5种紫花苜蓿愈伤组织诱导研究

四、苜蓿无菌苗的培养实验四、实验实验实验五五、苜蓿愈伤组织诱导【目的要求】：1、学会种子的消毒方法；2、学习接种操作技术规范。

【实验内容】：1、种子的挑选；2、种子的消毒；3、接种技术；4、离体培养；5、学会辨别下胚轴的方法并了解组织培养外植体的选择；6、利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。

【实验用具】：超净工作台、酒精灯、平皿、三角瓶、枪形镊、标签纸、记号笔、pH试纸等。

【实验药品】：各种盐类以及有机物质按照MS培养基配方准备，0.1%氯化汞，蔗糖，琼脂。

【实验方法】：1、种子的挑选原则：挑选饱满有光泽的成熟种子2、种子的消毒：(1)清水冲洗3遍；以下在无菌工作台进行(2)75％酒精浸泡30秒，将酒精倒入废液缸；(3)0.1％的氯化汞浸泡12分钟，将废液倒入废液缸；(4)再用无菌水清洗3边，废水倒入废液缸；(5)将消毒好的种子平分到带滤纸的培养皿中。

3、接种（无菌工作台）(1)取装有MS培养基的培养瓶，用酒精棉球将瓶外擦拭消毒，同时将手及台面擦拭消毒；(2)将种子均匀整齐接入培养瓶，包好封口纸；4、培养：将接种好的培养瓶送入培养间25±2℃光照培养3－7天。

5、愈伤组织的诱导：将苜蓿幼芽从培养瓶取出放入带有滤纸的培养皿中，用手术刀截取下胚轴；再将下胚轴截成3－5mm小段，均匀整齐接入盛有MS附加激素2,4-D和6-BA的培养瓶。

6、愈伤组织的培养：将接好的培养瓶送入培养间25±2℃暗培养3周继代。

思考题：1、愈伤组织诱导污染调查:观察污染情况，填入下表：观察日期接种数污染数污染率主要污染菌种污染率（%）=（污染的外植体数/总接种外植体数）×100％2、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？3、在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具，接种材料的污染？4、对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”？5、观察接种的外植体在接种1周后产生愈伤组织的颜色和质地，计算愈伤组织诱导率。

《三种紫花苜蓿响应非生物胁迫的比较研究》篇一一、引言紫花苜蓿，作为一种重要的豆科作物，其优良的土壤改良和饲料来源的特性，在全球范围内被广泛种植。

然而，面对环境变化和极端气候事件，紫花苜蓿在生长过程中会遇到各种非生物胁迫，如干旱、盐渍化、高温等。

这些胁迫因素对紫花苜蓿的生长和产量产生严重影响。

因此，研究不同紫花苜蓿品种对非生物胁迫的响应机制，对于提高其抗逆性、改良品种和增加产量具有重大意义。

本文以三种紫花苜蓿品种为研究对象，进行了其响应非生物胁迫的比较研究。

二、材料与方法本实验选择了三种具有代表性的紫花苜蓿品种（品种A、品种B、品种C）作为研究对象。

在相同的环境条件下，分别对这三种紫花苜蓿进行干旱、盐渍化和高温三种非生物胁迫处理。

在处理过程中，定期测定并记录各品种的生长指标（如株高、叶面积等）、生理指标（如叶绿素含量、丙二醛含量等）以及基因表达情况。

三、实验结果1. 生长指标比较在干旱胁迫下，三种紫花苜蓿的生长速度均有所减缓，但品种C的减缓程度相对较小。

在盐渍化胁迫下，品种A和品种B的生长受到较大影响，而品种C的抗盐性较强。

在高温胁迫下，三种紫花苜蓿的生长均受到不同程度的抑制，但品种A的耐热性相对较好。

2. 生理指标比较在非生物胁迫下，三种紫花苜蓿的叶绿素含量均有所下降，但品种C的叶绿素降解速度相对较慢。

同时，丙二醛含量在各品种间存在差异，这可能与各品种的抗逆机制有关。

3. 基因表达分析通过实时荧光定量PCR技术，我们分析了各品种在非生物胁迫下的基因表达情况。

结果表明，各品种在应对非生物胁迫时，均有相关抗逆基因的表达上调或下调。

然而，各品种间基因表达的模式和程度存在差异，这可能是导致各品种抗逆性差异的原因之一。

四、讨论根据实验结果，我们可以看出三种紫花苜蓿在应对非生物胁迫时表现出不同的响应机制。

其中，品种C在生长指标、生理指标以及基因表达方面均表现出较强的抗逆性。

这可能与该品种具有较好的遗传特性或抗逆机制有关。

不同激素配比对紫花苜蓿不同外植体愈伤组织诱导的影响吴丽芳;丁伟【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2010(038)002【摘要】[目的]为紫花苜蓿外植体培养筛选最佳激素配比培养基.[方法]分别以盛世无菌苗的下胚轴、子叶、叶片、叶柄、根为外植体,在MS附加不同激素配比的培养基上诱导愈伤组织,研究不同处理对愈伤组织诱导率的影响.[结果]5种外植体均能诱导出愈伤组织,其中下胚轴的愈伤组织诱导率最高(达87.5%),且愈伤组织长势良好,其次为子叶>叶柄>叶片>根;不同外植体愈伤组织的形成时间为下胚轴>子叶>叶柄和根>叶片;2,4-D诱导愈伤组织的效果优于NAA.[结论]2,4-D、NAA、6-BA 和KT配合使用的培养基上形成的愈伤组织浅黄带绿,表面突起,松软,带簇状芽或单芽或形成胚状体.【总页数】3页(P620-621,628)【作者】吴丽芳;丁伟【作者单位】曲靖师范学院云贵高原生物多样性研究所,云南曲靖,655011;曲靖师范学院云贵高原生物多样性研究所,云南曲靖,655011【正文语种】中文【中图分类】S542~+.9【相关文献】1.不同外植体和激素配比对五指毛桃愈伤组织诱导的影响 [J], 阎珂;肖君泽2.不同外植体和激素配比对五指毛桃愈伤组织诱导的影响 [J], 阎珂;肖君泽;3.不同激素配比对紫花苜蓿幼苗4种外植体愈伤组织诱导效果的影响 [J], 王立爽; 孟令媛; 王沛銮; 周婷; 唐碧瑶; 邬婷婷; 李波4.不同外植体与激素对北美海棠松散型愈伤组织诱导的影响 [J], 张伟龙;张超;杨静慧;刘艳军;李瑞祥;刘杉;王芝学5.不同外植体和激素对喜树愈伤组织诱导的影响 [J], 叶水英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

