前。防患于未然是发酵生 产过程中控制染菌污染的最重要措施 。
发酵染菌及其防治课件
从两表中可以看出，由 于不同厂家的生产工艺、技 术管理水平好坏不同，而使 各种染菌原因的百分率有所 不同，其中尤以设备渗漏和 空气带菌而染菌较为普遍且 严重。值得注意的是，不明 原因的染菌分别达20.0%和 35.13%。这表明，目前分 析染菌原因的水平还有待于 进一步提高。
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无菌空气的检查:将葡萄糖酚红肉汤培养基装在吸气 瓶中，灭菌后，37℃培养24h，若培养液未变浑浊 ，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，把过滤后的空 气引入吸气瓶中，培养后，若培养液变混或变黄色 ，表明空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题。
2、应用
（1）空气过滤系统。 （2）液体培养基。 （3）噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
1、溶解氧水平异常变化显示染菌。 2、pH异常变化显示染菌。 3、排气中CO2异常变化显示染菌。
谷氨酸正常发酵和异常发酵溶氧水平曲线：
三、发酵染菌的原因
（一）发酵染菌率
是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比 。
发酵染菌批数
总染菌率=——————100％
总投料批数
发酵染菌率是指在发酵罐中发生的染菌率，包括染 菌后被挽救不了导致倒罐的批数，但种子罐培养的 染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。
。 微生物的浓度过高，发酵液过浓： （1）原因：氮源过多，菌丝生长快、浓度大，从而降低发
酵液中溶解氧的浓度，影响发酵正常进行。 （2）措施：补入大量的水。
二、染菌检查（p185-186）
在发酵过种中，对杂菌污染的及早发现、 及时处理，是免除染菌造成严重损失的重 要手段。因此，要求有确切、迅速的方法 来检测出污染的杂菌。
（一）种子培养的异常现象
1、菌体生长缓慢 原因：种子质量差、培养基成分不稳定、
培养条件没有控制到位。 2、菌丝结团 原因：种子、培养条件、培养基。 3、代谢不正常 原因：培养基不合适、培养环境不良、接
种量少、污染杂菌。
（二）发酵的异常现象（p184-185菌孢子和种子质量不好、发酵条 件差、培养基质量差（灭菌不当）等。
（2）措施：补充合适的氮源，或磷酸盐，提高发 酵温度。
2、pH异常
发酵过程中一般pH是有一定规律的。如不符合规 律则是发酵异常。
（1）原因：培养基原料差、灭菌不彻底、加糖过 于集中等。
（2）措施：可通过加酸或碱调节。最好加入一些 生理酸性或碱性盐或缓冲液来调节。
长差、代谢速度慢，蛋白质胶体物质多。 培养基灭菌温度过高或时间过长，培养基
成分受到破坏。 （2）措施：接种优质种子、对培养基进行
合理灭菌。
5、菌体浓度过高或过低
由于温度、氧气、培养基、种子质量、菌体自溶等影响微生 物的生长，或感染噬菌体等，导致发酵液中微生物的浓度过 高或过低。
微生物的浓度过低，发酵液转稀： 指发酵尚未进入放罐阶段，发酵液就变稀。 （1）原因：感染噬菌体、培养条件不合适。 （2）措施：防噬菌体、控制合适培养条件。 未知的其它原因：可补充氮源促菌丝生长，或补充碳源也可
3、溶氧水平异常（p164）
正常发酵过程的溶氧水平是由一定规律的 。如果溶氧水平与一般规律不一致即发生 了异常变化。
（1）原因：染菌。染菌的种类：好氧菌 、厌氧菌。菌体代谢异常、某些设备或工 艺发生故障或变化。
（2）措施：检查无菌空气、管道是否渗 漏。搅拌设备是否正常运行等。
4、泡沫过多
发酵过程中泡沫的消长是有一定规律的。 （1）原因：种子过嫩或过老，致使菌体生
目前常用的方法：
（一）显微镜检查 （二）肉汤培养检查法 （三）平板划线培养或斜面培养检查法 （四）发酵过程的异常现象观察法
（一）显微镜检查
1、细菌用革兰氏染色，必要时进行芽孢染色 和鞭毛染色，霉菌、酵母菌可直接观察。
（二）肉汤培养检查法
1、方法
液体培养基的检查:将需要检查的样品接入经灭菌， 并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置37℃和27℃ 分别培养24h，进行观察，观察肉汤是否浑浊。并 取样镜检。
