锦鲤疱疹病毒―CJ株ORF108基因的克隆及生物信息学分析

锦鲤疱疹病毒病的研究进展作者：吕大成来源：《吉林农业》2011年第09期我国是水产养殖大国，近30年来水产业发展尤为迅速，目前水产养殖产量已经超过捕捞产量，约占养殖业的70%以上。

但是，随着水产养殖业的迅速发展，一些水产疾病的爆发也越来越频繁。

据统计，至2002年全国水产病害达到185种，直接造成经济损失141亿元。

目前，水生动物疾病种类繁多，且发病时间延长、传播速度快，危害程度大，发病后死亡率高。

更严重的是已经有所控制的严重疾病有返强趋势，近年来，在吉林、辽宁等地区的网箱养殖发展迅速。

随着淡水养殖业的迅速发展，各种疾病造成的损失也迅速上升。

尤其是近年来发生的锦鲤疱疹病毒病，给鲤鱼养殖业带来了巨大的经济损失。

2007年，我国质检总局要求停止从日本和印尼进口锦鲤和鲤鱼，将锦鲤疱疹病毒作为必检项目。

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（KHV）引起的锦鲤、鲤鱼及其普通变种发生鳃坏死和间质性肾炎的一种高致病性和高死亡率的疾病。

该病多发生在水温为18℃～28℃的春秋季节，但目前有低温下发病的趋势。

该病具有高度传染性，发病率和死亡率均高达80%～100%。

在锦鲤和鲤鱼的国际贸易中，由于缺乏相关的检疫制度，促使了该病在世界范围内暴发性流行，给锦鲤和鲤鱼养殖业带来了破坏性影响。

1.国内外流行现状自从锦鲤疱疹病毒病暴发以来，各个国家和地区几乎每年都发生。

2003年以来，我国东北地区的框镜鲤和普通鲤鱼发生暴发性疾病，死亡率高达80~90%，经PCR检测为KHV阳性；近两年来，KHV检测也均为阳性。

另外，有报道，近年来在菲律宾非法进入的锦鲤中检测到KHV。

2008年，中国台湾地区检测KHV阳性率为7%；据2010年鱼病统计结果显示，泰国也有KHV的发生。

锦鲤疱疹病毒病的全球性暴发，给锦鲤观赏业、鲤鱼养殖业以及国际贸易等造成了极大的经济损失，并引起了各国的高度重视，因此，各国家和地区应加强合作，严格控制KHV的发生与流行。

中国水产科学 2020年4月, 27(4): 454-462 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2019-07-29; 修订日期: 2019-10-05.基金项目: 国家自然科学基金项目(31402347); 广东省科技计划项目(2016A020210029); 广东省海洋与渔业厅海港建设和渔业产业发展专项(A201701C04); 广州市科技计划项目(201707010216); 广东省自然科学基金项目(2018A030310193).作者简介: 吴静(1993–), 女, 硕士研究生, 研究方向动物解剖与组织胚胎学. E-mail: 20172027028@ 通信作者: 刘振兴, 副研究员, E-mail: liuzhenxing@; 李玉谷, 教授, E-mail: liyugu@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2020.19212鲤疱疹病毒3型ORF148 DNA 疫苗对建鲤鱼苗的免疫保护吴静1, 2, 刘振兴2, 马艳平2, 梁志凌2, 马江耀2, 郝乐2, 柯浩2, 冯国清2, 李玉谷11. 华南农业大学兽医学院, 广东 广州 510642;2. 广东省农业科学院动物卫生研究所, 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室, 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站, 广东 广州 510640摘要: 鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV), 是一种高传染性、致死性病毒。

为开发新型CyHV-3 DNA 疫苗, 前期研究中将CyHV-3 ORF148基因插入pEGFP-N1构建重组质粒, 在此基础上, 本研究通过转染试验、间接免疫荧光试验证实pORF148-EGFP 融合蛋白可以在CCB-J 细胞系和建鲤体内表达; 将重组质粒作为DNA 疫苗, 肌肉注射免疫建鲤鱼苗, ELISA 检测表明免疫pEGFP-ORF148重组质粒可以显著提高建鲤血清特异性抗体水平; RT-qPCR 检测显示, 免疫pEGFP-ORF148重组质粒后, 建鲤脾脏和头肾中的免疫相关基因如IFN-a1、Mx-1、CXCa 、CXCR1、TNF -α、IL-1β及IgM 基因表达量均显著提高。

2018.4在的技术手段是可以定性、定量检测的，无论是养殖水体、底泥等环境中的病原，还是养殖动物组织中的病原。

我们需要定量监测，因为病原生物也是健康生态系统的一部分，简单定性发现了病原而据此判断其就是致病病原是不科学的，防治过程中也不能一味抱着将病原生物杀灭干净、以营造无病原的养殖环境，这不仅不现实，且这种无病原的养殖生境未必是健康的。

