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DNA重组技术的基本工具(附模拟操作图)

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DNA重组技术的基本工具(共32张PPT)

DNA重组技术的基本工具(共32张PPT)
基础理论和技术发展催生了基因工程
E·coliDNA连接酶
3)1977年DNA合成和测序技术的发明
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
——特异性
（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
（2）在特定的位点切割DNA分子。
例如：大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序
列，并在G和A之间切开。
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
• 限制酶的识别序列：
能被限制性内切酶特 大异多性数识限别制的酶切的割识部别位序都列具由
操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要 进行人工改造后才能用于基因工程操作。
思考与探究 P7
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具 有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还 不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA 的酶。
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
Haemophilus influenzae d )中先
后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成

课件2：3.1.1 重组DNA技术的基本工具

课件2：3.1.1 重组DNA技术的基本工具

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸， 他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
黏性末端
黏性末端
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀 SmaI 限制酶的作用： 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切 口，是平整的，这样的切口叫平末端。
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——分子缝合针 （2）T4 DNA连接酶连接平末端，效率低
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
E·coli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
类型
来源
功能
相同点
差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌
G AA TT C C TT AA G
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
G AA TTC CT T A A G
G AATT C C TT AA G
缺口怎么办？
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
1. 作用： 将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶 切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
2. 种类： ⑴ E·coli DNA连接酶 ⑵ T4 DNA连接酶
• 2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种——中棉所41 ，该品种能够缓解棉铃虫抗药性。
我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！
什么是基因工程？
指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋 予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于 基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。

DNA重组技术的基本工具(1)

DNA重组技术的基本工具(1)
为你 作什能 用么推是限测什制限么酶制吗不酶 ？剪存切在细于菌原本核身生的物D中NA的？
通 的原在制过 细核长，长 胞生期以物 的 防期，易 进 止的其受 化 外进D自过来N化然程病A，分界中原细外形物子菌源成的中了侵D中不N一害含A具的套。有备入完限某这侵善制种，种的酶限但防就限生制御是制物机细酶酶 的 基 不菌利安识 转 能的用全别 移 将一限。种 制 所切到其酶 以防割所切，将御序识开限外性列别。制源工这序，酶D具N列样或在，A切，的者原当割核外尽碱通掉生源管基过，物D细上甲N以中A菌，基保侵主中使化证入要含酶限自时起身，有制将到的会切某酶甲 种割限外制源D酶N也A、不使会之使失自效，身从的而D达N到A被保护切自断身，的并 且目可的以。 防止外源DNA的入侵。
4
“基因工程”的理解
• 操作环境： 体外环境 • 操作水平： 分子水平 • 原理： 基因重组 • 本质：甲（供体：提供目的基因） 导入 乙（受体：表达
目的基因），即基因未变，只是基因表达场所的转移。
• 优点：与杂交育种相比，克服了远缘杂交不亲和的障碍。
与诱变育种相比，定向改变生物的遗传特性。
• 基因工程得以实现的理论基础：
—CCTAG
G—
（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性
末端。
—↓GATC 目—的…基…因—↓GATC — — CTAG↑—……— CTAG↑—
用酶Ⅱ切割
—
GATC—目的…基…因—
GATC—
—CTAG —……—CTAG
—
（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形
成的黏性末端能否连接？为什么？
编辑课件ppt
17
DNA连接酶的缝合作用
可把黏性末端之间的 缝隙“缝合”起来，

1.1DNA重组技术的基本工具(130327)(共38张PPT)

1.1DNA重组技术的基本工具(130327)(共38张PPT)
苏云金芽孢杆菌
提取
普通棉花(无抗虫特性) 转基因棉花含抗虫基因 转基因棉花产生伴胞晶体
抗虫基因
通过运载体导入
转基因棉花有抗虫特性
• 在以上过程中关键步骤或难点是什么？
• 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来 关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA“缝合” 关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞
“分子手术刀”——限制性核酸内切酶
限制 酶
基因操作的工具
• 末端类型：（1）黏性末端
被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
EcoRⅠ
黏性末端
黏性末端
黏性末端
EcoRⅠ
黏性末端 EcoRⅠ能识别GAATTC序列，并在G和A之 间切开
C T T AA
分子缝合针：DNA连接酶 G AA T T C C T T AA G
２、分子缝合针──DNA连接酶
DNA连接酶的作用是：将互补配对 的两个黏性末端连接起来，使之成为 一个完整的DNA分子。
连接磷酸二酯键
G C
A
A T T C
T
T A A G
类型 E· coli DNA连接酶 或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷 酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
小结：二、“分子缝合针” —— DNA连接酶
①作用: 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA， 即将脱氧核糖和磷酸连接起来. ②作用原理： 催化磷酸二酯键形成
基因操作的工具

