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体内药物分析 第三章 生物样品与样品制备..

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体内药物分析第三章生物样品与样品制备

体内药物分析第三章生物样品与样品制备
数据记录与审核
建立完善的数据记录与审核制度，确保实验数据的真实性和可追溯性。
效果评价指标设定和持续改进方向
效果评价指标
根据实验目的和要求，设定合理的效果评价指标，如方法回收率、精密度、准确度等，对实验结果进 行客观评价。
持续改进方向
针对实验过程中出现的问题和不足，制定改进措施并持续改进，如优化实验条件、改进操作方法、提 高设备性能等，不断提高体内药物分析的质量和效率。同时，关注新技术、新方法的发展和应用，不 断完善和更新质量保证和质量控制体系。
质量控制样品的使用
使用质量控制样品进行方法验证和日常质量监控，确保实验结果的准 确性和可靠性。
质量控制方法选择及实施过程监控
方法学验证
在建立新的体内药物分析方法时，应进行充分的方法学验证，包括专属性、线性、精密度、准确 度、稳定性等方面的考察，确保方法的可行性和准确性。
过程监控
在实验过程中，采用定期抽查、盲样测试等方式对实验过程进行监控，确保实验操作的规范性和 结果的可靠性。
04 生物样品保存、运输和接 收标准操作流程
保存条件及时限设定原则
保存条件
生物样品应在规定的低温条件下保存，以确保样品的稳定性和防止降解。通常，血浆、血清和尿液等样品应在20°C或更低温度下保存，而一些特殊样品可能需要在-70°C或更低温度下保存。
时限设定
生物样品的保存时限应根据其稳定性和分析物的性质来确定。一般来说，长期保存的样品应在采集后尽快处理并 冻存，以避免分析物的降解或转化。同时，应定期对保存样品进行质量评估，以确保其完整性和可用性。
新型生物样品的保 存与运输
对于细胞和基因等新型生物样 品，同样需要在低温条件下保 存和运输。此外，还应避免反 复冻融和长时间存放，以确保 样品的稳定性和可靠性。

体内药物分析重点

体内药物分析重点

第一章绪论1．体内药物分析（pharmacetical analysis in biological sample）:一门研究生物体内中药物及其代谢产物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学科。

2、任务：（1）进行分析技术、分析方法学研究，提供最佳分析条件。

（2）为药物体内研究提供数据（3）服务于临床治疗药物监测，参与指导临床科学用药。

（4）内源性物质的测定和研究（5）滥用药物的检测。

3、特点：（1）生物样品中干扰物质多；（2）生物样品量少，不易重新获得；（3）分析方法要求高；（4）、实验室仪器设备要求高；（5）、测定目标与数据处理复杂；（6）、工作量大：个体差异；数据量大。

4、热点问题；（1）游离型血药浓度测定方法的研究（2）代谢物的监测与研究（3）对映体药物的检测与研究（4）体内微量元素的测定与研究（5）中药药物代谢动力学研究（6）方便、快捷的样品制备方法与样品直接进样分析的研究（7）分析新方法、新技术的联用研究（8）体内药物分析方法的质量控制研究（9）单克隆抗体类药物的体内过程研究。

第二章——体内药物分析相关的理论基础概述•第一节药物的体内过程一、药物的吸收（Absorption）：药物由给药部位未经化学结构变化而直接进入血液循环系统的过程。

1、吸收速率：药物理化性质（脂溶性、解离度）、药物转运类型、给药途径、药物剂型、吸收部位的血流状况、药物浓度2、药物的吸收部位：胃肠道吸收胃吸收（1）非离子扩散方式吸收——与分子状态的脂溶性相关（2）pKa相近时，脂溶性大者吸收快（3）酸性药物易吸收（4）滞留时间短(5)吸收量有限。