绒螯蟹肝胞虫早在2007年就被王文老师发现并鉴定，但河蟹养殖直到2015年才出现了“水瘪子”的暴发，且绒螯蟹肝胞虫在入侵英国的河蟹中也被检出，但迄今未报道“水瘪子”，这也能部分说明绒螯蟹微孢子虫的感染并不是“水瘪子”发生的元凶。

当然，本文发现的绒螯蟹肝胞虫与河蟹“水瘪子”不相关，离“水瘪子”的防控还有很大的距离，仅仅为“水瘪子”再次出现时的防控对策研究时排除了一个可能而已。

鲤鱼是品种最多、分布最广、养殖历史最悠久、年产量最高的淡水养殖鱼类之一，具有极高的经济价值。

由于锦鲤的进出口及鲤鱼的国际贸易，目前锦鲤疱疹病毒病已在世界范围内传播，严重威胁鲤和锦鲤产业发展。

我国养鲤业同样深受该病困扰。

本文对锦鲤疱疹病毒的病原、流行病学、发病机制、诊断方法及防治措施进行整理，以期为有效鉴定锦鲤疱疹病毒病并及时控制治疗提供一定的指导方法。

一、锦鲤疱疹病毒(KHV)简要介绍1.病原学锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvi-rus disease，KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Koi her-pesvirus ，KHV，又称鲤疱疹病毒3型CyHV-3)引起的一种恶性传染病，死亡率高达80%～100%。

KHV 为线形双股DNA 病毒，分子量大小为295kb，有囊膜，与其同科的斑点叉尾 病毒(CCV)、鲤鱼痘疱疹病毒(CHV)之间有免疫交叉反应。

已经确定了来自不同地理位置的四种CyHV-3毒株的完整DNA 序列：以色列(CyHV-3I)、日本(CyHV-3J)、美国(CyHV-3U)和中国(CyHV-3GZ11)四种基因型。

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF124基因的克隆及生物信息学分析周井祥;王好;吕文亮;李新伟【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2013(047)005【摘要】为研究我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息,从锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ株)获得ORF124基因,应用生物信息学方法分析KHV-CJ株ORF124基因结构和功能,并与Genbank上已公布的三株KHV进行比较分析.结果显示,ORF124基因的理论分子质量为31221.96 Da,KHV-CJ株与其他三株KHV同源性均为99％；信号肽切割部位最可能位于24位的T(苏氨酸)和25位的V(缬氨酸)氨基酸之间；ORF124基因无跨膜区；氨基酸序列不存在潜在的N-糖基化位点、11个潜在的O-糖基化位点和7个磷酸化位点.该蛋白的表面抗原决定簇位点区域广泛、峰值高,预示该基因可作为基因工程疫苗的重要候选基因.【总页数】5页(P14-18)【作者】周井祥;王好;吕文亮;李新伟【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,长春130118;吉林农业大学动物科技学院,长春130118;吉林农业大学动物科技学院,长春130118;吉林农业大学动物科技学院,长春130118【正文语种】中文【中图分类】S852.659.1【相关文献】1.锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF108基因的克隆及生物信息学分析 [J], 王好;于丹;刘丽凡;王友超;周井祥2.锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF126基因的原核表达及免疫试验研究 [J], 王好;王秋举;刘艳辉;张雅斌;吕文亮;周井祥3.锦鲤疱疹病毒CJ株ORF25基因的克隆及生物信息学分析 [J], 周井祥;李新伟;朱霞;王好;吕文亮4.锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息学分析 [J], 周井祥;李新伟;王好;吕文亮;朱霞5.锦鲤疱疹病毒CJ株ORF27基因克隆及生物信息学分析 [J], 王友超;周井祥;王好;邢程因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)004【摘要】为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因PCR检测方法,本实验将KHV接种鲤鱼鳍条细胞,收获病变细胞悬液,提取DNA,根据GenBank中登录的KHV基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7),设计合成3对特异性引物,针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和ORF7基因进行PCR检测.通过优化后的反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测.结果表明:3对引物能够分别特异性扩增出409bp、292 bp和484bp片段;敏感性试验表明对TK基因检测的敏感性高于Sph和ORF7基因,其最低检测量为1.9×106copies/μL;采用优化的3个PCR方法对8个有临床症状的样品进行检测,其中3份样品的3个基因PCR扩增结果均为阳性.因此,本研究选取的3个基因均可用于KHV的检测及确证实验.%To exploratory the feasibility of multiple gene detection of koi herpesvirus (KHV) by PCR, the PCR detections were conducted to amplify the TK and Sph genes of KHV to comparing with the amplification of ORF7 which was recommended by inspection and quarantine standard for KHV detection. The three genes were amplified with the spcefic primers and the the template DNA of virus extracted from the KHV infected KF cells. The results showed that the fragments of 409 bp (TK), 292 bp (Sph), and 484 bp (ORF7) could be specifically amplified with a detection limit at 1.9×l06 copies/μLof KHV. It was evident that the all of these gene could be used to detection of KHV.【总页数】4页(P316-318,330)【作者】孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连116001;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.利用多重PCR方法检测7种转基因卡诺拉油菜籽品种(系)研究 [J], 张耀川;许亮;张洁;田锦;李玉舒;石进朝2.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;刘中勇;黄宝春3.多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;陈芳;张艺宜;刘芸莉;刘中勇;林志雄4.利用PCR方法检测转基因大豆加工食品中的修饰基因 [J], 邓鸿铃5.PCR方法检测食品中致病菌常用的靶基因及其引物 [J], 段莹;陶景玉;卢行安;陈明生;崔秀云因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鱼类疱疹病毒概述
鱼类疱疹病毒病通常指由疱疹病毒快速增值从而引发细胞病变致使鱼类患病。

