多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因

一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定朱霞;李新伟;王好;吕文亮;周井祥【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)005【摘要】本实验对患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定,将表现典型锦锂疱疹病毒(KHV)病症状的鲤鱼肾细胞与单层框镜鲤鱼鳍细胞(KFC)共培养,5d～6d后出现典型的KHV细胞病变,即细胞体积增大并出现空泡化;在电镜下观察到典型的KHV病毒粒子;并应用PCR方法扩增获得KHV ORF25基因的849bp基因片段,连接至pMD18-T载体中,经酶切鉴定后序列分析表明,与GenBank登录的3株KHV同源性均为99.9%,命名为KHV-cj.基因进化比较显示,与KHV-J株关系较近.将病毒培养物(10-6.75TCID50)腹腔注射接种实验鱼可使其100%发病,并且症状和病理变化与自然感染KHV的鱼一致,死亡率为75%.表明本研究在国内首次分离到KHV.%A Koi herpesvirus (KHV) was isolated from carp suffering gill necrosis by co-cultivation of the affceted kidney cells with carp fin cells (CFC).Cytopathic effects (CPE) were presented 5 days to 6 days post co-cultivation.The KHV particles were observed under electron microscope by negatively stained the sediment of virus culture with 0.5％ phosphotungstate.A 849 bp DNA fragment of ORF25 gene was amplified by PCR and sequencing result indicated that the sequence of nucleotide acid homology was 99.9％ with the reference strains of KHV in GenBank.The some clinic signs as nature infection were presented in fish artificially infected with 10-6.75 TCID50 by intraperitoneal injection and the morbility and mortality were 100％ and75％,respectively.This result demonstrated that the KHV was isolated for the first time from the naturally infected fish in China.【总页数】4页(P340-343)【作者】朱霞;李新伟;王好;吕文亮;周井祥【作者单位】吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析 [J], 陈俊杰;李媛瑗;阳瑞雪;汪开毓;耿毅;黄小丽;陈德芳;欧阳萍2.锦鲤疱疹病毒天津株的分离与鉴定 [J], 罗璋;郝爽;张振国;孟一耕;史谢尧;冯守明3.锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定 [J], 李莹莹;王庆;曾伟伟;潘厚军;王英英;刘春;梁红茹;石存斌;吴淑勤4.东北红豆杉一株产三尖杉宁碱内生真菌Xylaria Primorskensis Y32的分离与鉴定 [J], 张智慧;郑文艺;崔海超;罗朝辉;袁肖寒;顾成波5.一株猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病株的分离与鉴定 [J], 芮雪;申贞彦;贺晓霜;张永红;宋勤叶;周双海因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因乌日琴;刘中勇;黄宝春【期刊名称】《检验检疫学刊》【年(卷),期】2005(015)002【摘要】[目的] 建立锦鲤疱疹病毒的PCR检测方法,并提高检测的准确率和简化操作程序.[方法] 分别利用蛋白酶K-酚/氯仿抽提、异硫氰酸胍(GuScN)抽提法从组织样品中提取KHV病毒DNA,并设计两对特异性引物进行PCR检测.[结果] 异硫氰酸胍抽提法可以有效地去除样品中的影响因素,而蛋白酶K-酚/氯仿抽提法提取的DNA中不能检测到病毒的DNA片段.同时评价了两对特异性引物,选择灵敏性高和操作简便的引物PQDS和PQDV作为快速检测的引物.[结论] 本实验初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法.【总页数】3页(P6-8)【作者】乌日琴;刘中勇;黄宝春【作者单位】广州白云机场出入境检验检疫局;广东出入境检验检疫局;广州白云机场出入境检验检疫局【正文语种】中文【中图分类】S9【相关文献】1.多重PCR方法快速检测牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型 [J], 李荔枝;张军;胡萍;周国君;王晓静;朱建荣2.快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的PCR方法学评价 [J], 陈宇明;胡婷婷;倪洁;王蓓;蒋晓飞;关明;徐峰;刘维薇3.快速检测肺炎链球菌recA、ply及16S rRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用 [J], 侯艳娇;罗欲承;邵晨;倪颖;邵世和4.多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;陈芳;张艺宜;刘芸莉;刘中勇;林志雄5.利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因 [J], 孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鲤疱疹病毒3型研究进展
张瑞雪;周井祥;王好;袁海延
【期刊名称】《科学养鱼》
【年(卷),期】2016(0)6
【摘要】鲤鱼是人类最廉价的优质蛋白获取源之一,提升鲤鱼产量可以在一定程度上解决全球粮食问题。

