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检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×t式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD•Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。
目的本检测方法是用来确定本公司纤维素酶类的催化活性。
本方法适用于各种固体和液体纤维素酶制剂。
说明本方法适合于纤维素类酶的质量分析和质量控制领域。
但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。
鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。
1950 年Reese提出了C1-Cx概念。
C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。
再由Cx最终催化形成还原性单糖。
而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)。
这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。
（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称CBH）。
这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。
（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。
据上述理论，分别设计以滤纸（filter paper）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量纤维素的总体酶活性（FPA）、C1、Cx、Cb酶活性。
将底物水解后释放还原性糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
纤维素酶类活性的定义Ⅰ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1×6cm的滤纸（FPA）产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个FPA酶活力单位。
纤维素酶的检测方法新纤维素酶的检测方法摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。
关键词：纤维素酶酶活测定葡萄糖回归方程一、纤维素酶及其降解原理纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。
据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。
大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。
所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。
纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。
自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。
目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。
纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。
习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx 酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。
C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。
Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。
Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。
Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。
纤维素酶的三种活力测定方法纤维素酶是一种广泛存在于自然界中的酶类，具有重要的降解纤维素的功能。
对于工业生产、环境保护及生物能源等领域都有着极为广泛的应用。
因此，纤维素酶的测定方法也越来越受到研究者的关注。
本文将针对纤维素酶的三种活力测定方法进行详细介绍。
一、滴定法滴定法是最为简单、传统的纤维素酶活力测定方法。
其操作步骤相对较简单，但由于其受试物中的葡萄糖数量较小，因此准确度不如其他测定方法。
滴定法的具体操作步骤如下：1.采用苯酚褐或者硫酸铜-硫氰化钾将葡萄糖转化为光滑葡萄糖2.使用离子交换树脂净化试样3.通过酸水解，将可分离出的光滑葡萄糖转化为葡萄糖4.通过NaOH溶液中添加试样，测定试样所需要的NaOH溶液的体积二、反向相色谱法反向相色谱法是一种基于色谱技术的测定方法。
比滴定法更加准确且可靠。
反向相色谱法可以通过改变样品与固相载体的交互时间，实现对样品组分的分离。
其操作步骤如下：1.使用有机溶剂混合纤维素样品2.净化溶液，分离部分有机溶剂和水3.试样在反向相色谱柱上，随柱子流动4.通过检测器检测滴量，确定样品的浓度三、淀粉-纤维素显色法淀粉-纤维素显色法是一种基于酶法和化学显色技术结合的测定方法。
其同时测定酶反应的数量和反应的速率，可以获得相对准确的数据。
具体操作过程如下：1.样品中的淀粉与纤维素同时与碘反应2.通过求字头光度的变化及测试时间的变化，测定酶的活力3.以酶动力学为基础，通过数据分析得到相应的酶反应速率总结起来，以上三种方法均可用于纤维素酶的活力测定。
针对不同的需求，可以选择适当的方法进行测定。
其中，受试物的纯度和净化程度是影响精度的关键因素，因此在测定前要进行适当的纯化。
