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第五章灭菌第五章灭菌污染杂菌的危害1.消耗营养物质。
2.抑制发酵菌⽣长。
3.改变培养液理化性质。
4.抑制产物⽣物合成。
5.噬菌体污染。
第⼀节灭菌的基本原理⼀、灭菌定义指⽤化学的或物理学的⽅法杀灭或除掉物料或设备中所有的有⽣命的有机体的技术或⼯艺过程。
⼆、常⽤灭菌⽅法1.化学物质灭菌利⽤化学试剂（甲醛、苯酚、⾼锰酸钾等）与微⽣物细胞中某种化学成分反应，如使蛋⽩质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性等杀灭微⽣物。
应⽤：实验室和⽆菌室的空间灭菌，设备、器械、双⼿的消毒灭菌，但不能⽤于培养基的灭菌。
2.辐射灭菌原理：利⽤⾼能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微⽣物常⽤：紫外线、X 射线和γ射线紫外线：诱导了胸腺嘧啶⼆聚体的形成和DNA 链的交联，从⽽抑制了DNA 的复制，导致菌体死亡。
波长为260nm 的杀菌⼒最强穿透⼒差。
应⽤：适于表⾯灭菌。
⽆菌室、接种箱3.⼲热灭菌在⼲燥⾼温条件下，微⽣物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，是微⽣物的致死率迅速增⾼的过程。
常⽤⽅法：灼烧和电热箱加热，160℃ 2⼩时发酵的流程空⽓空⽓净化处理保藏菌种斜⾯活化扩⼤培养主发酵碳源、氮源、⽆机盐等营养物质灭菌成品使⽤范围：需要保持⼲燥的器械、容器的灭菌。
玻璃及⾦属⽤具及沙⼟管灭菌4.过滤除菌原理：利⽤微⽣物不能透过滤膜⽽达到除菌⽬的。
⽅法: 0.01~0.45 m孔径滤膜，使⽤范围：⽤于压缩空⽓、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。
5.湿热灭菌由于蒸汽具有很强的穿透⼒，冷凝时可释放出⼤量潜热，且在⾼温有⽔分条件下，蛋⽩质易变性，使微⽣物死亡。
常⽤⽅法：⽔煮常压灭菌：100℃，40-60min⾼压蒸汽灭菌：⼀般121℃，30分钟使⽤范围：培养基和发酵设备灭菌。
湿热灭菌的优点：蒸汽有强的穿透⼒，灭菌易于彻底；蒸汽来源容易，操作费⽤低，本⾝⽆毒；操作⽅便，易管理。
三、湿热灭菌的理论基础1.灭菌指标的确定⼤多数微⽣物最适温度为25~27℃,维持温度为5~50℃，当温度超过最⾼限温时微⽣物就会发⽣死亡。
培养基灭菌与空气净化培训一、引言在微生物实验室和生物制药等领域中，保持培养基的无菌状态以及空气质量的洁净是非常重要的。
为了确保实验结果的准确性和产品的质量，培养基灭菌和空气净化是必不可少的环节。
本文档旨在为实验室和生物制药相关人员提供培养基灭菌与空气净化的培训内容，包括培养基灭菌方法、灭菌设备的选择与操作、空气净化的原理与方法等。
通过培训，希望能够提高各位实验人员对培养基灭菌与空气净化的认识和技能，提升实验室和生产环境的无菌水平。
二、培养基灭菌方法培养基灭菌是指通过外部手段将培养基中的微生物杀灭，防止其污染实验结果。
常用的培养基灭菌方法包括物理灭菌和化学灭菌两种。
2.1 物理灭菌物理灭菌是通过提高温度、压力或辐射等手段来杀灭微生物。
常见的物理灭菌方法有：1.高温灭菌：将装有培养基的容器放入高压高温灭菌器中，在高温高压条件下进行灭菌，常用的温度和时间为121℃/15分钟。
要注意灭菌器的压力和温度控制，以确保达到有效的灭菌效果。
2.剂量灭菌：利用辐射源如紫外线、X射线或γ射线等，照射培养基以达到杀灭微生物的目的。
剂量灭菌需要严格控制辐射剂量，以免对培养基中的营养成分产生不良影响。
2.2 化学灭菌化学灭菌是通过加入能够杀灭微生物的化学物质来实现培养基的灭菌。
常用的化学灭菌方法包括：1.干热灭菌：将装有培养基的容器放入干热灭菌器中，在高温、低湿的条件下进行灭菌。
干热灭菌的温度和时间根据具体需求和培养基成分而定。
2.过滤灭菌：通过将培养基用0.22μm孔径的微孔膜过滤，阻挡微生物进入，达到灭菌的目的。
过滤灭菌适用于无法承受高温或辐射的特殊培养基。
三、灭菌设备的选择与操作选择合适的灭菌设备以及正确的操作方法是保障培养基灭菌效果的关键。
根据需要和实验条件，常见的灭菌设备有高压高温灭菌器、干热灭菌器和紫外线灭菌器等。
3.1 高压高温灭菌器高压高温灭菌器是常用的物理灭菌设备，适用于大部分常规培养基的灭菌。
在使用高压高温灭菌器时，应注意以下操作要点：1.根据培养基的特点和厚度合理选择灭菌温度和时间，避免对培养基造成损害。
09116发酵工程教学大纲《发酵工程》课程（09116）教学大纲一、课程基本信息课程中文名称：发酵工程课程代码：09116学分与学时：4学分，76学时（理论课2.5学分，52学时；实验课1.5学分，24学时）课程性质：专业必修授课对象：生物工程二、课程教学目标与任务《发酵工程》是生物工程专业的一门专业必修课，发酵工程是生物技术的基础和重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节，是工业生物技术的核心。
发酵工程是利用微生物的特定性状和技能，通过现代化工程技术，生产有用物质或直接应用于工业化生产的一种技术体系。
通过本课程的学习，使学时掌握微生物产品生产的基本理论，能进行发酵的工艺设计和解决产品生产过程中出现的主要问题，并为从事生物新产品和工艺的研究与开发打好应用的理论基础。