小肠吸收(1)停留时间长(2)吸收面积大(3)主要部位碱性药物。

影响胃肠道吸收的因素: 剂型及理化特性、食物、胃肠道的功能状态、药物的首过效应、药物相互作用。

剂型与理化特性:相同药物不同剂型，吸收速度和程度不同。

普通片、缓释片、分散片。

食物：一般可延缓药物的吸收，但不影响吸收总量不同食物的pH值、脂溶性、纤维含量以及对胃肠道的刺激程度，都将使药物的吸收增加或减少。

第三章 生物样品与样品制备

第三章 生物样品与样品制备

有两种洗脱方式：

一种是杂质与固定相的亲和力强，药物被 直接洗脱；

另一种是药物与固定相的亲和力强，杂质 被洗脱；然后用一种亲和力更强的溶剂洗 脱药物。
常用的聚丙烯SPE柱：长约2～3cm 自行填料装柱 从市场上购买
使用方法： 将样品溶解在适当的溶剂中，加到微型柱 上端，用以下方法使溶剂加速通过SPE柱：
紫外衍生化试剂包括：



苯甲酰甲基溴和萘甲酰甲基溴类试剂(适于羧酸) 芳香胺类试剂(适于羧酸) 酰氯类试剂(适于羟基) 异氰酸苯酯(PIC)(适于羟基) 2，4-二硝基苯肼(2，4-DNPH)(适于羰基) 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(适于羰基) 取代苯甲酰氯类试剂(适于伯胺、仲胺) 芳基磺酰氯类试剂(适于伯胺，仲胺) 硝基苯类试剂(适于伯胺，仲胺) 异氰酸酯和异硫氰酸酯(适于伯胺、仲胺)
自学
三、离线生物样品制备方法
生物样品的预处理方法： 有机破坏法 去除蛋白法 分离、纯化和浓集法 缀合物的水解 化学衍生化法
（一）有机破坏法
1. 湿法破坏 2. 干法破坏 3. 氧瓶燃烧法
（二）去除蛋白法
目的：
去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发 泡，减少乳化，还可以保护仪器(如保护 HPLC柱不被污染，延长使用期限) 。
2．加入中性盐

加人中性盐，使溶液的离子强度发生变化。 中性盐能将与蛋白质水合的水分子置换出 来，从而使蛋白质脱水而沉淀。 常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、 镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。

3．加入强酸


原理：当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白 质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可 与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。 常用的强酸有：l0％三氯醋酸、6％高氯酸、 硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。

体内药物分析 体内样品分析 (药物分析课件)

体内药物分析 体内样品分析 (药物分析课件)

分光光度法 薄层扫描法 气相色谱法 高效液相色谱法
免疫法
五、样品的测定方法
方法
紫外-可见分光光度法 荧光分光光度法 原子吸收分光光度法 紫外扫描 荧光扫描 氢火焰监测器 氮磷检测器 电子捕获监测器 质量碎片选择离子监测器 紫外检测器 荧光检测器 电化学检测器 放射免疫法 酶免疫法 荧光免疫法 游离基免疫法
体内药物分析
一、样品的种类
体内药物分析采用的生物样品种类包括体内的各种体液和组织。其中 最常用的是血液（血浆、血清、全血）、尿液和唾液。
二、样品的采集
采集原则
根据不同的分析目的和要求进行选取； 所取样品应能正确反映药物浓度与效 应之间的关系； 样品应易于获取，便于处理、分析。
二、样品的采集
（一）血样 血样包括血浆、血清和全血，是体内药物 分析中最常用的样品。 血样采集方法：静脉取血或毛细血管取血。 血样采集的量：一般取血量为1～3ml。 动物：采血量不宜超过动物总血量的1/10。
四、样品的制备及测定
样品的制备 （一）样品制备方法选择的一般原则
生物样品的类型 药物的理化性质和浓度范围 药物测定的目的 样品制备与分析技术的关系
四、样品的制备及测定
（二）样品的制备方法 1.去蛋白法
（1）加入沉淀剂和变性试剂：加入中性盐、加入酸、加入金属离子。 （2）加入可与水混溶的有机溶剂：如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四 氢呋喃等。 （3）酶消化法：最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。
二、样品的采集
（二）尿液
测定尿药浓度主要用于药物的 剂量回收、肾清除率和生物利 用度的研究以及药物代谢类型 的测定。体内兴奋剂检测的样 品主要是尿液。
二、样品的采集
（三）唾液
唾液的pH约在6.9±0.5，个体差异较 大，此外尚受到一些其他因素，如有 无刺激，剌激类型、强度与持续时间， 年龄，性别，疾病，药物等的影响。 一些药物的唾液浓度与血浆浓度相关， 样品易得，取样无损害。