锦鲤色彩艳丽、身姿矫健,是观赏鱼中的佼佼者,备受世界宠物爱好者的喜爱。

锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease,KHVD）是会使鲤鱼、锦鲤及其变种大量死亡的疾病,大面积暴发该病时死亡率为80%~100%,因其较高的发病率和死亡率广受世界关注。

一、病原体锦鲤疱疹病毒（koi herpesvirus,KHV）又称为鲤科疱疹病毒3型（Cy HV-3）,是KHVD的致病源。

【总页数】3页(P54-56)
【作者】张瑞雪;周井祥;王好;袁海延
【作者单位】吉林农业大学,吉林长春130118;吉林农业大学,吉林长春130118;吉林农业大学,吉林长春130118;吉林农业大学,吉林长春130118
【正文语种】中文
【相关文献】
1.鲤疱疹病毒2型研究进展 [J], 袁锐;陈静;刘训猛;吴亚锋;王晶晶;方苹
2.鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析 [J], 孟少东;姜新宇;葛恒;胡光耀;杨大佐;张家林;李强
3.鲤疱疹病毒2型和3型三重PCR检测方法的建立与应用 [J], 彭军辉;安伟;张明辉
4.鲤疱疹病毒Ⅱ型检测技术的研究进展 [J], 郭宝琴;魏畅;李强
5.鲤疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型研究进展 [J], 罗丹;梁利国;谢骏;吴旭东
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广州华南生物工程有限公司
Guangzhou South China Bioengineering Co., Ltd
鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒（恒温荧光法）
鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒（恒温荧光法）是广州华南生物工程有限公司研发的一种高度灵敏的检测试剂，适用于检测水生生物中的鲤疱疹病毒。

该试剂盒采用了恒温荧光法技术，可以在短时间内快速准确地检测出病毒核酸，从而为鱼类疾病的早期诊断提供了强有力的支持。

鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒的主要特点是高灵敏度、高特异性、操作简便、快速准确。

其检测下限可达到100基因拷贝/μl，可以有效地检测出病毒核酸的存在。

同时，该试剂盒采用了恒温荧光法技术，避免了传统PCR方法中需要多次温度变化和时间较长的缺点，从而提高了检测效率。

此外，该试剂盒还具有高特异性，可以准确地检测出鲤疱疹病毒Ⅰ型，不会出现假阳性或交叉反应。

使用鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒进行检测时，需要准备样品、试剂盒、PCR仪、离心机等设备。

首先需要将样品进行处理，提取出其中的病毒核酸。

然后将核酸与试剂盒中的引物和探针进行反应，通过PCR扩增技术使病毒核酸得到大量复制。

最后通过荧光检测技术检测出是否存在鲤疱疹病毒Ⅰ型。

整个过程仅需数小时，大大缩短了检测时间。

总之，鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒（恒温荧光法）是一种高度灵敏、快速准确的检测试剂，适用于鱼类疾病的早期诊断和治疗。

它的出现为水生生物的健康和养殖业的可持续发展提供了有力保障。

如果在使用过程中遇到问题，请与广州华南生物工程有限公司技术人员联系。

一种鲤科疱疹病毒Ⅱ型的PCR快速检测方法薛中仪;朱春艳;王瑶;吴霆【摘要】鲤科疱疹病毒Ⅱ型是异育银鲫重大疫病病原,该病毒引发的异育银鲫鳃出血病(大红鳃病)能导致养殖生产巨大经济损失,为满足水产疫病预防与诊断需求,本文建立了一种集DNA快速提取与PCR快速扩增为一体的分子生物学检测方法,旨在为基层水产一线水生动物疫病预防与控制提供一种快速检测方法.【期刊名称】《水产养殖》【年(卷),期】2015(036)007【总页数】4页(P45-48)【关键词】异育银鲫;疱疹病毒;鳃出血病;PCR快速检测【作者】薛中仪;朱春艳;王瑶;吴霆【作者单位】宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800;宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800;宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800;宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800【正文语种】中文【中图分类】S943一种鲤科疱疹病毒II型的PCR快速检测方法薛中仪，朱春艳，王瑶，吴霆（宝应县水生动物疫病预防控制中心，江苏宝应225800）摘要：鲤科疱疹病毒Ⅱ型是异育银鲫重大疫病病原，该病毒引发的异育银鲫鳃出血病（大红鳃病）能导致养殖生产巨大经济损失，为满足水产疫病预防与诊断需求，本文建立了一种集DNA快速提取与PCR快速扩增为一体的分子生物学检测方法，旨在为基层水产一线水生动物疫病预防与控制提供一种快速检测方法。

