病理学常用新技术原理及应用 课件

第一节 组织与细胞化学检查
组织与细胞化学检查（Histochemistry and cytochemistry examination）是研究组织与细胞显微结构和超微结构的化 学组成及其定位的科学。主要研究对象是生物大分子（如 核酸、蛋白质、酶、多糖和脂类等）在细胞内的结构和功 能活动中的分布与变化以及亚细胞组分和细胞器在整个生 命活动中的作用等。
• 病理学技术包括传统病理学技术和现代新技术。有人 体病理学技术和实验病理学技术，二者相互渗透，互 为促进，传统的福尔马林固定、石蜡切片、HE染色是 病理学的基本技术，已广泛应用于基础和临床病理学 工作。根据科研的发展，临床病理学的需要，又不断 产生新的技术。作为当代的医学生，要适应技术的发 展进步、了解病理学研究和临床实践中的一些新技术 是必不可少的。现介绍一些新技术方法，供同学们在 以后的学习工作中参考。
图 GFAP阳性神经胶质细胞
图 体外神经胶质细胞培养免疫组化GFAPபைடு நூலகம்性
二、免疫组织化学技术的主要步骤与常用 标记物
（一）主要步骤
1．提取抗原(免疫原Immuno-gen); 2．用免疫原免疫动物(兔)制备抗血清(多克隆抗体) 或免疫动
物(鼠)后，用杂交瘤技术制备单克隆抗体； 3．纯化抗体； 4．抗体标记组织切片； 5．染色反应； 6．观察结果。
ＳＡＢＣ法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex) ２．将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称：
ＬＳＡＢ法：labelled StreptAvidin-Biotin ３．用链霉素抗生物素蛋白连结辣根过氧化物酶，则为：
2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用 的 有 异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ FITC ） 、 四 甲 基 异 硫 氰 酸 罗 达 明 （TRITC）。
3．生物素 其与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。
4．金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。
三．常用免疫组织化学染色方法
第十八章 病理学常用新技术 原理及应用
汕大医学院病理教研室 苏敏 教授
• 病理学的发展离不开病理技术的进步，纵观病理 学的发展史，从器官病理学、细胞病理学、超微 病理学、免疫病理学、分子病理学、远程病理学 及当今的计算机网络信息病理学。每一个发展阶 段都有新技术的革命。新技术使我们对疾病认识 更加深入切实。从大体、细胞、超微结构、分子 基因水平逐步深入，正如病理学前辈们所说：技 术是病理学之母。
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗Ｈ ＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结构 （PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高；
第二节 免疫组织与细胞化学检查
一、原理与方法
免 疫 组 织 与 细 胞 化 学 检 查 （ Immunohistochemistry and immunocytochemistry examination）是从组织与细胞化学方 法衍生出来的。是在单克隆抗体技术产生后，利用免疫学原 理，将抗原抗体反应应用与组织细胞化学而进一步通过级连 放大，增加敏感性。最后用辣根过氧化物酶显色。从而定位 组织细胞中抗原（蛋白 多肽、酶）等多种基因产物的特异方 法。在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的 的肿瘤进行确诊和鉴别诊断。 其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合 物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技 术。
细胞化学染色的原理是细胞中的化学成分和其相应的 底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反 应产物。常见有：
1．孚尔根反应法（Feulgen reaction）显示DNA呈现紫红色。 2．甲绿-派郎宁法（Methyl Green-Pyronin method）显示核酸（ 甲绿染DNA呈现绿色，派郎宁染RNA呈现红色） 3．苏丹Ⅲ冰冻切片染色显示中性脂肪呈现橘红色。 4．普鲁士蓝反应显示组织中含铁血黄素。 5．过碘酸雪夫反应（Periodic acid schiffreaction, PAS）显示糖 原和其它多糖物质为紫红色。
（一）直接法
• 将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第 一抗体上，以检查相应的抗原。直接法 具有特异性强的优点，但敏感性差，耗 费抗体多。
（二）间接法
先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异 性抗体， 二抗仅有种族特异性。 特点: ⑴ 预先标好二抗，较方便；
⑵ 比直接法敏感，但仍差。
（三）PAP法与双PAP法：
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
（四）ABC法：
既卵白素－生物素过氧化物酶复合物法(Avidin Biotin-peroxidase Complex,ABC) 利用卵白素与生物素特有的高度亲和力，先将生物素与酶结合形成生物素 化HRP，再以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合物； 同时先将二抗生物素化。 １．如将卵白素换成链霉亲和素，则为：
（二）常用标记物
1．酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：① 底物是特异性的，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易 扩散；③容易获得纯酶分子且较稳定；④酶标记抗体后， 不影响两者的活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同的 酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、 硷性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。
• 细胞化学方法能够对细胞内的各种成分进行定性、定 位、定量研究，包括悬浮胸腹水细胞、血液细胞以及 体外培养细胞均能产生同样良好的效果。目前，用细 胞化学技术所能显示的化学成分有蛋白质（显示某些 特定蛋白、某些氨基酸或功能基）、核糖核酸（RNA） 和脱氧核糖核酸（DNA）、糖类（如糖原、粘多糖和 糖脂等）、脂类（如中性脂肪、磷脂和固醇等）、酶 （包括水解酶如磷酸酶）、特异抗原（其化学本质可 能是多肽、蛋白、糖蛋白等）、无机盐和微量元素 （如铁、铜、锌、钻、镁等）。