1.1DNA重组技术的基本工具(共27张PPT)

1.1DNA重组技术的基本工具(共27张PPT)
人类需要的基因产物
优点
克服远缘杂交不亲和的障碍 定向改造生物的性状
讨论：
普通棉花
基因工程的工具
苏云金芽孢杆菌含有一种可以
合成毒蛋白的基因。
抗虫棉
让细菌的毒蛋白基因在棉花细
胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫
害的抗虫棉。
想一想：完成抗虫棉的培育，需要哪些关键工作？
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
限制酶的识别特点
以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称， 重复排列。称为回文序列

如：GAA TTC CTT AAG
CCC GGG GGG CCC
例：大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别
_G_A_A_T_T_C___序列，并切割_G__和_A__之间的_磷__酸__二_酯__键__。 切割后产生_黏__性__末__端___。
①……CGTGCA
②
…AC …TG
③
GC… CG…
④……GCTTAA 反
向
⑤ G… ACGTC…
⑥ ……CGCG
⑦
GT… CA…
⑧AATTCG……
对 称
①和⑤能连接形成 ③和⑥能连接形成
②和⑦能连接形成 ④和⑧能连接形成
三、“分子运输车”——基因进入受体细胞。
4、作用： 切割DNA 5、结果： 形成两种末端
粘性末端 平末端
• 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？
限制酶在原核生物中的作用：
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的 进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原 物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA 侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安 全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使 之失效，从而达到保护自身的目的。

基因工程之DNA重组技术的基本工具(PPT51张)

基因工程之DNA重组技术的基本工具(PPT51张)

DNA
复 制
连接DNA链
DNA连接酶 DNA聚合酶
双链
单链
连接部位
在两DNA片 将单个核苷酸加到 段之间形成 已存在的核酸片段 磷酸二酯键 的末端上，形成磷
酸二酯键
模板
不需要 需要
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
要让一个从甲生物细胞内取出来的 基因在乙生物体内进行表达，首先得将 这个基因送到乙生物的细胞内去。能将 外源基因送入细胞的工具就是运载体。
可能产生了一些特殊的酶来 防范。可而这种酶能识别外来侵 入的DNA并将其分解，而对自 身的DNA不能起作用。
“分子手术刀”——限 制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
1.主要来源： 主要从原核生物中分离纯化 2.种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制 性内切酶(限制酶)。
思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状 在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学 过的基因的什么过程有关？
转录
翻译
DNA(基因)
mRNA
蛋白质(性状)
何实现药物基因在烟草中的表达，提前要做哪些工作？
某种药物蛋白的基因
烟草的DNA
➢准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） ——限制性内切酶
➢DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） ——DNA连接酶
生物B基因片段
……GAATTC…… ……CTTAAG……
EcoRⅠ 酶切
……G AATTC…… ……CTTAA G……
……G AATTC…… ……CTTAA G……
不同来源的DNA片段混合
……GAATTC…… ……CTTAAG……
……GAATTC…… ……CTTAAG……

DNA重组技术的基本工具PPT课件


随堂达标检测
活页规范训练
基因工程的工具酶
1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
(1)来源
主要来自于 原核生物
。
(2)特点
① 识 别 双 链 DN特A 定核分苷酸子 的 某 种
序列；
磷酸二酯键
②使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的
断裂。
(3)作用结果
中心轴线两侧
①黏性末端：在所识别序列的
将
DNA的两条链分别切开时形成中的心末轴端线。
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基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
1．载体的种类有 质粒 λ噬、菌体
动植的物衍病生毒物、
等。
2．常用载体——质粒
(1)质粒是一种自裸我露复的制、结构简单双、链独环立状于DN细A 菌拟核DNA之外，
并具有
限制酶切割 能 力 的
分子外。源
(2)质粒DNA分子上有标一记至基多因个
随堂达标检测
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A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 思维导图：
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2024/10/15
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热点考向示例
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3．载体的种类 (1)细菌质粒，它是细菌拟核DNA以外的小型双链环状DNA，有 的细菌只有一个，有的细菌有多个。 (2)λ噬菌体的衍生物和某些动植物病毒的DNA。 一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人 们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。