在生产过程中，可以选择淀粉-纤维素显色法作为主要测定方法，以保证产物质量的稳定性和可控性。
纤维素酶（cellulase ，CL ）/羧甲基纤维素酶活性测定试剂盒说明书微量法100管/48样注 意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义：CL （EC 3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化羧甲基纤维素降解，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。
测定原理：采用蒽酮比色法测定CL 催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、浓硫酸和蒸馏水。
试剂的组成和配制：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体6mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存； 临用前加入5mL 蒸馏水和45mL 浓硫酸充分溶解待用。
样品测定的准备：1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL ）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W ，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g ）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
加样表和测定步骤：37℃振荡反应1h 后，90℃水浴15min （盖紧，防止水分散失），冷却后试剂名称 对照管 测定管 样本 50 50 试剂一（μL ） 90 试剂二（μL ） 370 370 蒸馏水（μL ）180908000g 25℃离心10min，取上清，得糖化液糖化液(μL)140 140试剂三(μL)260 260 混匀，90℃水浴10min（盖紧，防止水分散失），冷却，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，测620nm下吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。
四种纤维素酶酶活测定方法的比较一、本文概述纤维素酶是一类能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，它们在生物降解纤维素以及纤维素类物质的转化利用中发挥着至关重要的作用。
由于纤维素酶在纺织、造纸、生物燃料、食品工业等多个领域的广泛应用，对其酶活性的准确测定就显得尤为重要。
本文旨在比较四种常用的纤维素酶酶活测定方法，包括滤纸酶活法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活法、对硝基苯酚纤维二糖法（pNPC）和荧光底物法，以期为读者提供一个全面而深入的理解，帮助研究者根据实验需求选择合适的测定方法。
本文将首先简要介绍纤维素酶的重要性和应用领域，然后详细阐述这四种酶活测定方法的原理、操作步骤、优缺点以及适用范围。
通过对比这些方法的灵敏度、准确性、重现性、操作简便性等方面，我们将为读者提供一个清晰的方法选择指南。
本文还将讨论影响酶活测定准确性的因素，并提出相应的改进措施，以期提高纤维素酶酶活测定的准确性和可靠性。
我们将对纤维素酶酶活测定方法的未来发展趋势进行展望，以期为相关领域的研究和应用提供参考和借鉴。
二、方法介绍纤维素酶是一种能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，其酶活测定对于了解纤维素酶的性质、优化酶的生产工艺以及评估其在各种工业应用中的效率至关重要。
目前，常见的纤维素酶酶活测定方法主要包括滤纸酶活测定法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法、还原糖法以及荧光底物法。
滤纸酶活测定法：此方法是基于纤维素酶对滤纸的水解能力。
在一定条件下，纤维素酶将滤纸水解成还原糖，通过比色法或滴定法测定还原糖的含量，从而推算出纤维素酶的活性。
该方法操作简单，但受滤纸质量、实验条件等因素影响，结果可能存在一定误差。
羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法：该方法以羧甲基纤维素钠为底物，通过测定酶解后释放的还原糖量来计算纤维素酶的活性。
该方法具有底物纯度高、反应条件易控制等优点，因此在许多研究中得到广泛应用。
然而，CMC与天然纤维素的结构差异可能导致测定的酶活与实际应用中的酶活不完全一致。
纤维素酶活力的测定实验报告1.实验目的本实验旨在通过测定纤维素酶的活力，了解其在不同条件下的活性及作用效果，为进一步研究纤维素酶的应用提供实验依据。
2.实验原理纤维素酶是一种能够分解纤维素为可溶性糖的酶，其活性高低直接影响着纤维素分解的效果。
本实验采用DNS法测定纤维素酶活力，该方法具有操作简便、准确性高等优点。
具体原理如下：在一定条件下，纤维素酶与底物反应产生可溶性糖，其含量可用DNS试剂进行显色反应，根据吸光度值计算可溶性糖的含量，进而求得纤维素酶活力。
3.实验步骤（1）实验准备：准备5mmol/LCMC-Na溶液、10mg/mLDNS溶液、100mmol/LNaOH溶液、纤维素酶溶液；取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、1mL 酶液、2mLNaOH溶液，混合后摇匀。
（2）设置对照：取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、2mLNaOH溶液混合后摇匀，作为对照溶液。
（3）反应：将酶液和对照液分别加入两支试管中，于50℃水浴中恒温20分钟。
（4）显色：取出试管，分别加入1mLDNS溶液，摇匀后再次置于50℃水浴中恒温20分钟。
（5）比色：取出试管，冷却至室温，分别以空白试剂为参比，于540nm波长处测定各管吸光度值。
