冰冻切片技术原理ppt课件

TUNEL染色（TMR Red）一、实验原理：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。

然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。

DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。

二、相关试剂：1、酶缓冲液：vial 1: Enzyme Solution2、标记液：vial 2: Label Solution3、固定液：4%多聚甲醛4、清理液：PBS（pH 7.4）5、透性处理液（Permeabilisation solution）：含0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠的缓冲液，新鲜配制三、其他设备：1、湿盒2、荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）四、染色步骤：1、标本预处理：（1）用4%多聚甲醛固定组织20分钟（15-20℃）；（2）PBS清洗30min；（3）置于透性处理液（0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠）中冰上孵育2min（2-8℃）2、TUNEL反应液：（1）从标记液（vial 2: Label Solution）中吸出100ul用于2个阴性对照（50ul/个）；（2）将50ul酶缓冲液（vial 1: Enzyme Solution）加入到剩余450ul的标记液中充分混合均匀，得到500ulTUNEL反应液（50ul/样本，检测10个样本）。

3、标记：（1）PBS清洗3min，3次；（2）吸干样品周围的液体；（3）往组织切片上滴加TUNEL反应液（覆盖整个切片），阴性对照加标记液；（4）湿盒中避光孵育60min，注意避光；（5）PBS清洗3min，3次；（6）抗荧光淬灭封片液封片，用荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）检测（激发波长520-560nm，最大540nm，绿光；检测波长570-620nm，最大580nm，红光。

现状
现代的冷冻切片技术已经实现了自 动化、数字化和标准化，为医学研 究和诊断提供了强有力的支持。
应用领域
临床病理诊断
冷冻切片技术可用于手术中的快 速病理诊断，帮助医生确定病变 的性质和范围，为手术方案提供
重要依据。
教学
冷冻切片技术可用于制作教学标 本，为医学生和病理医生提供直
观的学习材料。
科学研究
二氧化碳冷冻喷射固定设备。
03
冷冻固定设备的特点
冷冻固定设备具有操作简便、冷冻速度快、温度低等特点，能够有效地
保持组织或细胞的结构和成分不变。
切片机与刀片
切片机
切片机是用于将冷冻固定的组织或细胞样品进行切片的仪器。其工作原理是通过将组织或 细胞样品放置在切片机的工作台上，利用机械或激光等方式将样品切成薄片。
生物科学研究
利用冷冻切片技术进行细胞结构和功能的深入研 究。
药物研发
利用冷冻切片技术评估药物对细胞的作用机制。
发展前景展望
自动化与智能化
01
通过自动化与智能化技术的引入，降低冷冻切片制备的难度和
操作成本。
高分辨成像
02
发展高分辨成像技术，以获得更清晰、更深入的细胞结构和功
能信息。
跨学科，如生物工程、神经科学
将切片贴在载玻片上
将切好的切片贴在预处理的载玻片上，使其平整、无气泡。
干燥与固定
使切片在室温下干燥，并进行必要的固定处理，如用醛类化合物 进行醛化处理，以增强切片的稳定性。
染色与观察
染色
根据研究或诊断需求，选择适当 的染色方法对切片进行染色，如 H&E染色、免疫染色等。
观察
用显微镜观察染色后的切片，根 据需要调整焦距和光源强度，观 察并记录组织结构和细胞成分等 细节信息。

•micrometer (µm )= 10-6 meter
•nanometer (nm) = 10-9 meter
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组织学的研究技术
• 显微镜技术: 光镜：light microscopic, LM 电镜：electronic microscopic, EM
–透射电镜（transmission electron microscope, TEM）：观察细胞内部结构
– 勿挤压组织块
– 保持组织原有形态、保持组织清洁
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• 固定
为了阻止组织细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组 织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液， 常用的固定方法有：
– 小块组织固定法：标本：固定液为1：4～20；最常用的方法，但组织 块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延 长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。
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Embedding 包埋
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切片机
石蜡切片机
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冰冻切片机
How does a microtome work?
Microtome Arm
Tissue Block
Tissue
Section
Knife
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Microscope Slide
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切片
…on Cryostat (frozen)
Organisms
Organs
Cells (20u) Nucleus (2 u) Bacteria (0.5 u) Organelles Viruses Macromolecules A... toms

B、石蜡切片
• 其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究 中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清 晰，抗原定位准确。 • 用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有 不同：
• ①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽 量减少组织抗原的损失;或常温条件下缩短时 间。
组织学技术及免疫组化课程
山东农业大学
• ②液氮法：
• 将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直 径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋 剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛 有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开 始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液 氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
• 取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用， 或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
• 其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭 室内，故切片时不受外界温度和环境影响， 可连续切薄片至2-4μ m，完全能满足免疫组 织化学标记要求。一般以10-30μ m为佳。
• 切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜， 温度过低组织易破碎 • 抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组 织切片，切勿上下移动。
• 其方法有二：
①.干冰-丙酮（酒精）法： ②.液氮法
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①干冰-丙酮（酒精）法：
• 将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，
逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干 冰不再冒泡时，温度可达-70℃，用一小烧杯 （50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧 杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内， 至异戊烷温度达-70℃时即可使用。 • 将组织（大小为1cm×0.8cm×0.5cm）投入 异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内 以备切片， • 或置-80℃低温冰箱内贮存。