关于发酵染菌及防治
目的要求：
了解染菌对发酵工业的危害 掌握染菌的检查方法 熟悉染菌的途径 掌握染菌的防治方法 掌握噬菌体污染的防治方法
几个问题：
1、染菌 2、染菌途径 3、染菌检查的方法 4、染菌防治的方法
发酵染菌防治的意义：
现代发酵利用的是微生物的纯培养技术。 要严格无菌操作技术。
防止发酵过程中的染菌有着重要的意义： 保证产品的质量、收率的稳定。 保证发酵生产的有序进行。 有利于节约型社会的建立。
第一节 发酵异常现象及染菌分析
一、发酵的异常现象 二、染菌检查 三、染菌的原因及分析 四、染菌隐患的处理
一、发酵的异常现象
（一）种子培养的异常现象 （二）发酵的异常现象
底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量 ，先将灭菌的底层培养基溶后倒平板，凝固后 ，将上层培养基溶解并保持40℃，加生长菌作 为指示菌和待测样品混合后迅速倒在底层平板 上，置培养箱保温经12～20h观察有无噬菌斑。
（四）发酵过程的异常现象观察法 （p186）
如可从溶解氧、pH值、排气中CO2含量、 菌体酶活力等变化来判断。
杂菌不同染菌的原因不同：（p187）
杂菌
原因
耐热的芽孢杆菌 养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角
球菌、无芽孢杆菌等真菌 设备渗漏、无菌操作不当、培养
基灭菌不彻底等
2、发酵染菌规模的分析
（1）大批发酵罐染菌 A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。 B发酵中后期：如是同一种菌则是无菌空气出问题
（二）染菌原因及分析
归纳发酵中染菌的主要原因有以下几方面： 无菌空气带菌、设备渗漏、种子带菌、灭菌
不彻底、操作失误和技术管理不善等。 但还要具体问题具体分析。可从污染的杂菌
种类、污染的时间、污染的程度等方面进行 综合分析，才能作出正确的判断，从而采取 相应的对策和措施。（p186-188）
1、染菌的杂菌种类分析
（二）平板划线培养或斜面培养检查法
１、平板划线培养 固体平板置培养箱中37℃，保温24h，检查无菌
即可使用。将需要检查的样品在无菌的平板上划 线，分别置37℃、27℃培养，以适应嗜中温和 低温菌的生长，一般在8h后即可观察。
培养后，若出现与生产菌株形态不一的菌落，表 明可能被杂菌污染。
２、噬菌体检查——双层平板培养法：
。 （2）部分发酵罐 A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。 B发酵后期：中间补料染菌、补料管渗漏。 （3）个别发酵罐染菌 一般原因是设备渗漏造成的。
2、应用
（1）空气过滤系统。 （2）液体培养基。 （3）噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
1、溶解氧水平异常变化显示染菌。 2、pH异常变化显示染菌。 3、排气中CO2异常变化显示染菌。
谷氨酸正常发酵和异常发酵溶氧水平曲线：
三、发酵染菌的原因
（一）发酵染菌率
是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比 。
发酵染菌批数
总染菌率=——————100％
总投料批数
发酵染菌率是指在发酵罐中发生的染菌率，包括染 菌后被挽救不了导致倒罐的批数，但种子罐培养的 染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。
。 微生物的浓度过高，发酵液过浓： （1）原因：氮源过多，菌丝生长快、浓度大，从而降低发
酵液中溶解氧的浓度，影响发酵正常进行。 （2）措施：补入大量的水。
二、染菌检查（p185-186）
在发酵过种中，对杂菌污染的及早发现、 及时处理，是免除染菌造成严重损失的重 要手段。因此，要求有确切、迅速的方法 来检测出污染的杂菌。
（一）种子培养的异常现象
1、菌体生长缓慢 原因：种子质量差、培养基成分不稳定、
培养条件没有控制到位。 2、菌丝结团 原因：种子、培养条件、培养基。 3、代谢不正常 原因：培养基不合适、培养环境不良、接
种量少、污染杂菌。
（二）发酵的异常现象（p184-185菌孢子和种子质量不好、发酵条 件差、培养基质量差（灭菌不当）等。
（2）措施：补充合适的氮源，或磷酸盐，提高发 酵温度。
2、pH异常
发酵过程中一般pH是有一定规律的。如不符合规 律则是发酵异常。