三、学时分配课程内容与学时分配表四、课程教学内容与基本要求发酵过程一般包括培养基制备、无菌空气供应、菌种及种子扩大培养、发酵过程及控制、发酵产品下游加工过程和发酵过程废弃物处理等几大部分。
基于《生物工程设备》、《发酵工程》、《生物分离工程》三个组成部分集体分工和侧重点不同，《发酵工程》部分着重阐明、并要求学生熟练掌握培养基制备、无菌空气工艺、菌种及种子扩大培养、发酵过程及控制、染菌和防治等几个单元操作的基本原理和方法，对于其它部分将在后续的课程中深入讲解。
发酵过程是一门综合性很强的课程，涉及到化工原理、生物化学、微生物学、物理化学等多个学科，基础理论性和实践性均很强，要求基础理论和生产实践密切结合。
因此，该课程需啊哟在理论教学的同时，配合生产见习和实验的实践环节，要求学生建立实际生产的概念，在参观实习和实验实践中巩固本课程的教学效果，培养分析问题和解决问题的能力。
学生通过该课程的学习将会缩短理论与生产实践的距离，建立用理论知识分析和解决生产实际问题的概念和能力，动手能力也将有所提高。
第一章发酵工程概论教学目的：从总体上让学生对发酵工程有个整体的认识。
第一章发酵工程概述复习思考题1.发酵的传统概念与现代意义上的概念是指什么？2.发酵工程的概念是什么？3.试述微生物工业发酵的基本过程4.发酵工程与传统酿造化学工程相比有什么特点？5.试述微生物发酵技术发展历史过程中的特点。
6.分析发酵工程的一般特征，同时存在哪些不足？7.发酵工业中使用的发酵罐有什么特征？8.什么是气升式发酵罐，有什么优点？9.发酵过程的优化概念，目的，内容分别是什么？10.工业发酵常见的发酵方式有哪些？其中主流发酵方式是什么？为什么？11.什么是分批发酵和补料分批发酵？分析两种发酵方式各有什么优缺点？12.连续发酵的特点及不足有哪些?13.什么是固态发酵和混合发酵？14.什么是发酵工程的后处理？发酵工程后处理技术有什么要求？发酵液的特点？15.下游工程中的目的产物有什么特点？16.用图表示发酵工程下游技术的过程。
第二章微生物菌种选育复习思考题1.工业化菌种的要求有哪些？2.自然界分离微生物的一般操作步骤有哪些？3.从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集？4.菌种选育分子改造的目的是什么？5.什么叫自然选育?自然选育在工艺生产中的意义是什么？6.什么是正突变？什么是负突变？什么是结构类似物？7.什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？8.什么是种子的扩大培养？9.种子扩大培养的目的与要求有哪些？10.种子扩大培养的一般步骤有哪些？11.在大规模发酵的种子制备过程中，实验室阶段和生产车间阶段在培养基和培养物选择上各有何特点？12.菌种复壮的方法或措施有哪些？13.如何防止菌种衰退？第三章发酵机制及发酵动力学复习思考题1.名词解释能荷、糖酵解、TCA循环、HMP途径、甘油发酵、初级代谢、次级代谢、反馈抑制、阻遏、同工酶、协同反馈抑制、营养缺陷型、抗性突变株、分解代谢阻遏、代谢控制发酵2.比较糖厌氧发酵和糖好氧甘油发酵的机制3.简述微生物柠檬酸发酵机制4.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。
第5章培养基灭菌和空气除菌教研室：生物工程教师姓名：余有贵教学过程一、灭菌的意义和方法1、灭菌的意义采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施,称为灭菌，例如各种高温灭菌措施等.保证纯种发酵，防止杂菌和噬菌体污染。
消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。
2、灭菌的方法（1）火焰灭菌：接种时使用, 灼烧是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌(2)干热灭菌法：适于灭菌后要求保持干燥状态的物料，将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150～170℃下维持1～2小时后，即可达到彻底灭菌的目的.在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥,以及各种细胞成分发生氧化。
（3）湿热灭菌法：多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5~10min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。
工业生产上广泛使用，常用120℃,20—30min.（4)射线灭菌法：适于表面灭菌,紫外线波长在2600埃左右灭菌效力最强,一般用30瓦紫外灯照射20—30min（5）化学药剂灭菌：1）0.1％—0。
25%的高锰酸钾溶液:皮肤消毒2）2%-5%漂白粉：用具和车间环境的灭菌3)70%-75％酒精溶液:皮肤和玻璃器皿表面灭菌4)0。
25%新洁尔灭: 皮肤、小器皿表面和车间的灭菌5)0。
5%甲醛：用于无菌室、空罐和车间空间的灭菌，10ml/m3，6-12h(6)高压静电灭菌:应用于空气的灭菌（7）介质过滤除菌：滤除血清和抗生素溶液内的微生物和空气过滤除菌。
二、培养基和设备的湿热灭菌1、湿热灭菌的原理1。
1概念致死温度：杀死微生物的极限温度。