紫花苜蓿愈伤组织诱导及植株再生的研究
王友生;李阳春;梁慧敏;刘自学;孙榕江
【期刊名称】《草原与草坪》
【年(卷),期】2006(0)4
【摘要】以中牧1号紫花苜蓿的胚轴、叶片、子叶和根为外植体,研究了不同浓度细胞分裂素对胚性愈伤组织诱导的影响,以及不同分化培养基、蔗糖浓度对胚状体分化的影响.结果表明:不同外植体间的愈伤组织诱导率差异较大,以胚轴的愈伤诱导效果最好,愈伤组织诱导率高达92.2%;改良SH+2,4-D2.0 mg/L+BA 0.5 mg/L为最佳胚性愈伤组织诱导培养基;MSO1培养基适于胚状体的分化,蔗糖浓度为25～30 g/L时胚状体诱导率最大可达30.4%;MSO培养基是最佳的成苗培养基.
【总页数】4页(P55-58)
【作者】王友生;李阳春;梁慧敏;刘自学;孙榕江
【作者单位】甘肃农业大学,草业学院,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学,草业学院,甘肃,兰州,730070;北京克劳沃集团,北京,100029;北京克劳沃集团,北京,100029;甘肃农业大学,草业学院,甘肃,兰州,730070
【正文语种】中文
【中图分类】Q813.1;S54
【相关文献】
1.不同激素及培养基对紫花苜蓿下胚轴愈伤组织诱导及植株再生的影响 [J], 李莺;马兰;韩艳玲;罗雯;潘朝锋
2.大叶紫花苜蓿愈伤组织原生质体再生植株 [J], 刘明志
3.紫花苜蓿下胚轴愈伤组织诱导及再生植株的研究 [J], 王姝杰;闫淑珍;李世访
4.核桃叶片愈伤组织的诱导及植株再生研究 [J], 戴小云;武春霞
5.紫花苜蓿胚轴愈伤组织培养与植株再生 [J], 舒文华;耿华珠;闫伦兴;许玉庆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第31卷第4期V o l.31N o.4草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2023年4月A p r.2023d o i:10.11733/j.i s s n.1007-0435.2023.04.014引用格式:谭璐娜,彭嘉文,许环宇,等.紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究[J].草地学报,2023,31(4):1057-1063 T A NL u-n a,P E N GJ i a-w e n,X U H u a n-y u,e t a l.I n d u c t i o na n dP r o l i f e r a t i o no fE m b r y o g e n i cC a l l u so fA l f a l f a[J].A c t aA g r e s t i aS i n i c a,2023,31(4):1057-1063紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究谭璐娜#,彭嘉文#,许环宇,张瀚文,夏厚胤,苗愉祺,崔祎琳,苑旺,马志超,同雨涛,高景慧*(西北农林科技大学草业与草原学院,陕西杨陵712100)摘要:为在不同栽培苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a)品种上,建立稳定㊁快速且高效的组织培养体系,本试验以品种 游客 ㊁ P a o l a 和 S a r d i7 为研究材料,探究了苜蓿外植体㊁激素配比及金属离子(C u2+㊁A g+),对其胚性愈伤组织的诱导效果㊂结果表明:下胚轴为诱导愈伤组织的最佳外植体;M S+1m g㊃L-12,4-D+0.2m g㊃L-1K T为培养基时 游客 和 P a o l a 胚性愈伤诱导率分别为24.7%,16.7%;M S+2m g㊃L-12,4-D+0.2m g㊃L-1K T为培养基时S a r d i7 胚性愈伤诱导效果最佳为27.3%;1μm o l㊃L-1和5μm o l㊃L-1C u2+均能显著促进 S a r d i7 游客 和 P a-o l a 愈伤组织的诱导;5μm o l㊃L-1A g+显著诱导 游客 和 P a o l a 形成胚性愈伤组织,诱导率分别提高25.3%,46.7%(P<0.05)㊂本研究探索了诱导苜蓿愈伤组织的最佳外植体及其培养条件㊁金属离子促进不同苜蓿品种再生的作用,为突破同源四倍体栽培苜蓿品种基因型上的限制㊁提高胚性愈伤组织出愈率提供了思路㊂关键词:紫花苜蓿;下胚轴;金属离子;胚性愈伤;显微观察中图分类号:Q945.79文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2023)04-1057-07I n d u c t i o na n dP r o l i f e r a t i o no fE m b r y o g e n i cC a l l u s o fA l f a l f aT A N L u-n a#,P E N GJ i a-w e n#,X U H u a n-y u,Z H A N G H a n-w e n,X I A H o u-y i n,M I A O Y u-q i,C U IY i-l i n,Y U A N W a n g,MAZ h i-c h a o,T O N G Y u-t a o,G A OJ i n g-h u i*(C o l l e g e o fG r a s s a n dG r a s s l a n d,N o r t h w e s tA&FU n i v e r s i t y,Y a n g l i n g,S h a a n x i P r o v i n c e712100,C h i n a)A b s t r a c t:I no r d e r t o e s t a b l i s h a s t a b l e,r a p i d a n d e f f i c i e n t t i s s u e c u l t u r e s y s t e mo n d i f f e r e n t c u l t i v a t e d a l f a l-f a(M e d i c a g o s a t i v a)v a r i e t i e s,t h i s e x p e r i m e n t t o o k t h e v a r i e t i e s T o u r i s t P a o l a a n d S a r d i7 a s t h e r e-s e a r c hm a t e r i a l s,i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t s o f a l f a l f a e x p l a n t s,h o r m o n e s r a t i o a n dm e t a l i o n s(C u2+,A g+)o n i n d u c t i o no f e m b r y o n i c c a l l u s.