（1）原因：培养基原料差、灭菌不彻底、加糖过 于集中等。
（2）措施：可通过加酸或碱调节。最好加入一些 生理酸性或碱性盐或缓冲液来调节。
长差、代谢速度慢，蛋白质胶体物质多。 培养基灭菌温度过高或时间过长，培养基
成分受到破坏。 （2）措施：接种优质种子、对培养基进行
合理灭菌。
5、菌体浓度过高或过低
由于温度、氧气、培养基、种子质量、菌体自溶等影响微生 物的生长，或感染噬菌体等，导致发酵液中微生物的浓度过 高或过低。
微生物的浓度过低，发酵液转稀： 指发酵尚未进入放罐阶段，发酵液就变稀。 （1）原因：感染噬菌体、培养条件不合适。 （2）措施：防噬菌体、控制合适培养条件。 未知的其它原因：可补充氮源促菌丝生长，或补充碳源也可
3、溶氧水平异常（p164）
正常发酵过程的溶氧水平是由一定规律的 。如果溶氧水平与一般规律不一致即发生 了异常变化。
（1）原因：染菌。染菌的种类：好氧菌 、厌氧菌。菌体代谢异常、某些设备或工 艺发生故障或变化。
（2）措施：检查无菌空气、管道是否渗 漏。搅拌设备是否正常运行等。
4、泡沫过多
发酵过程中泡沫的消长是有一定规律的。 （1）原因：种子过嫩或过老，致使菌体生
目前常用的方法：
（一）显微镜检查 （二）肉汤培养检查法 （三）平板划线培养或斜面培养检查法 （四）发酵过程的异常现象观察法
（一）显微镜检查
1、细菌用革兰氏染色，必要时进行芽孢染色 和鞭毛染色，霉菌、酵母菌可直接观察。
（二）肉汤培养检查法
1、方法
液体培养基的检查:将需要检查的样品接入经灭菌， 并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置37℃和27℃ 分别培养24h，进行观察，观察肉汤是否浑浊。并 取样镜检。
关于发酵染菌及防治
目的要求：
了解染菌对发酵工业的危害 掌握染菌的检查方法 熟悉染菌的途径 掌握染菌的防治方法 掌握噬菌体污染的防治方法
几个问题：
1、染菌 2、染菌途径 3、染菌检查的方法 4、染菌防治的方法
发酵染菌防治的意义：
现代发酵利用的是微生物的纯培养技术。 要严格无菌操作技术。
防止发酵过程中的染菌有着重要的意义： 保证产品的质量、收率的稳定。 保证发酵生产的有序进行。 有利于节约型社会的建立。
第一节 发酵异常现象及染菌分析
一、发酵的异常现象 二、染菌检查 三、染菌的原因及分析 四、染菌隐患的处理
一、发酵的异常现象
（一）种子培养的异常现象 （二）发酵的异常现象
底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量 ，先将灭菌的底层培养基溶后倒平板，凝固后 ，将上层培养基溶解并保持40℃，加生长菌作 为指示菌和待测样品混合后迅速倒在底层平板 上，置培养箱保温经12～20h观察有无噬菌斑。
（四）发酵过程的异常现象观察法 （p186）
如可从溶解氧、pH值、排气中CO2含量、 菌体酶活力等变化来判断。
杂菌不同染菌的原因不同：（p187）
杂菌
原因
耐热的芽孢杆菌 养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角
球菌、无芽孢杆菌等真菌 设备渗漏、无菌操作不当、培养
基灭菌不彻底等
2、发酵染菌规模的分析
（1）大批发酵罐染菌 A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。 B发酵中后期：如是同一种菌则是无菌空气出问题
（二）染菌原因及分析
归纳发酵中染菌的主要原因有以下几方面： 无菌空气带菌、设备渗漏、种子带菌、灭菌
不彻底、操作失误和技术管理不善等。 但还要具体问题具体分析。可从污染的杂菌
种类、污染的时间、污染的程度等方面进行 综合分析，才能作出正确的判断，从而采取 相应的对策和措施。（p186-188）
1、染菌的杂菌种类分析
（二）平板划线培养或斜面培养检查法
１、平板划线培养 固体平板置培养箱中37℃，保温24h，检查无菌
即可使用。将需要检查的样品在无菌的平板上划 线，分别置37℃、27℃培养，以适应嗜中温和 低温菌的生长，一般在8h后即可观察。
培养后，若出现与生产菌株形态不一的菌落，表 明可能被杂菌污染。
２、噬菌体检查——双层平板培养法：
。 （2）部分发酵罐 A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。 B发酵后期：中间补料染菌、补料管渗漏。 （3）个别发酵罐染菌 一般原因是设备渗漏造成的。