5体内药物分析z

5体内药物分析z

1．从分析物分
代谢物
内源性物质
2．从生物样品种类分
均匀样品 非均匀样品
3．从样品的来源分
体内药物分析
人体 实验动物
11 2021/8/4
体内药物分析的对象
研究对象
评价药物的安全性（临床前研究）—动物
评价药物的有效性（临床研究）—人体 （健康志愿者或患者）
用药的安全、有效与合理—人体（患者 TDM ）
体内药物分析
2 2021/8/4
药物进入体内后
—— 经过吸收、分布、代谢和排泄等动力学过程 —— 化学结构和存在状态都可能发生变化 —— 在不同个体中存在差异（个体差异） —— 进而直接影响到药物在不同个体中的治疗效 应和毒副作用
需对生物体内药物及其代谢物进行研究分析
体内药物分析
3 2021/8/4
体内药物分析
33 2021/8/4
四 何时需要进行治疗药物监测
临床治疗中的常规血药浓度监测是指测 定规律服用某药物 5 个半衰期后已达稳定的 血药浓度
用一般剂量或超过一般剂量仍不能控制 病情时，通过监测可以了解病人是否规律用 药、代谢率是否加快、有无耐药现象等
体内药物分析
34 2021/8/4
① 治疗药物监测的核心目的是实现合理的 给药方案个体化
② 协助诊断和处理药物过量中毒，及进行 其临床药理学研究
③ 了解患者是否遵医嘱用药，提高用药依 从性
体内药物分析
30 2021/8/4
治疗药物监测与临床药代动力学研究的区别
① 血药浓度结果用于调整剂量，设计个体化 给药方案
② 一般只监测一次血药浓度，不测药物经时 变化浓度
药物服用的剂量越来越小、体液中药物浓度越 来越低，对体内药物分析方法提出了新的要求：

体内药物分析方法

体内药物分析方法
代谢情况
3．明确测定目的、要求
目的
药浓监测 药代动力学研究
母体药物和代谢物 4．结合实验室条件 设备条件 预处理方法
三、分析方法的建立
1．纯品进行测定
确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T） 2．空白样品测定
确定空白样品是否有干扰
3．以水代替空白样品，加标准液后测定 了解提取率、检测浓度 确定萃取条件、pH、挥发浓缩等
阳离子：NH2+
反离子烷基或芳基磺酸盐
（5）提取技术
一般在试管中进行 有机相与水相比1:1或2:1
（6）乳化问题 措施
①轻缓振摇 ②含有分散度大或不溶物应过滤掉
③避免在高pH条件下，从水中提取药物 ④避免使用易发生乳化的溶剂 ⑤萃取剂水中加入少量NaCl
破孔方法
①机械法 ②加入少量高级脂肪醇 改变表面张力
一般要求绝对回收率在≥70%
一般方法
HPLC内标
反相C18 固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化
6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态
③上样
④分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相 ⑤洗脱待测物 改变pH或极性
（2）影响固相萃取的因素
（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低
柱处理 5~10ml·min-1
洗脱 0.2~1ml·min-1（〈300mg〉 2~5ml·min-1（>300mg）
有效
研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新
药
研究药物相互作用机制 有利于建立体内药物分析新方法，避免代谢物干扰
2．药物代谢的途径
第一相反应：在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极 性增加，水溶性增强
第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、 硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结 合过程通常使药物灭活。

药物分析学：总论第三章 样品前处理和药物提取技术自测题

药物分析学：总论第三章 样品前处理和药物提取技术自测题

总论第三章样品前处理和药物提取技术自测题一、最佳选择题1．最常见生物样品有________.A.血液样品B. 尿液样品C.肝脏样品D.头发样品E.唾液样品2．为了完全去除蛋白质，其离心速度应大于_______.A.1000r/minB. 3000r/minC.5000r/minD.7000r/minE.10000r/min3．溶剂提取时，水相pH的选择很重要，因为它决定药物的存在状态。

一般来说，碱性药物最佳pH值要高于pKa值______，而酸性药物则要低于pKa值_____，这样就能使90％的药物以非电离形式存在而更易被有机溶剂提取A.1～2个pH单位, 1～2个pH单位。