4.实验结果根据实验数据可知，纤维素酶活力为20.33U/mL，对照液吸光度值为0.65。
5.实验分析通过实验结果可知，本实验条件下得到的纤维素酶活力为20.33U/mL，与文献报道值相符。
这说明本实验所选条件较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。
同时，实验过程中采用了DNS法测定可溶性糖含量，该方法具有较高的准确性，因此实验结果可靠。
6.实验结论本实验通过DNS法测定纤维素酶活力，得到了较为准确的实验结果。
这说明本实验所选条件和方法均较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。
同时，本实验也为进一步研究纤维素酶的应用提供了实验依据。
在实际应用中，可根据具体需求调整实验条件和方法，以获得更为准确的实验结果。
酶活力的测定方法
颁发部门：品管部技术标准(国标）页码：共2页第1页
1.目的
建立纤维素酶活力的测定方法，为各部门人员测定纤维素酶活力提供依据
2.适用范围
适用于饲料添加剂的饲料酶产品，也适用于添加有纤维酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。
3.方法原理
纤维素酶从纤维素中分解出还原糖，还原糖又同2—羟基—3.5—二硝基苯甲酸发生反应，产生一种黄—橙混合色，可用分光光度法测定其色深。
4.定义
在规定条件下，每小时催化底物生成1μmol葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位（μmol／hr）。
5.试剂和溶液
5.1磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液
溶液A：0.2 mol/L Na
2HP0
4
·H
2
0：取Na
2
HP0
4
·H
2
0 35.6g或Na
2
HP0
4
·12H
2
0 71.62g，用蒸馏水溶
解后定容至1000mL。
溶液B：0.1 mol/L柠檬酸液：取一水柠檬酸（C
6H
8
O
7
·H
2
0）21.01g，用蒸馏水溶解后定容至1000
mL。
溶液C：取A液493 mL，加入507 mL B液混合均匀即为pH4.8磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液。
5.2 DNS试剂
取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3.5－二硝基水杨酸6.3g，NaOH 2lg，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用，室温下放置7天后使用。
有效期一个半月。
5.3羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液
取2g羧甲基纤维素钠（粘度300—600厘泊）溶于 200mL蒸馏水中，水浴加热至溶，用一层纱布过滤。
取滤液 100mL，加入 PH=4.8 磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 20mL，蒸馏水 40mL混匀，贮冰箱备用。
一周后应重新配制。
5.4 1%标准葡萄糖液〕
精确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖（AR）1.000g，以蒸馏水溶解，定容于100 mL容量瓶中制成1%浓度的标准葡萄糖液
6.仪器和设备
6.1恒温水浴锅 40±2℃
6.2紫外分光光度计UV1601
6.3电子天平(0.001g)
6.4漩涡混合器
7.试验步骤
批准日期审核日期编制日期
生效日期：
颁发部门：品管部
酶活力的测定方法
技术标准页码：共2页第2页
7.1标准曲线的制作
分别吸取1%标准葡萄糖液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL于50 mL容量瓶中，用蒸馏水制成每mL分别含有葡萄糖200，400，600，800，1000，1200μg的标准液。
各取不同浓度标准液0.5 mL 于试管中，加PH4.8磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液1.5 mL，DNS试剂3 mL于沸水浴中沸腾7min（样品放入重新沸腾时算起），取出后立即加入蒸馏水10 mL混匀，冷却后，在紫外分光光度计550nm 比色，以所得的光密度OD值为横座标，以对应的标准葡萄糖液浓度的二分之一的值（即：100，200，300，400，500，600，此为每管中葡萄糖的μg数）为纵座标，绘制标准曲线。
空白的制作：以0.5 mL蒸馏水代替0.5 mL标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作
7.2测定步骤
待测酶液的制备，精确称取一定量“四分法”采样取得的样品1.000g至50mL的试管中，加缓冲液19mL置于漩涡混合器中震荡至完全溶解，于40℃土2℃的水浴锅浸提60分钟，浸提过程中反复震荡3－4次，浸提后取上清液作为待测酶液。
待测酶液用缓冲液稀释到一定倍数（控制测定OD值在0.2—0.4之间），取经40℃预热的此稀释液0.5毫升，加入经40℃预热的CMC液1.5mL（每个样品同时作2 －3个不同稀释倍数的梯度，每个梯度同时作两支平行试管），40℃恒温精确反应20分钟，立即加入DNS试剂3mL，立即沸水浴中煮沸7分钟，终止反应，以下步骤同标准曲线制作。
空白制作：取稀释液0.5mL后，先加入DNS试剂3mL，再加入CMC液1.5mL，以下步骤同样品操作。
8.计算
r 60
CMC酶活力（μmol／hr·g或u／g）＝—————×———
w·20180
式中：r—从曲线上查得与标准葡萄糖液相对应葡萄糖微克数。
60—1小时＝60分钟。
1
W—实际参与反应的酶量即0.5×—————
稀释倍数
（注：稀释倍数为从固体酶粉到最终稀释酶液过程中，每次稀释倍数之积。
）20—反应时间，min
180—为葡萄糖的分子量。
注：每个样品同时做的两支平行试管，其相对误差＝±l0％，超过此范围，试验应重做。
批准日期审核日期编制日期
生效日期：。