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t h y p o c o t y lw a s t h eb e s t e x p l a n t s t o i n d u c e c a l l u s. W h e n M S+1m g㊃L-12,4-D+0.2m g㊃L-1K T w e r ec u l t u r e d,e m b r y o g e n i cc a l l u s i n d u c t i o nr a t e so f T o u r i s t a n d P a o l a w e r e24.7%a n d16.7%r e s p e c t i v e l y.A n d t h e e m b r y o g e n i c c a l l u s i n d u c t i o ne f f e c t o f S a r d i7 w a s27.3%w h e nM S+2m g㊃L-12,4-D+0.2m g㊃L-1K Tw e r e c u l t u r e d.1μm o l㊃L-1a n d 5μm o l㊃L-1C u2+c o u l d p r o m o t e c a l l u s i n d u c t i o no f S a r d i7 , T o u r i s t a n d P a o l a s i g n i f i c a n t l y.5μm o l ㊃L-1A g+s i g n i f i c a n t l y i n d u c e d e m b r y o g e n i c c a l l u s o f T o u r i s t a n d P a o l a ,a n d t h e i n d u c t i o nr a t e s i n-c r e a s e db y25.3%a n d46.7%,r e s p e c t i v e l y(P<0.05).I n t h i s s t ud y,we e x p l o r e d t h e b e s t e x p l a n t s t o i n-d u ce a lf a l f a c a l l u s a n d t h e i r c u l t u r e c o n d i t i o n s,a sw e l l a s t h e r o l e o fm e t a l i o n s i n p r o m o t i ng r e g e n e r a t i o n o f d i f f e r e n t a l f a l f a v a r i e t i e s,whi c h p r o v i d e d a s o l u t i o n f o r b r e a k i n g t h r o u g h t h e g e n o t y p i c r e s t r i c t i o no f a u t o-t e t r a p l o i d c u l t i v a t e d a l f a l f av a r i e t i e s a n d i m p r o v i n g t h eh e a l i n g r a t e o f e m b r y o n i c c a l l u s.K e y w o r d s:A l f a l f a(M e d i c a g o s a t i v a);H y p o c o t y l;M e t a l i o n s;E m b r y o g e n i c c a l l u s;M i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n收稿日期:2022-09-26;修回日期:2022-12-02基金项目:陕西省重点研发一般项目(2019N Y-074)资助作者简介:#谭璐娜(2000-),女,汉族,重庆万州人,硕士研究生,主要从事遗传资源与牧草育种研究,E-m a i l:t l n0905@163.c o m;#彭嘉文(2000-),女,汉族,河南南阳人,硕士研究生,主要从事遗传资源与牧草育种研究,E-m a i l:p e n g j i a w e n2021@n w s u a f.e d u.c n;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:g a o j i n g h u i@n w s u a f.e d u.c n优质饲料草种紫花苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a)的遗传转化工作中,因组织培养过程中植株再生率低㊁Copyright©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷转化效率不稳定,严重制约了转基因及相关遗传改良工作的进展[1]㊂C h e n等[2]已完成了同源四倍体紫花苜蓿 新疆大叶 的测序工作,为苜蓿的遗传改良奠定了良好的基础㊂因此,获取可用于不同栽培苜蓿品种的稳定㊁快速且高效的组织培养体系用于遗传转化研究,已成为当前紫花苜蓿分子育种的重中之重㊂诱导和增殖高质量愈伤组织对高效紫花苜蓿组织培养体系的建立至关重要;其中胚性愈伤组织生长较快,可通过体细胞胚胎发生形成植株[3];而非胚性愈伤组织则生长缓慢,再生能力比较弱㊂近年来,许多学者通过探究紫花苜蓿的外植体种类和激素浓度配比,提高胚性愈伤组织诱导率并建立高效组织培养体系;如M S培养基中,2,4-D与6-B A不同配伍,可诱导苜蓿种子[4]㊁胚轴上㊁下段和子叶[5]形成愈伤组织㊂C u2+参与植物生长发育过程中的多种代谢反应,是多种氧化酶的组成成分㊁参与植物体内的氧化还原过程和光合作用[6],在植物组织培养中起重要作用[7];A g+对许多单子叶和双子叶植物形态发生具有促进作用,作为一种乙烯抑制剂能减轻植物自身产生乙烯对分化的抑制作用,促进外植体形态发生[8-10]㊂在小麦组培中添加10μm o l㊃L-1 C u2+时,愈伤诱导率和胚性愈伤诱导率均显著提高[11];A g+对甘蔗试管苗繁殖存一定的影响和应用[12]㊂本试验以紫花苜蓿 游客 的子叶㊁根尖和下胚轴为外植体诱导愈伤组织,探索诱导苜蓿愈伤组织的最佳外植体及其培养条件;并利用C u2+和A g+刺激苜蓿胚性愈伤组织形成㊁提高愈伤组织出愈率的可能,探索金属离子促进不同苜蓿品种再生的作用;以期突破紫花苜蓿再生体系效率较低的难题,达到不同品种紫花苜蓿均可通过愈伤组织培养再生植株的目的㊂1材料和方法1.1材料试验材料为紫花苜蓿品种 S a r d i7 游客 和 P a o l a ,购置于百绿(天津)国际草业有限公司㊂1.2方法1.2.1无菌苗培养取紫花苜蓿 游客 种子100 ~150粒,在超净工作台内30%N a C l O浸泡消毒20m i n;无菌水洗涤3次并用无菌滤纸吸干种子表面残留水分,接种至1/2M S培养基(添加琼脂12g㊃L-1㊁蔗糖10g㊃L-1,p H5.7)㊂置于光照培养箱中培养,培养条件为:25ʃ2ħ,光照18h/黑暗6h,光照强度2000l x㊂本试验中后续组织培养的温度和光照条件均如上所述㊂1.2.2紫花苜蓿不同外植体愈伤组织的获得取培养3~4d 游客 无菌苗,将子叶切割成5m m正方形小块,下胚轴和根尖切割成5m m长小段,接种到下列4种不同激素组合,含有蔗糖30g㊃L-1和琼脂10g㊃L-1,p H5.8的M S培养基中,见表1㊂在方形培养皿中分别接种子叶㊁下胚轴及根3种不同外植体50个,每种激素组合处理重复3次㊂接种14d后观察愈伤组织形态,统计愈伤组织的数量并分析结果㊂表1诱导紫花苜蓿不同外植体形成愈伤组织的激素组合T a b l e1I n d u c i n g d i f f e r e n t e x p l a n t s o f a l f a l f a t of o r mah o r m o n a l c o m b i n a t i o no f c a l l u s激素组合H o r m o n e