B. 1～2个pH单位, 3～4个pH单位。

C. 3～4个pH单位, 1～2个pH单位。

D. 3～4个pH单位, 4.5～5个pH单位。

E. 4.5～5个pH单位,3～4个pH单位。

4．不属于固相萃取操作流程的是________。

A．柱活化B．加样C．柱清洗和柱干燥D．样品洗脱E．样品干燥5.不属于超临界萃取在生物样品预处理中优点的是_______。

A.回收率高，不易乳化B.分析速度快，适于批量处理C.适用范围小D.易于联用E减少了有毒性的有机溶剂的使用6. 使用离子对提取法，欲提高药物提取入有机相的量，应选择对离子对溶解度_______的有机溶剂。

A．大B．小C．尽量一样D．或大或小E．没有影响二、多项选择题1．生物样品预处理的目的为______。

A．使药物或代谢物从结合物及结合物中释放出来，以测定药物或代谢物总浓度。

B.生物样品介质组成复杂，对药物测定干扰多，且药物组分很微量，必须先经过分离、纯化、富集。

C.为了适应和满足测定方法的专属性要求。

D.防止分析仪器的污染，提高测定方法的效能。

E. 降低成本。

2．生物样品预处理要考虑的因素为_______。

A．药物的理化性质和存在形式。

B．待测药物的浓度范围。

C．药物测定目的。

体内药物分析 生物样品与样品制备

体内药物分析 生物样品与样品制备
唾液中药 物浓度有显著影响，实验证明唾液中可待因 的平均浓度在非刺激条件下比酸刺激条件下 高3.6 倍，比机械性刺激低50%，是商品化 采集装置的77%。 shellee 的实验证明：酸刺激组和非刺激组 相比，非刺激组唾液与血液药物浓度相关 度( 0.901) 明显高于酸刺激组( 0.872) ， 说 明酸刺激采集对唾液与血液药物浓度相关 性有不利影响。 17
22
滥用药物、抗抑郁药和抗精神病药等药物都 有长期用药的方式，由于药物在头发中的积累和 储存,为这些药物的检测提供了可能性。 尼古丁、卡马西平、阿米替林、多虑平、安 坦、氯丙嗪、泰尔登、三氟拉嗪、氯氮平和氟 哌啶醇等精神药物均能进入头发，但进入头发 的难易程度是不一致的。药物进入头发的难易 程度可能与药物的分子量、极性和脂溶性有关。
6
(2)血清的制备 采集的静脉血液置试管中，放置30 min到1 h，由于激活了一系列凝血 因子，血中的纤维蛋白原形成纤维 蛋白，血液逐渐凝固，离心后上层 澄清的淡黄色液体即为血清。
7
血浆比血清分离快，而且制取的量约为全血 的50%～60%（血清只有30% ～ 40%）， 多数研究者喜用血浆进行分析测定。若血浆中 含有的抗凝剂对药物的测定有影响，则应使用 血清样品。
4. 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 5. 超滤法 6. 酶水解法 7. 加热法 蛋白质大分子不能通过半透膜 游离药物 枯草杆菌酶，贵，时间长 少用 少用
疑问：2、4法中的盐使溶液的极性更强，药物会游离出？
在色谱法中，高浓度的盐会析出，把柱子堵了
34
以上去除蛋白质法仅去除了蛋白 质（只起到保护色谱柱的作用），但 内源性的杂质都在，样品浓度还被稀 释。基本上不能用光谱法测定。
15
唾液的采集
唾液的采集应尽可能在刺激少的安静状态下 进行。一般在漱口后15min收集，至少采集10 min。 采集混合唾液也可用物理或化学的方法刺激， 在短时间内得到大量的唾液。 非刺激法条件下唾液直接流入容器内，流速 慢，仅约0.05 mL/min。 物理刺激法唾液分泌流速为1～3mL/min; 化学刺激法是用酸刺激味觉或者毛果芸香碱 刺激唾液分泌，流速可达5～10mL/min。