依据基因组分析，鱼类疱疹病毒隶属异疱疹病毒科，主要有鲤疱疹病毒属、鮰鱼疱疹病毒属、鲑鱼疱疹病毒属和一些暂未分类的疱疹病毒。

在温水性养殖鱼类中，淡水养殖鱼类常见的疱疹病毒病主要有3种，为鲤痘疮病、鲫造血器官坏死症、锦鲤疱疹病毒病。

危害对象是鲤鱼和鲫鱼。

鱼类疱疹病毒病最早发现于1998年的以色列，后在印尼、日本均爆发该病，造成近千吨锦鲤和鲤鱼的死亡；在2004年的一项回顾性研究中发现来源于英国的1996年样品呈锦鲤疱疹病毒阳性，说明锦鲤疱疹病毒的感染早于1998年；2003年首次报道中国某养殖场内进口的锦鲤有锦鲤疱疹病毒的感染；2004年首次在国内海南某养殖的锦鲤中检测到锦鲤疱疹病毒。

截止2023年，锦鲤疱疹病毒病已经遍布欧洲、亚洲、美洲和非洲，超过30个国家或地区爆发KHVD，包括以色列、英国、德国、美国、南非、日本、澳大利亚、韩国、马来西亚、新加坡以及印尼等。

疱疹病毒病发病主要存在两个发病阶段，一是春夏交接期，雨水多、长期低温的时候发病比较重。

水温渐渐升高到28℃的时候，鱼病可逐渐缓解或者自行痊愈。

二是夏秋转换期，水温逐步下降时发病率高。

该病传染性很强，往往一个地区发病，整个区域难于幸免，呈现出快速蔓延的趋势和流行特点。

这与疱疹病毒的生理特性相关。

锦鲤疱疹病毒病免疫学检测方法——单克隆抗体技术研究进展于慧;袁海延;金晔;黄冬冬【期刊名称】《科学养鱼》【年(卷),期】2016(000)003【总页数】2页(P54-55)【作者】于慧;袁海延;金晔;黄冬冬【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118【正文语种】中文锦鲤疱疹病毒病（KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（KHV）引起的一种非常严重的、法定的传染病。

它通过锦鲤、鲤鱼的贸易传播。

该病死亡率高达80%～100%。

被感染的鱼常见的临床症状为有白色斑，眼凹陷，脾脏和肾脏肿大，鳃部坏死。

CyHV-3在温度15～25℃易感染，可从死鱼的肾、鳃、脾、小肠、肝脏和大脑中分离，其基因组包含约29.5万个碱基对（kb），编码156个开放性阅读框。

目前还没有有效的药物和疫苗可以抑制锦鲤疱疹病毒的感染。

因此控制该病原的流行主要依靠检验、检疫和隔离等手段。

现在针对KHV检测方法的研究主要包括分子生物学技术和细胞培养法。

细胞培养法检测流程至少需要2周，敏感细胞系繁殖难度大、灵敏度低；分子生物学方法除OIE列举的PCR方法外，还先后建立了4种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的检测方法，我国的科研工作者也建立了两种荧光定量PCR检测方法。

不过分子生物学方法只能检测病毒核酸，不能直接检测活病毒，且容易产生DNA污染，导致检测结果呈假阳性。

免疫学技术作为一种可以检测到活病毒的技术，弥补了以上方法的不足。

该技术的研究需要以抗原和抗体为基础。

对于CyHV-3，目前已经有几项研究利用免疫化学技术的抗体对抗原亲和力。

在2005年Adkinson Oren和Hendrick成功用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测CyHV-3，在最近的一项研究中，CyHV-3的多克隆抗体被用于检测目的病毒，研究表明该技术可能比其他传统PCR方法更敏感。