c o m b i n a t i o n s激素浓度H o r m o n e s c o n c e n t r a t i o nY12,4-D1m g㊃L-1+K T0.2m g㊃L-1Y22,4-D2m g㊃L-1+K T0.4m g㊃L-1Y32,4-D2m g㊃L-1+K T0.2m g㊃L-1Y42,4-D1m g㊃L-1+K T0.4m g㊃L-1 1.2.3不同品种的紫花苜蓿胚性愈伤组织的获得将紫花苜蓿品种 S a r d i7 ㊁ 游客 和 P a o l a 3个品种的下胚轴分别按照上述诱导培养基激素组合培养基进行外植体制备,14d后获得的愈伤组织转置于相同激素浓度配比诱导培养基上进行胚性愈伤诱导培养,每14d继代1次,共继代2次㊂继代培养完成后根据愈伤组织的形态划分为三类[13-14]:Ⅰ型为淡黄色愈伤组织,结构松散透明㊁质地较软,镊子触碰容易破碎,无紧密结构;Ⅱ型为绿色愈伤组织,表面呈现绿色颗粒状,质地紧密坚硬,镊子触碰不会破碎,属于胚性愈伤组织;Ⅲ型为褐色愈伤组织,质地紧密,整体呈现干枯状,镊子触碰不易破碎㊂1.2.4金属离子浓度设置根据上述愈伤组织的形态筛选出适宜诱导胚性愈伤组织的最佳激素组合,并在其中分别添加不同浓度梯度的C u2+㊁A g+ (表2)㊂将紫花苜蓿品种 S a r d i7 游客 和 P a o l a 3个品种的下胚轴在最佳激素组合培养基诱导14d 后获得的愈伤组织,转置于上述添加了金属离子的培养基上继代培养㊂继代培养完成后,统计胚性愈伤组织数量和愈伤组织数量㊂愈伤组织诱导率=产生愈伤组织数/接种外植体总数ˑ100%;胚性愈伤诱导率=产生Ⅱ型愈伤组织数/接种外植体总数ˑ100%㊂8501Copyright©博看网. All Rights Reserved.第4期谭璐娜等:紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究表2 C u 2+,A g +浓度梯度设置T a b l e 2 C o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s e t t i n g s o fC u 2+,A g+金属离子M e t a l i o n浓度梯度C o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t /μm o l ㊃L -1C u 2+(C u S O 4)0,1,5A g +(A g N O 3)0,5,101.2.5 显微观察-H E 染色法 将紫花苜蓿游客 继代两次后的3种不同类型愈伤组织浸入70%F A A 固定液(甲醛ʒ乙酸ʒ70%乙醇=5ʒ5ʒ90)中固定24h ,以不同浓度梯度乙醇(70%,85%,95%,100%)将固定样品脱水后浸蜡并包埋在石蜡中,切片机切成厚度5μm 的蜡带后制片,过苏木精-伊红(H e m a t o x y l i n -E o s i n S t a i n i n g)染色并拍照观察㊂1.3 数据分析用E x c e l2016记录整理试验数据,G r a p h P a d P r i s m8作图㊂方差分析采用S P S S23进行,单因素A N O V A 分析愈伤组织诱导率和胚性愈伤诱导率,显著性比较用D u n c a n s 法,多重比较采用新复极差法㊂2 结果与分析2.1 紫花苜蓿诱导愈伤组织的外植体及激素浓度配比紫花苜蓿 游客 不同取材部位获得的外植体在不同激素浓度配比下的愈伤诱导率有显著差异(图1A )㊂4种不同激素浓度组合下,以下胚轴为外植体时的愈伤诱导率均最高,激素浓度配比为Y 1和Y 4时差异最为显著;Y 1激素浓度配比下,下胚轴愈伤诱导率为66.0%,较子叶和根尖高出29.0%,45.7%(P <0.05);Y 4激素浓度配比下,下胚轴愈伤诱导率为75.8%,较子叶和根尖高出38.8%,33.9%(P <0.05)㊂Y 1激素浓度配比下胚轴诱导形成的愈伤组织呈现出绿色㊁表面颗粒状㊁质地紧密坚硬的形态(图1B ,a)㊂在4种不同激素浓度组合下子叶和根尖均不能形成形态较好的愈伤组织:子叶为外植体形成的愈伤组织有水渍褐化现象,较难形成胚性愈伤组织(图1B ,b );根尖呈现水渍㊁透亮不紧密形态,愈伤组织较难保持良好(图1B ,c )㊂以下胚轴为外植体时在激素浓度配比为Y 1㊁Y 3和Y 4时愈伤诱导率显著高于Y 2,分别高出66.2%,75.1%,75.8%(P <0.05)㊂因此紫花苜蓿下胚轴为愈伤诱导的最佳外植体,适宜诱导的培养基激素浓度组合为Y 1,Y 3和Y 4㊂图1 紫花苜蓿 游客 不同外植体的愈伤诱导率及形成的愈伤组织形态F i g .1 C a l l u s i n d u c t i o n r a t e a n d c a l l u sm o r p h o l o g yo f d i f f e r e n t e x pl a n t s o f T o u r i s t 注:1,A ,紫花苜蓿 游客 不同外植体在不同激素浓度配比下的愈伤诱导率;B ,不同外植体的愈伤组织形态;(a)下胚轴形成的愈伤组织(Y 1激素浓度配比);(b )子叶形成的愈伤组织,(c )根尖形成的愈伤组织,2,*柱上不同小写字母表示差异显著(P <0.05)㊂下同N o t e :P a n e l s h o w e d t h e c a l l u s i n d u c t i o nr a t eo f d i f f e r e n t e x p l a n t so f T o u r i s t u n d e r d i f f e r e n t h o r m o n e c o n c e n t r a t i o n r a t i o s .P a n e l Bd i s -p l a y e d t h e c a l l u sm o r p h o l o g y o f d i f f e r e n t e x p l a n t s ;(a )c a l l u s f o r m e d b y h y p o c o t ylu n d e r Y 1h o r m o n ec o n c e n t r a t i o n r a t i o ;(b )c a l l u s f o r m e d f r o mc o t y l e d o n s ;(c )c a l l u s f o r m e db y t h e r o o t t i p .T h ed i f -f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s o n t h e c o l u m n i n d i c a t e t h e s i g n i f i c a n t d i f f e r -e n c e a t t h e 0.05l e v e l .T h e s a m e a s b e l o w2.2 不同激素浓度配比对不同品种紫花苜蓿胚性愈伤组织的诱导将紫花苜蓿品种 S a r d i 7 游客 和 P a o l a 3个品种下胚轴诱导形成的愈伤组织两次继代培养后,不同品种紫花苜蓿诱导胚性愈伤组织的最适激素浓度配比不同(图2)㊂ S a r d i 7 诱导胚性愈伤组织最适激素浓度配比为Y 3,该配方下的胚性愈伤诱导率为27.3%;显著高于Y 1,Y 4,较Y 1,Y 4分别高出6.0%,16.7%(P <0.05)㊂在 P a o l a 中,Y 1和Y 3激素浓度配比下胚性愈伤诱导率都较高,胚性愈伤诱导率为16.7%,12.7%㊂ 游客 诱导胚性愈伤组织最适激素浓度为Y 