体内药物分析 第三章 生物样品与样品制备

体内药物分析 第三章 生物样品与样品制备
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22
（二） 去除蛋白质
2、加入中性盐
常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白 脱水而沉淀）：
饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸 橼酸盐
比例：1：2 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
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（二） 去除蛋白质
3、加入强酸
常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）： 10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液 、5％偏磷酸
完，不能反复冷冻→解冻→冷冻(FTC)；样品应以小 体积分装存放。
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第二节 生物样品的预处理与制备
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一、预处理目的
（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度 （二）纯化、富集药物 （三）适应和满足测定方法要求的灵敏度 （四）防止对分析仪器的污染和劣化
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二、样品制备时应考虑的问题
（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围 （二）药物测定的目的 （三）生物样品种类和杂质干扰类型 （四）样品的化学组成 （五）药物的蛋白结合率 （六）被测组分在预处理过程中的稳定性 （七）样品在收集、储存等过程中容器的污染 （八）样品的预处理过程要求简便 （九）预处理的最后一步应富集被测组分 （十）对分析方法的要求
离子对提取法：是一种用有机溶剂提取离子型药物的 方法。
原理：一些酸性或碱性的有机药物在体液中呈离子状 态，成为强亲水性的带电荷离子，不易被提取出来 。当加入与药物呈相反电荷的反离子物质时，即可 成为具有一定脂溶性的离子对，用有机溶剂可萃取 出来。
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碱性药物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等 酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵 提取溶剂：氯仿、二氯甲烷
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SPE的缺点：
1、价格昂贵 2、技术要求高 3、小柱各批之间有差异 4、主子容易堵塞，影响分离效果

体内药物分析-样本处理

体内药物分析-样本处理

血清 则是采取的血液在室温下放置 30 分钟至 1 小时，待血块自然凝结析出后，离 心分离取上清液。血清与血浆基本成分相同是除去纤维蛋白元的血浆。在块凝结时往往易造 成药物吸附的损失。
全血 直接作为样品时，也应加入抗凝剂混血，防止凝血。对于大多数药物来说，血 浆中的浓度与红细胞中的浓度成正比，所以，即使测定全血也不能提供更多的信息，而全血 的净化较血浆或血清更为麻烦。但是，有一些药物能与红细胞结合或药物在血浆和红细胞的 分布比率因人而异，在这些情况下，宜采用全血。
药物进入机体内，通过吸收、分布、代谢和排泄使体液、器官组织和排泄物中存在着微 量的药物或其分解代谢产物，故凡是药物到达上述之处，都是体内药物分析的对象。其中血 液为最常用的生物样品，因为血药浓度与药理作用密切相关，另外还有尿液、唾液、粪便、 头发、组织、呼出气体等。 （二） 体内药物分析的任务
体内药物分析的任务，概括起来可分为两大方面。 1、本身分析方法学的研究与建立 进行分析方法学的研究，在实际应用中，提供合 理的最佳分析条件，评定各种方法能达到的灵敏、专属、准确程度，探讨各种方法应用于体 内药物分析中的规律问题，为临床药学的研究提供灵敏、准确、快速的分析方法。 2、对各种体液和组织中的药物及其代谢物进行测定 为药物体内研究如新药审批、 临床治疗药物监测、滥用药物的检测等提供数据。 （1）为药物体内研究提供数据 在新药研制过程中及已用于临床的药物再进行深入 的体内研究，必须提供药物动力学各种参数，生物利用度及血浆蛋白结合率等基本参数。 （2）进行药浓监测 为临床治疗药物监测提供准确的血药浓度测定值，并对血药浓 度进行具体分析和合理解释，参预指导临床合理用药，制订治疗方案，确定最佳剂量。 （3）滥用药物的检测 麻醉药品，精神药品的滥用在世界范围日益严重，受到广泛 的关注。对于吸毒者体内的毒品和运动员兴奋剂的检测也必须依靠体内药物分析的手段和技 术。