关键词：异育银鲫；疱疹病毒；鳃出血病；PCR快速检测中图分类号：S943文献标志码：A文章编号：1004-2091（2015）07-0045-04doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2015.07.010资助项目：江苏省水产病害测报项目（2015）；国家大宗淡水鱼产业技术体系建设（CARS-46-31）作者简介：薛中仪（1987-），女，助理工程师，在读在职研究生，研究方向：水产养殖与病害防控. E-mail：***************，通信作者：吴霆（1975-），男，高级工程师. E-mail：****************1 前言鲤科疱疹病毒II型（CyHV-2）是水生动物疫病的重要病原，传统宿主是金鱼，Jung等[1]于1995年首次报道了CyHV-2，该病毒引起的病害给日本金鱼养殖业造成了巨大的经济损失，根据其病理学特征而被命名为疱疹病毒性造血器官坏死病毒。

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)004【摘要】为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因PCR检测方法,本实验将KHV接种鲤鱼鳍条细胞,收获病变细胞悬液,提取DNA,根据GenBank中登录的KHV基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7),设计合成3对特异性引物,针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和ORF7基因进行PCR检测.通过优化后的反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测.结果表明:3对引物能够分别特异性扩增出409bp、292 bp和484bp片段;敏感性试验表明对TK基因检测的敏感性高于Sph和ORF7基因,其最低检测量为1.9×106copies/μL;采用优化的3个PCR方法对8个有临床症状的样品进行检测,其中3份样品的3个基因PCR扩增结果均为阳性.因此,本研究选取的3个基因均可用于KHV的检测及确证实验.%To exploratory the feasibility of multiple gene detection of koi herpesvirus (KHV) by PCR, the PCR detections were conducted to amplify the TK and Sph genes of KHV to comparing with the amplification of ORF7 which was recommended by inspection and quarantine standard for KHV detection. The three genes were amplified with the spcefic primers and the the template DNA of virus extracted from the KHV infected KF cells. The results showed that the fragments of 409 bp (TK), 292 bp (Sph), and 484 bp (ORF7) could be specifically amplified with a detection limit at 1.9×l06 copies/μLof KHV. It was evident that the all of these gene could be used to detection of KHV.【总页数】4页(P316-318,330)【作者】孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连116001;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.利用多重PCR方法检测7种转基因卡诺拉油菜籽品种(系)研究 [J], 张耀川;许亮;张洁;田锦;李玉舒;石进朝2.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;刘中勇;黄宝春3.多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;陈芳;张艺宜;刘芸莉;刘中勇;林志雄4.利用PCR方法检测转基因大豆加工食品中的修饰基因 [J], 邓鸿铃5.PCR方法检测食品中致病菌常用的靶基因及其引物 [J], 段莹;陶景玉;卢行安;陈明生;崔秀云因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用摘要：本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA，利用针对锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，经反应体系优化，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过对荧光信号的实时监测实现对KHV的定量检测。

整个过程快速、简捷，操作简单，可对KHV进行快速有效的诊断，具有一定的应用价值。

关键词：锦鲤疱疹病毒；荧光定量PCR；TaqMan；一步法中图分类号：S941.41+9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）07-0125-04锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）引起的一种传染性疾病。

KHV能够感染锦鲤、鲤鱼和剃刀鱼，其鱼苗、幼鱼、成鱼均可感染。

锦鲤疱疹病毒病多发于春、秋季，潜伏期两周左右，鱼发病并出现症状24～48 h后开始死亡，2～4 d内死亡率可迅速达到80%～100%[1，2]。

此病首先在以色列暴发，接着美国、欧洲（如英国、德国、比利时）及亚洲一些国家均有此病发生，给锦鲤和鲤鱼养殖业造成重大经济损失[3，4]。

锦鲤疱疹病毒颗粒呈球状，有囊膜，直径约170～230 nm，其核衣壳为对称十面体，直径为100～110 nm，该病毒由31种病毒多肽组成，遗传物质为双链DNA，基因组大小约为277 kb[5，6]。

