冰冻切片技术原理 ppt课件

冰冻切⽚详细说明解读冰冻切⽚详细说明切⽚技术最早期是从冰冻切⽚开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切⽚弥补了⽯蜡切⽚和⽕棉胶切⽚之不⾜，⽯蜡切⽚和⽕棉胶切⽚需时太久，且在制⽚中要使⽤许多化学试剂，⽯蜡切⽚还需要加温过程，因⽽某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。

冰冻切⽚过程较简单，⽆须经过上述步骤，组织中的⽔分起着包埋剂的作⽤，组织经固定或不固定即可进⾏冰冻切⽚，切⽚厚度⼀般可在6-8微⽶，组织没有收缩，易保持⽣活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染⾊⽅法和组织化学⽅法，特别是酶的活性⼗分理想的切⽚⽅法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切⽚也很重要。

其缺点是组织过⼤不易冰冻，连续切⽚困难。

5微⽶以下切⽚不易成功。

但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微⽶的切⽚⼀、直接冰冻切⽚法冰冻切⽚多⽤于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。

组织块不经任何包埋剂⽽直接放在制冷台上冷却后再进⾏切⽚。

1．恒冷箱切⽚就是将组织在恒冷箱的切⽚机切⽚。

⽬前恒冷箱切⽚机的品种较多。

此种切⽚适⽤于科研和教学上的连续切⽚。

要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。

2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷⼑的甲醇循环装制，其冷却速度⽐较快，属于开放式，作⼀般常规冰冻切⽚⽤。

3．⼆氧化碳冰冻法将组织⽤蒸馏⽔洗后，放在冰冻切⽚机的冷冻台上，加蒸馏⽔少许。

打开冷冻台的⼆氧化碳开关，⼆氧化碳⽓体喷出，待组织出现冷霜时，将⼆氧化碳关闭，即可切⽚。

若组织冷冻过硬则切⽚易碎；组织冷冻硬度不⾜，则切⽚呈粥糜状，需⽤间歇⽅法继续冷却。

硬度⼀般在刚开始解冻时最合适，应迅速切⽚。

4．半导体致冷冰冻切⽚法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏⽔，调好切⽚机的厚度。

先接通热器的循环流⽔，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，⽤整流电源控制温度。

⼆、明胶冰冻切⽚法明胶包埋法⼀般多⽤于冰冻切⽚易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切⽚后投⼊⽔中时，常常引起分散，甚⾄发⽣丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发⽣散乱⽽失去相互间的联系，可形成移位现象。

冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。

冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。

一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。

组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。

1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。

目前恒冷箱切片机的品种较多。

此种切片适用于科研和教学上的连续切片。

要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。

2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。

3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。

打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。

若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。

硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。

4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。

⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。

⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。

⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。

切片可保存于10%甲醛液中。

⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。

冷冻切片操作指南在医学、生物学和食品科学等领域中，冷冻切片是一种重要的技术，用于将样品冷冻固化后，切割成薄片以供进一步观察和研究。

本文将为读者提供一份冷冻切片操作指南，介绍冷冻切片的基本原理、实验室操作步骤和注意事项。

一、冷冻切片的基本原理冷冻切片是将样品通过快速冷冻技术使其迅速固化，然后使用切片机或显微切片机将固化的样品切割成薄片。

冷冻切片的目的是保留样品的形态和结构，避免切片过程中的伤害和变形。

冷冻切片一般适用于需要保留细胞和组织结构的实验。

二、实验室操作步骤1. 样品准备：将待切割的样品准备好，可以是细胞、组织或食物等。

样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性。

2. 冷冻固化：将样品放置在冷冻剂中，例如液氮或冷冻盒中的冰水混合物中，进行快速冷冻固化。

冷冻时间需要根据不同样品的特性进行优化，一般在几分钟至数小时之间。

3. 选用切片仪器：根据实验需求，选择合适的切片仪器，可以是手动的切片机或半自动/全自动的显微切片机。

4. 切片调整：根据实验需求，调整切片仪器的切割参数，例如切片厚度和速度等。

通常，薄片的厚度在几微米至数十微米之间。

5. 切片过程：将冷冻固化的样品放置在切片仪器的切片台上，固定好，并且调整好切割参数。

使用手动或电动操作切片仪器，将样品切割成所需的薄片。

6. 切片收集：将切割好的薄片收集起来，可以使用切片刷或显微镊子等工具进行操作。

注意保持薄片的完整性和干燥，避免受到污染和损坏。

7. 切片处理：根据实验需求，进行切片的进一步处理，例如染色、免疫组化等。

三、注意事项1. 样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性，避免样品受到损伤和变性。

在样品处理过程中，可以使用缓冲液或甘油等物质进行保护。

2. 冷冻固化的时间和温度需要根据不同样品的特性进行优化。

过长或过短的冷冻时间都可能导致样品质量下降。

3. 在选择切片仪器时，需要根据实验需求和预算等因素进行权衡。

手动切片机相对便宜，但操作较为繁琐；半自动/全自动的显微切片机操作更为方便，但价格较高。

1.体式显微镜下，用显微剪刀沿角膜缘剪下角膜，将眼杯置于固定液内（0.2M NaH2PO410ml + 0.2M Na2HPO4 40ml + 8%多聚甲醛50ml），４℃固定过夜2.体式显微镜下，用显微剪剪除虹膜，并剪断晶体悬韧带，晶体自动游离出眼杯，尽量减少对眼杯扰动，将眼杯置于30%蔗糖（sucrose）溶液内（0.1M PB配置PH=7.4），４℃脱水过夜沉底3.将眼杯由30%蔗糖溶液取出，置于20%蔗糖溶液与OCT包埋剂（TFM™ Tissue FreezingMedium）2：1体积比例混合液中，室温浸泡摇动30min4.体式显微镜下，于平皿内用软纸采用虹吸方式吸干眼杯内外水份，尽量减少对眼杯扰动5.在模具（tissue-tek 4565）上标记样品情况，向模具内倒入20%蔗糖溶液与OCT包埋剂2：1体积比例混合液，将眼杯开口向上置于液体上，先用显微镊子按压一侧眼球（下方），使液体缓慢浸满眼杯，而后将眼杯在琼脂糖翻转，杯口朝下置底，上方眼球标记点朝向模具标记位置并置中，并使鼻侧或颞侧眼球靠近模具壁，将模具置于钢板上，移至-80℃冰箱（保证眼杯在内不动），静置10min6.将模具置于冰冻切片机恒冷箱内1h（冰冻切片参数切割头-17℃，恒冷箱-20℃），温度平衡至-20℃，样本块颜色至瓷白色，并在对应模具标记位置标记样本块（眼球上方），将样本块由模具内顶出，用刀片修整样本块7.在支撑器上涂抹OCT，待颜色稍变化，将样本块预切割侧向上（靠近模具壁侧），置于OCT内，将压制块置于标本块上8.待OCT液变色为瓷白色，将支撑器连同样本块固定于切割头上，样本块标记侧向上，将刀片保护套去除后，逐步调节样本块与刀片距离（后退钮为连续性，前进钮为间断性）9.当刀片开始切割组织块时，先将切片厚度调至30μm进行粗切，并放置下防卷板，以连续均匀的力量转动切片机的摇柄，当切割至目标区，将切片厚度调至12μm10.在促黏合载玻片上标记样本情况，先在恒冷箱预冷片刻，掀开防卷板，用刷子将冰冻切片展开平整，将载玻片黏合剂侧向下，载玻片标记侧靠近切割头，将冰冻切片敷贴于载玻片上（眼球上方统一朝向载玻片标记侧）11.载玻片室温干燥过夜，置于-20℃或-80℃冰箱内，标本块置于模具内，包装严实后置于-20℃或-80℃冰箱内注：OCT冰冻切片包埋剂（opti-mum cutting temperature compound）：一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。

冰冻切片技术1：实验原理：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻产生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需要脱水处理。

因此制片速度快，是术中进行快速病理争端的良好方法。

2：实验步骤：①取材：从新鲜的小鼠中剖取肝、肺、心、胰腺、肾等组织器官至载玻片上②冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻住头温度和箱内温度调至-20--15℃，将组织器官移到涂了一层耦合剂的组织支承器冻面上，用镊子压平，再挤上一层耦合剂覆盖标本。

放至冰冻机中降温处理③标本冷冻后将组织支承器固定在切片机的机头上，调整机头的位置使其正好位于切片刀的后方。

④以粗修的方式粗修到暴露标本的最大平面，用毛笔清除机头、组织支承器及刀片上的组织碎屑。

⑤确认切片的厚度，一般为4到5vm不等，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。

⑥放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃⑦以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷板的下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲，可用毛笔轻轻展平。

⑧打开放卷板，将标记好的载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸附到载玻片上。

⑨将切好的标本薄片迅速放入95％的乙醇固定液中进行3min的固定，再经过1min的流水冲洗，进入染色程序⑩按照：苏木素（1min）→流水冲洗（3min）→伊红染液（30s）→流水冲洗（1s）→85％乙醇→95%乙醇（10s）→无水乙醇①（30s）→无水乙醇②（1min）→二甲苯①（1min）→二甲苯②（1min）①将染色完成的标本使用树胶与盖玻片进行封片操作②将标本放到显微镜下，观察拍照记录10×、40×的镜下观3：实验结果：在镜下可观察到小鼠的肝细胞，细胞核被染成蓝色，胞质及细胞间隙被染成淡红色，同时可见大多数细胞中脂肪将细胞核挤到细胞一侧。

4：结果分析及讨论：①切片前先预调好厚度，提前准备好要使用的工具。

②切片时，观察窗不可打开过大，预防温度升高影响切片③在每一次切片之后都应该要注意清理碎屑，以防污染④严格把握染色时间，避免因染色时间太短或太长而影响实验观察5：思考题：①什么时候做冰冻切片：1：在手术:进行中，突然发现病人的病变原及诊断，判断病变是否为肿瘤2：判断肿瘤的良恶性2：了解淋巴结是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其他的治疗措施。

冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。

它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。

在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。

同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。

1. 取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

2. 速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。

液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。

具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）,如组织块小可适量加OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内, 当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾, 此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-20s 组织即迅速冰结成块。

在制成冻块后, 即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

若需要保存, 应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80 C 冰箱贮存备用。

3．固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4C冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。

取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE 上30min。

4.切片：恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10 z。

切片时，低温室内温度以-15 C〜-20C为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

切好室温放置30min后，入4C丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。

PBS洗5min X3。

进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。

可用3%H2O2孵育5~10min,消除内源性过氧化物酶的活性。