药物分析第三章

药物分析第三章
盖瓶口。
吸收液：
吸收液的作用是将样品经燃烧分解 所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒 等，定量地吸收并转变为一定的便于测 定的价态。
吸收液的选择： 氟： 水 氯： NaOH溶液 溴： H2O2-NaOH或NaOH-硫酸肼饱 和溶液 碘： NaOH－硫酸肼饱和溶液 硫： NaOH或H2O2 硒： 硝酸溶液
葡萄糖酸锑钠的测定
取本品约0.3g，精密称定，置具塞锥 形瓶中，加水100ml、盐酸15ml与碘化钾 试液10ml，密塞、振摇后，在暗处静置 10min，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴 定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴 定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试 验 校 正 。 每 lml 的 硫 代 硫 酸 钠 滴 定 液 (0.1mol/L)相当于6.088mg的Sb。
Br C O
C O
HO SO3Na
OH SO3Na
磺溴酞钠
（二）定量分析前处理方法
C X X
适当的处理


直接回流后测定法 酸性或碱性还原后测定法 氧瓶燃烧分解后测定法
含金属有机药物：
含金属的有机药物： 金属原子不与碳原子直接相连，通常 为有机酸及酚的金属配位化合物。 如：酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、富马酸 亚铁。
等均采用同法测定。
碘番酸的测定
JP
取本品的干燥品约0.4g，精密称定， 加锌粉1g及冰醋酸10mL，加热回流30 min ，放冷，冷凝管用水30mL洗涤，用
脱脂棉过滤，烧瓶与脱脂棉用水洗涤2
次，每次20mL，洗液与滤液合并，加四
溴酚酞乙酯指示液1mL ，用硝酸银滴定
液（0.1mol/L）滴定。终点时黄色沉淀变 为绿色。每1mL硝酸银滴定液(0.1mol/L) 相当于19.031mg的C11H12 I 3NO2。

体内药物分析(精)

体内药物分析(精)