DNA重组技术基本工具课件

(3)结果:经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式:黏性
末端和平末端。
2.DNA 连接酶——“分子缝合针”
(1)作用:将切下的双链 DNA 片段“缝合”,恢复被限制酶切开的磷酸
二酯键,拼接成新的 DNA 分子。
·DNA 连接酶:从大肠杆菌中分离得
到,只连接互补的黏性末端
(2)种类 T4 DNA 连接酶:从T4 噬菌体中分离出来,对
切割位点,便于外源 DNA 片段(基因)的插入;③具有标记基因,供重组
DNA 的鉴定和选择;④在宿主细胞内友好借居,不影响宿主细胞的生命
活动;⑤分子大小应合适,以便提取和体外操作。
问题导学
一、理解基因工程的概念
活动与探究
1.基因工程另外的名称是什么?它应用的技术有哪些?
提示:基因拼接技术或 DNA 重组技术。DNA 体外重组和转基因等
基因的运载工具——运载体
（二）DNA重组技术的基本工具
1. 限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种
切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
特点：特异性。
即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA
质粒是基因工程最常用的运载体。
绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，
有的一个细菌中有多个。
• 大肠杆菌的质粒：
最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，
其中常含有抗药基因，如四环素的
标记基因。质粒的存在与否对宿主
细胞生存没有决定性作用，但复制
只能在宿主细胞内成。
双基练习：
一、基因工程的概念
第一节
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如抗菌素的抗性基因、
产物具有颜色反应的基
因等。
用剪刀(代表EcoRⅠ)进行DNA”切割”.将白色 纸板上的目的基因,重组到红色纸板的质粒中. 用双面胶(代表DNA连接酶)将切口黏结起来,就 完成了一个重组DNA分子的模拟制作
……TCCTAGAATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAAGAG TATGAATTCCATAC…… ATACTTAAGGTATG……
……TCCTAGAATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAAGAG ……TCCTAGAATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAAGAG
TATGAATTCCATAC…… ATACTTAAGGTATG…… TATGAATTCCATAC…… ATACTTAAGGTATG……
……TCCTAGAATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAAGAG
DNA聚合酶 VS. DNA连接酶
DNA聚合酶 VS. DNA连接酶
聚合酶
作用 单个脱氧 对象 核苷酸
连接酶
DNA片段 DNA重组
用途
相同 点
DNA复制
均作用于磷酸二酯键
运载体 1、种类
都有侵染或进入宿主细胞的能力
质粒：存在于许多细 菌和酵母菌等生物中, 是细胞核或拟核外能 够自主复制的很小的 环状DNA分子。
C T T AAG
Q :限制酶所识别的序列 有什么特点?
CCC GGG GGG CCC
以中轴线双侧的DNA上碱 基呈反向对称重复排列
AAG C T T T T C GAA
中轴线
大切出来的两个黏性末端可以重合?
用DNA连接酶
Q.怎么样切才能让两个不同的ＤＮＡ可以重合?
选修3
分子水平
基因工程
细胞水平
生态工程 现代生物科技 专题 细胞工程
个体水平
生物技术的安全性 和伦理问题
胚胎工程
知识点一、基因工程概念
基因工程：又叫基因拼接技术或DNA重组技 术。就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基 因提取出来，加以修饰和改造，然后放到另一种 生物的细胞里，定向的改变生物的遗传性状。
磷酸二酯键
（4）作用于：
DNA :磷酸二酯键
限制性核酸内切酶
（专一性）
GAA T T C EcoRⅠ 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列， （在G与A之间切割） C T T A A G 并在特定的切点上切割DNA分子。
CCC GGG GGG CCC
SmaⅠ
（在G与C之间切割）
AA G C T T T T C G AA
（6）第一例转基因动物问世
1980年第一个转基因小鼠问世 1982年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠” 1983年培育出第一例转基因烟草
（7）PCR技术的发明
1988年穆里斯发明了PCR 技术,使基因工程 技术得到了进一步的发展和完善 . 获 1993 年 诺贝尔化学奖
1993 年中国农业科学院的科学成功之路地培育出 抗棉铃虫的转基因抗虫棉
运载体 Q:作为运载体必须具备哪些条件？
1.能够在宿主细胞中
复制并稳定地保存 __________________ 。
多个限制酶切点 2.具_______________ ，
以便与外源基因连接。
标记基因 3.具有某些_________ ，
标记基 因，便 于进行 检测。