致死时间：在致死温度下,杀死全部微生物所需要的时间。
热阻：微生物在某一特定的条件下的致死时间性，表示微生物对热的抵抗力.1.2原理湿热灭菌的基本原理：湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。
蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。
用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求是：既要达到一定的灭菌程度,又要尽量减少营养成分的破坏。
1。
3微生物的热死规律--—-对数残留定律对数残留定律:微生物的死亡速率d N/dθ与任何一瞬间残存的活菌数成正比，即d N/dτ=KN式中：N-—--活菌数（个／ml）τ——--受热时间（S)k-——-比死亡速率（S—1）,与微生物种类和加热时间有关在恒温下，当τ=0，N=N0时，可得：理论灭菌时间τ =(2.303/k）log（No/Ns）τ—- —灭菌时间（秒)k—--比死亡速率,与菌的种类和加热温度有关（s－１）No--—灭菌开始时，污染的培养基中杂菌个数（个／ml)Ns---经过灭菌时间τ后，残存活菌个数（个／ml）1）杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性,这种反应属与单分子反应，因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循单分子反应方程。
2）从上式可知：要做到绝对无菌，即N=0，则时间τ将无限大。
故在实际计算中取N=10-3，即每处理1000批中只残留一个活菌数，该值在工程上已足够了。
1.4 灭菌温度与菌死亡反应速度常数的关系k=Ae-⊿E/RT式中：K——菌死亡的速度常数（s－１）,当反应物的浓度为单位浓度时，则反应速度常数在数值上等于反应速度△E—活化能，J/molA—-阿累尼乌斯常数（s－１）R——气体常数（8。
314J／mol.K）T——绝对温度（K）1.5培养基成分受热破坏规律（看作一级反应）—d c/d t=k d c式中：C为对热敏性物质的浓度；k d为分解速率常数（s－１），1。
6高温快速灭菌法优于低温长时间灭菌法:当灭菌温度升高时，菌的比死亡速率增加较培养基成分分解速率常数快，因而在较高的温度下可以缩短灭菌时间而保留较多的营养物质。
2、影响培养基灭菌的因素（1）培养基中的颗粒与物理状态培养基中的颗粒物质大，灭菌困难,反之，灭菌容易。
一般说来,含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时,会影响灭菌效果，必须过滤除去.培养基的物理状态对灭菌具有极大的影响,固体培养基的灭落时间要比液体培养基的灭菌时间长，假如lOO℃时液体培养基的灭菌时间为1h，而固体培养基则需要2～3h才能达到同样的灭菌效果。
其原因在于液体培养基灭菌时，热的传递除了传导作用外还有对流作用,而固体培养基则只有传导作用而没有对流作用，另外液体培养基牛水的传热系数要比有机固体物质大得多.（2）培养基中的微生物数量不同成分的培养基其含菌量是不同的。
培养基中微生物数量越多,达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。
天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中含菌量远比化工原料的含菌量多，因此，灭菌时间要适当延长。
含芽孢杆菌多的培养基,要适当提高灭菌温度并延长灭菌时间。
（3）培养基成分油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质,会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。
高浓度的盐类,色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。
浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。
如大肠杆菌在水中加热至60～65℃便死亡,在10 %的糖液中,需70℃处理4～6 min，而在30％的糖液中则需70℃处理30min. 低浓度(1％～2%)的NaCI 溶液对微生物有保护作用，但随着浓度的增加，保护作用减弱,浓度达8％～10％以上，则减弱微生物的耐热性。
（4）培养基pH pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6。
0 ～8.0时微生物最不易死亡， pH <6.0时，氢离子易渗入微生物的细胞内,改变细胞的生理反应促使其死亡。
所以培养基pH愈低,灭菌所需时间愈短。
表5—1 pH对灭菌时间的影响（5)泡沫泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难,对灭菌极为不利。
因此对易产生泡沫的培养基进行灭菌时，可加入少量消泡剂。