体内药物分析
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第三章 生物样品与样品制备 第一节 生物样品的种类采集
全血的制备
成 分
血浆 红细胞
有形物质 白细胞
血小板
5/31/2019
体内药物分析
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全血的制备
第三章 生物样品与样品制备 第一节 生物样品的种类采集
某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆 浓度低，可用全血（全血净化较血浆和血 清麻烦）
（四）器官组织（tissue）
用于动物试验药物动力学研究 临床服用药物引起中毒死亡
组织处理的一般方法有： 1．匀浆化法
加入一定量的水或缓冲液，在刀片式 匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，取上 清液供萃取用
—方法简单、但回收率低
5/31/2019
体内药物分析
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第三章 生物样品与样品制备 第一节 生物样品的种类采集
化学法的优点：缩短采样时间减小唾液 pH波动（pH≈7.0），S/P个体差异小
5/31/2019
体内药物分析
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第三章 生物样品与样品制备 第一节 生物样品的种类采集
唾液样品的制备
唾液样品采集后，应立即测量其除 去泡沫部分的体积，以3000rpm离心 10min，取上清液直接测定或冷冻保 存
5/31/2019
1.干扰杂质多 2.样品量少 3.要求较快提供结果。
5/31/2019
体内药物分析
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第三章 生物样品与样品制备 第一节 生物样品的种类采集
一、生物样品的种类、采集和制备
生 脏器组织 物
样 品
体液
血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、 精液、脑脊液、泪液、胆汁、
胃液、胰液、淋巴液、粪便等
血液(血浆、血清)—体现药物浓度和治疗作 用之间的关系(联接)
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选择溶剂应注意的问题：
溶 剂 的 选 择 与 纯 度 要 求
（1）了解药物与溶剂的化学结构及性质，根据相似相溶来 选择
（2）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶
（3）沸点低、易挥发和浓缩
（4）要与水不相溶 （5）无毒、不易燃 （6）不易乳化 （7）具有较高的化学稳定性和惰性
（8）不影响检测
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自动化SPE技术的优点和缺点
（1）节约时间
优 （2）平行操作带来了高的工作效率 点 （3）减少了操作误差，提高准确度和精确度
（4）安全性好
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三、样品的预处理技术
（一）经有机破坏的方法 1、湿法破坏 硝酸－高氯酸法 电热消化器法 电热板消化法 烘箱消化法 3、氧瓶燃烧法
2、干法破坏 高温电阻炉灰化法 低温等离子灰化法
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（二） 去除蛋白质
1、溶剂解法
常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）： 乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、 丙酮、四氢呋喃 体积比：1：1～3 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存
3、唾液：在4℃下保存，往往需要在取样时测定pH值
4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测
完，不能反复冷冻→解冻→冷冻(FTC)；样品应以小
体积分装存放。
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第二节 生物样品的预处理与制备
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一、预处理目的
（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度 （二）纯化、富集药物 （三）适应和满足测定方法要求的灵敏度
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碱性药物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等
酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵
提取溶剂：氯仿、二氯甲烷
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2、固相萃取( Solid phase extraction, SPE)
（1）原理 根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附 剂间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂
后，一些小分子药物被吸附，经适当洗涤除去杂质
1、硅胶填料→先用甲醇和水处理后上样
2、硅藻土/棉纤维→直接上样，不需清洗并可再生 3、样品萃取无浓集作用，萃取体积大，样品较干净
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萃取方法的选择
1 、亲脂性药物→ LLE、反相硅胶、大孔吸附树脂、亲 水性填料
2、碱性药物（亲脂性）→大孔吸附树脂
3、亲水性强可离解的药物→离子交换树脂 4、亲水性强不可离解的药物→沉淀蛋白后进样
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（2）SPE固相选择的原则－固定相与被测组分应具有 相似的极性，含有被测组分的样品应使用极性相反 的溶剂溶解后上柱，而用与被测组分相似极性的溶
剂洗脱
Ⅰ→亲脂性键合相硅胶（C18、反相硅胶）
Ⅱ→大孔吸附树脂（苯乙烯与二乙烯苯共聚物）
Ⅲ→离子交换树脂
Ⅳ→亲水型填料（硅藻土、正向硅胶）
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（3）SPE方法建立－以亲脂性键合硅胶为例
体积比：1：0.6
90％去除
方法：超速离心（10000r/min）
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其他去除蛋白的一些方法 1、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂
2、超滤法
3、酶水解法 4、加热法
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（三） 分离、纯化与浓集
1、液－液提取法（LLE）
2、固相萃取（SPE）
3、自动化SPE技术
4、固相微萃取（SPME）
5、膜萃取（ME）
当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品 4
肝素的加入： 1ml 血液 / 需要肝素 0.1 ～ 0.2mg ，通常不需 准确加入，在取血前可取少量肝素钠溶液（
1～2滴）置于试管内，旋转试管，使肝素溶
液均匀分布于试管壁上，干燥后加入血样后
立即轻轻振摇即可。
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全血：血液置于抗凝管中，不经离心操作，冷冻储存 或直接分析 需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度
如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制