1,胚性愈伤诱导率达24.7%,显著高于Y 3,Y 4下的胚性愈伤诱导率,分别高出了16.0%,18.3%(P <0.05)㊂2.3 金属离子对紫花苜蓿愈伤诱导的作用在培养基中添加C u 2+后,3个供试品种的愈伤诱导率均显著增加(表3)㊂ P a o l a的愈伤诱导率9501Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草 地 学 报第31卷在1μm o l ㊃L -1C u 2+浓度下最高,达86.7%,比对照组高20.0%(P <0.05); 游客 和 S a r d i 7 的愈伤诱导率在5μm o l ㊃L -1C u2+浓度下最高,分别高达92.0%,92.7%,较对照组高出14.0%,12.0%(P <0.05)㊂添加A g +可以显著提高P a o l a 的愈伤诱导率,对 S a r d i 7㊁ 游客 的愈伤诱导无显著影响(表3)㊂5μm o l ㊃L -1和10μm o l ㊃L -1A g +浓度下 P a o l a的愈伤诱导率较对照显著提高,分别为94.7%,84.0%,较对照组分别高出28.0%,17.3%(P <0.05)㊂ 添加C u 2+后 P a o l a 游客 的胚性愈伤组织诱导率显著提高,最高可达29.3%,21.3%,分别比对照组高16.6%,12.6%(P <0.05);供试品种 S a r d i 7 在1μm o l ㊃L -1和5μm o l ㊃L -1C u 2+浓度下的胚性愈伤诱导率与对照组的胚性愈伤诱导率均无显著差异(P >0.05)㊂A g +浓度可显著提高P a -o l a ㊁ 游客 的胚性愈伤诱导率,对 S a r d i 7的胚性愈伤组织诱导无显著促进作用; P a o l a 游客 的胚性愈伤诱导率在5μm o l ㊃L -1A g +浓度下最高,高达59.3%,34.00%,较对照组提高了46.7%,25.3%(P <0.05)㊂图2 3种紫花苜蓿品种在不同激素浓度配比下胚性愈伤诱导率F i g .2 E m b r y o g e n i c c a l l u s i n d u c t i o n r a t e o f t h r e e a l f a l f a v a r i e t i e su n d e r d i f f e r e n t h o r m o n e r a t i o s表3 不同金属离子浓度对紫花苜蓿愈伤组织诱导及分化的影响T a b l e 3 E f f e c t s o fm e t a l i o n c o n c e n t r a t i o no n c a l l u s i n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no f a l f a l f a金属离子浓度M e t a l i o nc o n c e n t r a t i o n /μm o l ㊃L -1P a o l a游客S a r d i 7愈伤诱导率C a l l u s i n d u c t i o n r a t e/%胚性愈伤诱导率E m b r y o n i c c a l l u s i n d u c t i o n r a t e/%愈伤诱导率C a l l u s i n d u c t i o n r a t e/%胚性愈伤诱导率E m b r y o n i c c a l l u s i n d u c t i o n r a t e /%愈伤诱导率C a l l u s i n d u c t i o n r a t e/%胚性愈伤诱导率E m b r yo n i c c a l l u s i n d u c t i o n r a t e /%C u2+066.67ʃ2.31b12.67ʃ1.16b78.00ʃ2.00b8.67ʃ3.06b80.67ʃ2.31b27.33ʃ3.06a186.67ʃ11.02a 29.33ʃ2.52a 87.33ʃ4.16a 18.00ʃ8.00a b 90.67ʃ4.16a 27.33ʃ3.06a 578.67ʃ8.08a b 26.67ʃ3.06a 92.00ʃ6.00a 21.30ʃ5.77a 92.67ʃ5.03a 33.33ʃ6.43a A g+066.67ʃ2.31b 12.67ʃ1.15c 78.00ʃ2.00a 8.67ʃ3.06b 80.67ʃ2.31a 27.33ʃ3.06a 194.67ʃ3.01a 59.33ʃ9.45a 78.00ʃ7.21a 34.00ʃ4.00a 81.67ʃ10.02a 38.33ʃ21.22a 584.00ʃ10.00a35.33ʃ4.16b 79.33ʃ20.00a 26.00ʃ6.00a 84.67ʃ8.33a 43.33ʃ12.22a 注:同列不同字母表示不同金属离子浓度处理间差异显著(P <0.05),数值为平均值ʃ标准偏差;下同N o t e :D i f f e r e n t l e t t e r s i nt h es a m ec o l u m n i n d i c a t es i gn i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nd i f f e r e n tm e t a l c a t i o n sc o n c e n t r a t i o nt r e a t m e n t s (P <0.05),a n d t h e v a l u e i sm e a n ʃs t a n d a r dd e v i a t i o n ;s i m i l a r l y f o r t h e f o l l o w i n g ta b l e s 2.4 紫花苜蓿愈伤组织的形态结构2.4.1 愈伤组织形态 对紫花苜蓿 游客 的下胚轴在两次继代培养后进行形态学观察,松散透明的Ⅰ型愈伤组织分散性较好,随着培养时间的增加不容易发生褐化,但无法形成胚性组织,不能继续分化过程;Ⅱ型致密绿色愈伤组织质地较硬,再生性高,增殖较快;Ⅲ型褐化愈伤组织随着培养时间增长,逐渐丧失胚性而死亡㊂在Y 3配方中加入金属离子后,Ⅰ㊁Ⅱ㊁Ⅲ型紫花苜蓿愈伤组织更加紧密㊁表面颗粒状增多(图3B ,3D ,3F )㊂2.4.2 组织学特征 在显微组织细胞学上,紫花苜蓿 游客 胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织有明显的差异(图4)㊂Ⅰ型松散透明淡黄色愈伤组织的细胞排列松散,无明显的组织结构,且细胞染色浅,较少的细胞含有细胞核(图4A ,B );Ⅱ型致密的绿色愈伤组织细胞排列紧密,有明显的组织样结构和分生中心,分化出球形胚和子叶型胚结构(图4C ),且细胞染色深,细胞核大(图4D );Ⅲ型褐色愈伤组织细胞排列杂乱,没有明显的组织结构,虽然细胞染色较深,部分细胞有细核,但细胞结构不完整(图4E ,4F)㊂0601Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第4期谭璐娜等:紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究图3 紫花苜蓿愈伤组织的外观形态F i g .3 A p p e a r a n c e a n dm o r p h o l o g y of c a l l u s o f a l f a l f a 注:A ,C ,E 分别为继代2次后紫花苜蓿愈伤组织:A 为I 型愈伤组织;C 为Ⅱ型愈伤组织;E 为Ⅲ型愈伤组织;B ㊁D ㊁F 