筛选 。 便于进行______
TATGAATTCCATAC…… ATACTTAAGGTATG…… TATGAATTCCATAC…… ATACTTAAGGTATG…… TATGAATTCCATAC…… ATACTTAAGGTATG…… TATGAATTCCATAC…… ATACTTAAGGTATG……
……TCCTAGAATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAAGAG
…… ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…… …… TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG……
…… ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…… …… TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…… …… ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…… …… TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…… …… ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…… …… TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…… …… ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…… …… TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…… …… ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…… …… TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG……
1965年桑格发明了氨基酸序列分析技术 1977年科学家又发明了DNA序列分析方法
• 4) DNA体外重组的实现 1972年伯格(P.Berg)首先在体外进行 了 DNA 改造的研究 , 成功地构建了第 一个人工体外重组DNA分子.
（5）重组DNA表达实验的成功
1973年博耶和科恩使重组 DNA转入大肠杆菌中 ,转录出 相应的 mRNA, 并使外源基因可以在原核细胞中成功表 达,至此表明基因工程正式问世.
TATGAATTCCATAC…… ATACTTAAGGTATG……
…… ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…… …… TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…… …… ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…… …… TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG……
……ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…… ……TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG……
……TCCTAG AATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAA GAG
TATG AATTCCATAC…… ATACTTAA GGTATG……
……ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC…… ……TATCGTACGATAGGTACTTAA GCCGTATG……
……TCCTAGAATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAAGAG ……TCCTAGAATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAAGAG ……TCCTAGAATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAAGAG ……TCCTAGAATTCTC 目的基因 ……AGGATCTTAAGAG
TATGAATTCCATAC…… ATACTTAAGGTATG……
2.1953 年沃森和克里克 建立了双螺旋结构模型 , 使生物学进入分子水平 。
1957 年克里克提出中 心法则的确立
1958 年梅塞尔松和斯塔尔 , 以大肠杆菌为 实验材料 , 运用同位素示踪技术 , 用实验证 明了DNA的复制是以半保留方式进行的.
3.1963 年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验 , 破译编码氨基酸的遗传密码.
Hind Ⅲ
（在A与A之间切割）
中轴线
EcoRⅠ
黏性末端
黏性末端
• 什么叫黏性末端？
被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
SmaⅠ
平末端
平末端
限制性核酸内切酶
产生黏性未端和平末端 • 5、结果：
限制性核酸内切酶
GAA T T C
技术发明命使基因工程的实施成为可能 1)基因转移载体的发现
1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能 力,为基因转移找到一种运载工具.
2)工具酶的发现
1970年阿尔伯(W.Arber)、内森斯(D,Nathans)、史密 斯(H.C.Smith)细菌中发现了第一个限制酶
3)DNA合成和测序技术的发明
原理:基因重组 优点:定向改造生物
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
20世纪中叶，基础理论取得了重大突破
1.1944 年艾弗里 (O.Avery) 等进行了肺炎双球菌体外 转化实验,证明了DNA是生 物的遗传物质 ,并且证明了 DNA 可以从一种生物个体 转移到另一种生物个体 ,成 为基因工程的先导

1、限制性核酸内切酶（限制酶）
(1).分布： 主要在微生物中。 (2).特点：专一性和特异性，即识别特定核苷酸
序列，切割特定切点。 大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ）能识 (3).举例：别GAATTC序列，并在G和A之间切开
限制性内切酶（EcoRⅠ）作用过程
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限制性核酸内酶
用同一种限制酶切切割目的基因和运载体
2、基因的“针线” ——DNA连接酶
连接酶的作用： 将互补配对的两个黏性末端连接起来，使 之成为一个完整的DNA分子。 连接的部位： 生成磷酸二酯键 DNA连接酶的作用过程：
DNA连接酶
类型：
类型
来源 功能 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和 平末端
E· coliDNA连接酶 大肠杆菌 T4DNA连接酶 T4噬菌体