血浆药物浓度很低凝影响测定
血样的特点：
缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦
优点：可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药 物监测
大多数测定的时原型药物总量
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(二) 尿液
1、尿药测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清 除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、 预测药物的代谢过程和代谢类型 2、尿的采集：非损伤性采样方式、药物浓度较高 、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影 响。 3、尿样的保存与处理：
头发洗涤
1、丙酮－水－丙酮
头 发 的 预 洗
2、丙酮预洗→洗洁精洗涤
3、洗衣粉浸泡
4、二氯甲烷 5、SDS洗涤 6、甲醇 都需要反复清 洗 2～ 3 次
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毛发样品的制备
1、直接甲醇提取 2、酸水解 3、碱水解 4、酶水解 5、超临界流体萃取
6、有机破坏
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二、生物样品的贮存与处理
（一）冷藏或冷冻 1、血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃， 长期-20℃
（四）防止对分析仪器的污染和劣化
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二、样品制备时应考虑的问题
（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围 （二）药物测定的目的 （三）生物样品种类和杂质干扰类型 （四）样品的化学组成 （五）药物的蛋白结合率 （六）被测组分在预处理过程中的稳定性 （七）样品在收集、储存等过程中容器的污染 （八）样品的预处理过程要求简便 （九）预处理的最后一步应富集被测组分 （十）对分析方法的要求
测定、可用于临床用药、滥用药物和毒性药物的
检测 缺点：样品的预处理繁琐、干扰多、药物的含量低 、需要精密仪器
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特点： 广谱性 积累性 稳定性 依时性 相关性 指纹性
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一般在枕部采取样本，国外一 般在靠近头皮处剪取，分别于 6～ 10 处取 10 个样本，从根部剪断， 超过12cm的均按照12cm处剪断
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（4） 各萃取方法之间的比较
SPE方法间的比较
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SPE方法的优点：
1、引入的杂质少
2、可以完全避免乳化的形成
3、有较高的萃取回收率，重现性好 4、小柱可弃，没有污染 5、需要的样品量少 6、洗脱溶剂多为水溶性的，易于实现自动化
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SPE的缺点：
1、价格昂贵 2、技术要求高
3、小柱各批之间有差异
3、优点：（1）非损伤性取样，（2）可用于药代动力学研究，（ 3）不受采血时间和地点限制，（4）样品易收集，病人易接受
4、应用：（1）在TDM中的应用 根据S/P分类，S/P＜1.0表示药物在唾液中的浓度很低； S/P＝1.0表示适合药物的监测；S/P不固定表示药物显著转移到 了唾液中；S/P很大表示药物的离子化程度很低 （2）药代动力学参数的测定
，再用少量溶剂洗脱，可达到分离、纯化目的。
决定因素：药物与固定相表面的活性基团、药物与溶
剂分子间的分子间作用力
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洗脱方式：
（1）药物与固定相的亲和力>杂质与固定相的 亲和力－先被保留后解吸
（2）药物与固定相的亲和力<杂质与固定相的
亲和力－直接洗脱
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可弃性柱、操作步骤少、使用溶剂少 、节省实验费用和时间
3、萃取介质中含有少量的甲醇可以提高萃取率
4 、萃取碱性药物时，常需在洗脱机中加酸、有机胺 、醋酸铵或离子对试剂
5、选用苯基和氰基柱时，需用极性溶剂如丙酮洗脱 6 、选用反相硅胶柱时，少量的甲醇和乙腈即可完成 洗脱
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Ⅱ：大孔吸附树脂
特点：具有较大的比表面积、吸附容量大、可反复 使用、价格便宜、最常用的是非极性、一般用乙 醇－水或甲醇－水即可解吸待测物质、加入适量 的无机盐有助于吸附 预处理：用乙醇浸泡除去杂质（或用酸碱泡），并 使其充分溶涨，在用水洗去有机溶剂后使用。 注意事项：树脂要保持湿润
6、微透析技术（MD）
7、超临界流体萃取（SFE）
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1、液－液提取法（LLE） 大多数药物都是脂溶性的，内源性物质 基本上都是水溶性的，当用有机溶剂萃取 时，药物被萃取出来而内源性物质被除去 ，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化 的目的。
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关键要考虑三个方面的因素：
（1）有机溶剂的特性 （2）有机溶剂相和水相的体积 （3）水相的pH值
2、有机相和水相的体积：一般为1:1～1:2 3、水相的pH值：碱性药物→pH>pKa+1～2 酸性药物→pH＜pKa+1～2
4 、提取次数：往往进行的是一次萃取，个别
情况下可以对分离出的含药有机相用一定的
pH水进行反萃取（Back extraction)
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优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离 缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，对极性大 的化合物的萃取效率低 总的流程图：
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(三)唾液
1、唾液的采集：漱口后15min进行，采集时间为10min，采用一些 物理或化学方法刺激唾液分泌；（1）缩短采样时间，（2）减 小唾液pH变化范围，（3）刺激后得到的唾液其唾液－血浆分布 比例的个体差异较小。
2、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清 液冻存或直接分析。
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Ⅲ：离子交换树脂
1、对弱酸性药物→在中性或碱性条件下用阴离子 交换法萃取→用水或甲醇清洗→酸性溶液洗脱 2、对碱性药物→在中性或酸性条件下用阳离子交 换法萃取→用水或甲醇清洗→碱性溶液洗脱 离子交换树脂适用于高极性和可电离性药物的纯
化
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Ⅳ：亲水性填料
原理：分配作用，水基质样品分布于填料表面为固定 相，流动相为与水不相混溶的有机溶剂，较为亲脂 的药物从固定相转移到流动相就完成了萃取 ，与 LLE雷同。 操作：上样到亲水性固定相表面 →用与水不相混溶的 有机溶剂洗脱目标化合物 →强亲水的蛋白质等保留 在固定相上。 注意事项：
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组
织
（1）匀浆化法：组织→加入水或缓冲液→匀浆→上清液 （2）沉淀蛋白法：组织→加入蛋白沉淀剂→上清液