分别为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型紫花苜蓿愈伤组织添加金属离子后形态N o t e :P a n e l A ,Ca n dEa r e t h e c a l l u s o f a l f a l f a a f t e r t w o s u b ge n -e r a t i o n s r e s p e c t i v e l y :Ai s t y p e I c a l l u s ;Ci s t y pe Ⅱc a l l u s ;Ei s t y p eⅢc a l l u s ;B ,Da n dFs h o w e d t h em o r p h o l o g y of t y p eⅠ,Ⅱa n d Ⅲa l f a l f a c a l l us图4 H E 显微观察紫花苜蓿愈伤组织F i g .4 H E m i c r o s c o pi c o b s e r v a t i o no f c a l l u s o fA l f a l f a 注:1.A ,B 为I 型愈伤组织,C ,D 为Ⅱ型愈伤组织,E ,F 为Ⅲ型愈伤组织;2.比例尺为A 为500μm ,B 为100μm ,C ㊁E 为200μm ,D ㊁F 为50μm ㊂箭头指向细胞形成的组织形态N o t e :P a n e lA ,B i s t y p e I c a l l u s ,C ,Di s t y pe Ⅱc a l l u s ,E .Fi s t y p eⅢc a l l u s ;T h e s c a l eo fAi s 500μm ,B i s 100μm ,Ca n dE a r e 200μm ,Da n dFa r e 50μm.T h e a r r o w p o i n t s t o t h e t i s s u em o r p h o l o g y f o r m e db y ce l l s 3 讨论3.1 外植体类型及激素浓度影响紫花苜蓿胚性愈伤的形成紫花苜蓿不同植株部位内源激素水平的差异,同一品种上的不同外植体,诱导产生愈伤组织的效果存在显著差异[15,16],适宜外植体有助于高质量愈伤组织的形成,保证其继代培养中不定芽的形成,有利于发育成完整植株,提高组培效率[17]㊂本研究中采用紫花苜蓿 游客 品种子叶㊁下胚轴和根尖3种不同外植体,在愈伤组织诱导上存在着显著差异,其中以下胚轴作为外植体形成愈伤组织数量和质量效果最佳,研究结果与赵晓倩等[18-19]的研究结果一致㊂马伶俐等[20]在M S 基本培养基上以下胚轴为外植体,添加2m g ㊃L -12,4-D+1m g ㊃L -16-B A 激素,诱导紫花苜蓿 甘农4号 愈伤组织并分化成苗;紫花苜蓿 青大1号 以种子为外植体,在添加了40μm o l ㊃L -12,4-D 和15μm o l ㊃L -16-B A 的M S培养基上诱导出胚性愈伤组织[21]㊂基因型决定植物体细胞胚胎发生及其发育,相同物种不同基因型的体细胞胚发生能力存在差异[22],对植物激素种类和浓度敏感性响应亦不同[23]㊂本试验中采用下胚轴为外植体,品种 P a o l a和 游客 在激素浓度配比为2,4-D1m g ㊃L -1+K T0.2m g ㊃L -1时胚性愈伤诱导效果最佳,而品种 S a r d i 7诱导胚性愈伤组织的最佳激素浓度则为2,4-D2m g ㊃L -1+KT 0.2m g ㊃L -1㊂以紫花苜蓿叶片为外植体,2m g ㊃L -12,4-D 和0.5m g /K T 最适于胚性愈伤的诱导,但也仅适用于基因型为公农系列苜蓿品种;因不同基因型次生胚发生频率不同,不同品种紫花苜蓿胚性愈伤组织最适激素浓度配伍存在差异[24],因此,选择合适的外植体类型和激素配伍,可以有效提高胚性愈伤诱导率㊂不同品种紫花苜蓿诱导胚性愈伤组织,需要在外植体和激素配伍间多次试验探索,以期获得较好的再生植株㊂3.2 金属离子促进紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导金属离子会对植物愈伤诱导产生显著影响[25],C u2+因其氧化还原特性能够参与生物体内的多种催化反应,对生物的正常生长和发育至关重要[26];A g +作为植物生长非必需元素,对器官和体细胞胚胎发生具有显著促进作用[12]㊂山禾等[27]发现在培养基中添加15.0μm o l ㊃L -1的C u2+,寒地粳稻 空育131 和 东农425的愈伤组织诱导率分别提高了8.0%和22.0%(P <0.01),绿苗分化率分别提高了26.4%和27.0%(P <0.05);在小麦 甘春 中添加0.5μm o l ㊃L -1的C u S O 4有类似效应[28]㊂本试验研究0~5μm o l ㊃L -1C u 2+和0~10μm o l㊃L -1A g +对紫花苜蓿愈伤诱导的效应,1μm o l ㊃L -1和5μm o l ㊃L -1C u 2+均能显著提高3种紫花苜蓿愈伤组织诱导率㊂棉花组培中添加5μm o l ㊃L -1A g +可缩短最早出愈天数,提高愈伤诱导率和植株再生率[25];当添加10μm o l ㊃L -1A g +时,小麦 泰山21 的胚性愈伤组织诱导率最高可达到74.0%[29]㊂本实验中C u 2+和A g +均不同程度促进紫花苜蓿愈伤的诱导,这与后猛等[29]在小麦上的研究结果一致;其中5μm o l ㊃L -1A g +显著提高P a o l a 和 游客 胚性愈伤组织的诱导率㊂试验添加1μm o l㊃L -1和5μm o l ㊃L -1C u2+促进了紫花苜蓿愈伤诱导率,但1601Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷对胚性愈伤诱导效果则尚需进一步研究㊂3.3金属离子影响紫花苜蓿胚性愈伤形态高浓度的A g+通过严重的氧化应激引起形态畸变和细胞膜损伤,从而对愈伤组织诱导产生负效应[30]㊂本研究中紫花苜蓿 游客 3种愈伤组织形态学观察表明,诱导的紫花苜蓿胚性愈伤组织具有致密的绿色颗粒状结构,在细胞学形态上具有明显的分生中心,并形成了球状胚和子叶型胚的胚状结构,与连香树[31]和 凤丹白 [32]组培上的研究结果相一致㊂受紫花苜蓿基因型的影响,本研究添加A g+的愈伤组织形态学观察发现,形成的愈伤组织更加紧密㊁表面颗粒状增多,说明A g+对紫花苜蓿胚性愈伤品质有明显促进作用,并可实现在紫花苜蓿胚性愈伤组织早期组织学形态鉴定,便于早期优质胚性愈伤组织的筛选㊂如何突破同源四倍体栽培苜蓿品种基因型上的限制㊁提高胚性愈伤组织出愈率,金属离子在胚性愈伤组织形态上的作用,也许能提供一些思路㊂玉米中报道了Z m S A U R15基因参与吲哚-3-乙酸的生物合成和未成熟胚衍生愈伤组织的细胞分裂,敲除Z m S A U R15可以改善未成熟胚胎诱导胚性愈伤组织形成的能力,从而提高愈伤组织再生效率[33]㊂而金属离子在苜蓿胚性愈伤组织诱导中的分子机理则有待进一步研究㊂4结论紫花苜蓿 游客 的下胚轴作为外植体能够很好地诱导愈伤组织的形成; 游客 和 P a o l a 胚性愈伤诱导率均较高的培养基为M S+1m g㊃L-12,4-D +0.2m g㊃L-1K T,诱导率分别为24.67%, 16.67%; S a r d i7 的胚性愈伤诱导效果最佳的培养基为M S+2m g㊃L-12,4-D+0.2m g㊃L-1K T,诱导率为27.33%;1μm o l㊃L-1和5μm o l㊃L-1C u2+均能促进 S a r d i7 游客 和 P a o l a 愈伤组织的诱导,其中 P a o l a 的愈伤诱导率在1μm o l㊃L-1C u2+浓度下最高,为86.7%, 游客 和 S a r d i7 的愈伤诱导率在5μm o l㊃L-1C u2+浓度下最高,分别为92.0%,92.7%;5μm o l㊃L-1A g+显著提高了 游客 和 P a o l a 的胚性愈伤诱导率,较不添加A g+的对照组分别提高了25.3%,46.7%(P<0.05)㊂参考文献[1]张婧,包爱科,柴薇薇,等.