目前锦鲤疱疹病毒病的检测方法有电镜检测、ELISA、普通PCR和荧光定量PCR等[7]。

TaqMan荧光定量PCR是在PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一种特异性荧光探针，该探针为一段寡聚核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步[8～11]。

鲤疱疹病毒3型ORF136基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定郑树城;李莹莹;王庆;曾伟伟;王英英;任燕;石存斌【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2018(025)001【摘要】为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31~157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体, 运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定.结果表明, 重组融合表达蛋白大小与预期一致, 约为35 kD, 且主要分布在包涵体中.Western blot分析显示, 免疫兔后获得的纯化ORF136多克隆抗体能特异性识别纯化的CyHV-3和感染CyHV-3的KS细胞; 间接免疫荧光分析进一步表明ORF136多抗能识别感染CyHV-3的KS细胞.ORF136多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV-3血清学诊断方法的建立提供了重要基础.%Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3), also known as koi herpesvirus (KHV), is the etiologic agent of koi herpesvirusdisease(KHVD)causing morbidity and mortality in common carp and koi Cyprinus car-pio L.populations around the world.Recently,knowledge about diagnosis and detection based on nucleic acid has been reported, but validation of serological techniques for virus infection is limited due to lack of effective anti-bodies. Additionally, fundamental research on thefunction of structural proteins from CyHV-3 is necessary to understand the relationship between host and virus. ORF136 is one of the predicted envelope proteins incorporated into mature virions. To study the function of proteins encoded by the ORF136 gene of CyHV-3 and to establish serological methods for detection of CyHV-3, the predicted antigenic determinant based on amino acid sequences of proteins encoded by ORF136 was amplified using PCR. Then, the recombinant prokaryotic expression vector was constructed by connecting the cloned fragment to prokaryotic expression vector pET-32a (+), used for trans-formation of E.coli Rosetta (DE3) and protein expressions induced by IPTG. New Zealand white rabbits were immunized with the recombinant proteins of pET-32a-ORF136 four times. Furthermore, the antiserums were col-lected and affinity purification was used to obtain polyclonal antibody after 66 days. Characterization of the poly-clonal antibody against the ORF136 protein was further analyzed using western blot and indirect immunofluores-cence assays. The expected product size of 381 bp was obtained and the recombinant prokaryotic expression vec-tor pET-32a-ORF136 was confirmed to be constructed as expected using enzyme digestion. As SDS-PAGE analy-sis indicated that the molecular weight of recombinant protein pET-32a-ORF136 was consistent with the expected size (about 35 kD) and was distributed in the inclusions. Western blot analysis further showed that the purified polyclonal antibody could specifically recognize purified CyHV-3 virions and KS cells infected with CyHV-3. Moreover, immunofluorescence staining showed that specifically green fluorescencewas present in the cytoplasm of KS cells infected with CyHV-3, but not in the negative control, further suggesting that CyHV-3 was recognized by the polyclonal antibody. The purified recombinant proteins and effective antibodies are necessary to develop serological methods to detect antigens, except nucleic acid detection method. The purified recombinant proteins could be used as antigens to capture antibodies against CyHV-3 from common carp or koi exposed to KHVD. Similarly, development of a double antibody sandwich ELISA for detection of CyHV-3 also requires an effective polyclonal antibody to capture antigens released from the host. Antibodies produced by recombinant proteins from rabbit or mouse provides the foundation for functional research into structural and nonstructural proteins. In this study, the polyclonal antibody against the ORF136 protein was prepared and analyzed using immunoblotting and immunofluorescence techniques, which provides an essential and valid tool for further research into CyHV-3.【总页数】7页(P204-210)【作者】郑树城;李莹莹;王庆;曾伟伟;王英英;任燕;石存斌【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380【正文语种】中文【中图分类】S941【相关文献】1.家蝇u93基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 马素贞;王涛;龙慧玲;国果;杨阳;常振策;王兵;吴建伟2.鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的多克隆抗体制备与免疫原性分析 [J], 周勇;史玉恒;范玉顶;刘文枝;江南;赵建青;许晨;曾令兵3.Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的多克隆抗体制备及鉴定 [J], 余琳;吕利群;王浩4.家蝇 u93 基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 马素贞; 王涛; 龙慧玲; 国果; 杨阳; 常振策; 王兵; 吴建伟5.Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF6多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 南星羽;冯梓钊;费越越;余路;罗扬;许丹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。