3、消除高温有害影响的措施（1）采用特殊加热灭菌法（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；(3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15分钟)或间歇灭菌；(5）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌4、培养基灭菌方式4.1分批灭菌1）概念:将配制好的培养基置于发酵罐中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热灭菌的操作过程，叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。
包括:加热、维持和冷却三个阶段。
2) 操作要点三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热,直到所规定的温度，并维持一定的时间.这就是所谓的“三路进气"。
开始灭菌时,应排放夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，夹套内通入蒸汽。
当发酵罐的温度升至70℃时，开始由空气过滤器、取样管和放料管通人蒸汽，当发酵罐内温度达到120℃，压力达到l×105Pa(表压)时，灭菌进入保温阶段.在保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面以上其余各管道则应排蒸汽，不留死角,维持压力、温度恒定直到保温结束。
再依次关闭各排气、进气阀门,并通过空气过滤器迅速向罐内通入无菌空气，维持发酵罐降温过程中的正压,且在夹套或蛇管中通入冷却水，使培养基的温度降到所需温度.4.2 连续灭菌（1)空罐灭菌空罐灭菌也称空消。
无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料)尚未进罐前对罐进行预先灭菌,为空罐灭菌。
为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
（2)培养基连续灭菌1）概念：将配制好的培养基在通入发酵罐之前，进行加热、保温和降温的灭菌过程，叫做连消.2）优点：连续灭菌可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高;蒸汽负荷均衡;采用板式换热器时,可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小。
组成培养基的耐热性物料和不耐热性物料可在不同温度下分开灭菌,以减少物料至受热破坏的程度，也可将糖和氮源分开灭菌，以免醛基与氨基受热发生反应生成有害物质.3）流程A、喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程是常用的连续灭菌流程(见图5—1)。
培养基由配料罐放出，通过蒸汽预加热后，用连消泵送入气液混合器或连消塔底端,料液被加热到灭菌温度（130℃）后,由顶部流出,进入维持罐，维持8～25min,再由维持罐上部侧面管道流出,维持罐内最后的培养液由底部排尽，经喷淋冷却器冷却到发酵温度,送入发酵罐。
图5—1 喷淋冷却连续灭菌流程B、喷射加热连续灭菌流程图5—2 喷射加热连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程也是常用的连续灭菌流程（见图5-2)。
蒸汽直接喷人培养基，因此培养基急速升温到预定的灭菌温度，在此温度下的保温时问由维持段管子的长度来保证，灭菌后培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器，急速冷却。
该流程由于受热时间短，故温度可升到140℃而不会引起培养基的严重破坏。
该流程能保证培养基先进先出,避免过热或灭菌不彻底的现象。
C、薄板式换热器连续灭菌流程图5—3 薄板式换热器连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程是较为节能的流程(图5—3).该流程采用了薄板换热器作为培养基的加热器和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养基的温度升高,经维持段保温一段时间,然后在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。
虽然加热和冷却培养基所需时间比使用喷射式连续灭菌稍长，但灭菌周期则比间歇灭菌小得多。
由于生培养基的预热过程就是灭菌培养基的冷却过程，所以节约了蒸汽及冷却水的用量，故该流程的能量利用比较合理.4。
3发酵培养基及设备管道灭菌技术①种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌从有关管道通入蒸汽, 使罐内蒸汽压力达O。
147MPa,维持45min，灭菌过程中，从所有液位以上的阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过这些阀门以防止出现死角。
灭菌完毕后关闭蒸汽，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保压O。
098MPa.②空气总过滤器和分过滤器灭菌排出过滤器中的空气，从过滤器上部通人蒸汽，并从上、下排气口排蒸汽,维持压力O.147MPa灭菌2h。
灭菌完毕，通入压缩空气吹干。
③种子培养基实罐灭菌从夹层通入蒸汽间接加热至80℃,再从取样管、进风管、接种管等液面以下的阀门通人蒸汽,进行直接加热。