农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系研究进展[J].分子植物育种,2020,18(3):931-943 [2] C H E N H T,Z E N G Y,Y A N G Y Z,e t a l.A l l e l e-a w a r ec h r o-m o s o m e-l e v e l g e n o m e a s s e m b l y a n d e f f i c i e n t t r a n s g e n e-f r e e g e-n o m e e d i t i n g f o r t h ea u t o t e t r a p l o i dc u l t i v a t e da l f a l f a[J].N a-t u r eC o m m u n i c a t i o n s,2020,11(1):1-11[3]程子珊,易敏,宋才玲,等.湿地松体细胞胚胎发生胚性愈伤组织诱导条件优化[J].江西农业大学学报,2021,43(5):1054-1064[4]艾婧,蒋湘宁,盖颖.日本落叶松胚性愈伤组织遗传转化方法的优化[J/O L].h t t p://k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/46.1068.S.20220606.1454.004.h t m l,2022-06-07/2022-12-02 [5]王晓春,师尚礼,梁慧敏,等.2,4-D和6-B A组合配比对金达苜蓿愈伤组织诱导与分化的影响[J].草地学报,2010,18(2): 219-222[6] P R I N T ZB,L U T T SS,HA U S MA NJF,e t a l.C o p p e r t r a f f i c-k i n g i n p l a n t sa n di t s i m p l i c a t i o no nc e l lw a l ld y n a m i c s[J].F r o n t P l a n t S c i,2016,7(601):1-16[7] P U R N HA U S E RL,G Y U L A IG.E f f e c t o f c o p p e r o n s h o o t a n dr o o t r e g e n e r a t i o ni n w h e a t,t r i t i c a l e,r a p ea n dt o b a c c ot i s s u e-c u l t u r e s[J].P l a n tC e l lT i s s u ea nd O r g a n C u l t u r e,1993,35(2):131-139[8] M O H I U D D I N A K M,C H OWD HU R Y M K U,A B D U L L A HZC,e ta l.I n f l u e n c eo fs i l v e rn i t r a t e(e t h y l e n e i n h i b i t o r)o nc u c u m b e r i nv i t r o s h o o tr e g e n e r a t i o n[J].P l a n tC e l lT i s s u ea n dO r g a nC u l t u r e,1997,51(1):75-78[9] S O N G S T A DDD,A R M S T R O N GCL,P E T E R S E N W L.A g-N O3i n c r e a s e s t y p e I I c a l l u s p r o d u c t i o n f r o mi m m a t u r e e m b r y-o s o fm a i z e i n b r e dB73a n d i t sd e r i v a t i v e s[J].P l a n tC e l lR e-p o r t s,1991,9(12):699-702[10]S HA N GFY,N E I LE H.E t h y l e n eb i o s y n t h e s i s a n d i t s r e g u-l a t i o n i nh i g h e r p l a n t s[J].P l a n t P h y s i o l,1984,35:155-189 [11]杨筱,孟亚雄,马小乐,等.C u S O4和E D T A-F e对小麦成熟胚再生体系的影响[J].分子植物育种,2016,14(3):679-686[12]B E L L O-B E L L OJ J,C H A V E Z-S A N T O S C O YR A,L E C O N A-G U Z MA NCA,e t a l.H o r m e t i c r e s p o n s eb y s i l v e rn a n o p a r t i-c l e so ni nv i t r o m u l t i p l i c a t i o no fs u g a r c a n e(S a c c h a r u m s p p.C v.M e x69-290)u s i n g at e m p o r a r y i m m e r s i o ns y s t e m[J].D o s e-R e s p o n s e,2017,15(4):1-9[13]李红,李波,陈雪梅,等.苜蓿愈伤组织细胞学观察及芽分化的研究[J].江苏农业科学,2015,43(6):49-51[14]付丽,张东向,刘丽杰,等.甘草外植体诱导愈伤组织形成条件优化[J].种子,2021,40(12):139-143,148[15]谷蕊,苏德毕力格,徐舶,等.草原4号紫花苜蓿两种再生分化途径的建立和比较[J].中国草地学报,2022,44(5):114-120 [16]李波,彭丹,徐婉玉,等.苜蓿不同外植体愈伤组织诱导效果及其相关性分析[J].种子,2016,35(2):73-75[17]王宏霞.美国红枫离体培养外植体的筛选[J].现代园艺,2022,45(15):30-32[18]赵晓倩. 甘农四号 紫花苜蓿愈伤组织诱导研究[J].甘肃联合大学学报(自然科学版),2013,27(5):61-63[19]王文斌,王琳.紫花苜蓿高效遗传转化受体系统的建立[J].山西农业科学,2013,41(7):653-6572601Copyright©博看网. 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苜蓿愈伤组织的诱导和再生体系的建立作者：徐长绘周洪荣张大明来源：《现代农业科技》2008年第10期摘要以改良SH为基本培养基，研究了不同激素配比和不同外植体对苜蓿愈伤组织诱导的影响，筛选出诱导愈伤组织的最佳外植体是下胚轴、最佳培养基为SH＋2，4-D 2mg/L＋KT 0.2mg/L；继代增殖后对愈伤组织进行分化再生培养，研究了附加不同浓度外源激素的MS和改良SH培养基对愈伤组织分化的影响，确定最佳分化培养基为改良SH＋NAA 0.1mg/L＋KT 0.5mg/L。

关键词苜蓿；愈伤组织；诱导；分化中图分类号 S551+.7.035.3文献标识码A文章编号1007-5739（2008）10-0017-01苜蓿（Medicago sativa）是豆科多年生草本植物，素有“牧草之王”、“维他命饲料”的美誉。

在我国，苜蓿被大面积推广栽培，并为农牧业发展及环境改善发挥着巨大的经济效益和生态效益。

但苜蓿有培育周期长、见效慢、病虫害无法消除、干物质消化率难以提高等缺点，不能满足畜牧业对其日益增长的需求。

随着分子生物学和植物基因工程的发展，人们借助生物技术手段建立高频、高繁、高效的苜蓿再生体系，成为现在苜蓿遗传改良的重要途径。

本试验通过研究不同外植体和不同外源激素组合的培养基对苜蓿愈伤组织的诱导、芽分化的影响，以期建立高频快繁稳定的苜蓿再生体系，为进一步实施苜蓿基因的遗传转化奠定基础。

1材料与方法1.1试验材料供试苜蓿品种公农1号，来源于黑龙江省畜牧研究所。

1.2试验方法1.2.1无菌苗的培养。

选取饱满有光泽的种子，用自来水冲洗45min，滤纸吸干后，用70%酒精漂洗0.5min，0. 1 %氯化汞溶液消毒10min，无菌水冲洗 4~6 次，接种于无激素的 MS培养基中，28 ℃的培养箱中萌发。

1.2.2不同外植体的建立。

取无菌苗5日龄子叶5mm×2mm小段、下胚轴5mm长小段、10日龄茎段5mm小段（茎段a），并取大地种植的苜蓿成体植株的细嫩茎段（茎段b）作对照试验，分别接种于不同成分诱导培养基中，温度23 ±2℃，光照 12h/d，光照度约 2 000Lx。