第13卷 第3期2008年7月集美大学学报(自然科学版)Journa l o f Ji m e iU n i versity (N atura l Sc ience)V o l 13 N o .3Ju.l 2008[收稿日期]2007-08-28 [修回日期]2007-09-25[基金项目]福建省自然科学基金资助项目(B0710024);福建省属高校资助项目(2006F5063);集美大学创新团队基金资助项目[作者简介]杨远帆(1971 ),女,讲师,主要从事农产品贮藏与加工方向的研究.通讯作者:蔡慧农(1957 ),男,教授,从事生物工程方向研究.[文章编号]1007-7405(2008)03-0205-052种蛋白酶对鲢鱼蛋白质的酶解作用杨远帆,倪 辉,陈申如,邹青梅,蔡慧农,黄志勇(集美大学生物工程学院,福建厦门361021)[摘要]为了利用蛋白酶水解低值鱼或鱼加工下脚料生产水解鱼蛋白质,以鲢鱼蛋白质为原料对比研究了原料前处理、底物浓度、酶解时间、产物抑制浓度等对碱性蛋白酶和复合蛋白酶水解鱼蛋白质的影响,并研究了用2种蛋白酶分阶段水解鱼蛋白质的工艺.结果表明,碱性蛋白酶水解鲢鱼蛋白质在p H 8 0时的适宜条件为:温度45 ,酶解时间20m in ,蛋白质质量分数低于6%,产物氨基态氮质量浓度低于2 55g /L ;复合蛋白酶在p H 6 5时的最适水解条件为:温度50 ,酶解时间20m i n ,蛋白质质量分数小于6%,产物氨基态氮质量浓度小于2 25g /L ;用2种蛋白酶分段水解鲢鱼蛋白质可大大提高水解产物的氨基态氮含量,增加水解产物的得率.[关键词]鲢鱼蛋白质;碱性蛋白酶;复合蛋白酶;水解条件[中图分类号]TS 254 1[文献标志码]A0 引言低值水产蛋白质资源主要包括低值鱼和水产加工副产物,这类原料的食用价值和加工价值都很低,因而鲜销价值不高.目前,对低值水产蛋白质资源的利用主要是简单加工成鱼粉,或直接作为饲料,利用价值较低.随着经济鱼类产量的衰退、低值鱼产量的增加及鱼类加工业的发展,低值水产蛋白质原料的总量在渔业中所占的比例越来越高[1].开发新的技术,提高低值鱼和鱼加工副产物的综合利用水平,实现低值水产蛋白质资源综合利用的高值化已经成为渔业增收的重要难题.用蛋白酶水解技术处理低值水产蛋白质资源不仅可以回收优质的鱼类蛋白质,还可以改变鱼类蛋白质的功能特性,生产出许多不同功能特性的水解产物,如鱼蛋白胨、鱼蛋白乳化剂、鱼蛋白发泡剂、鱼蛋白肽、海鲜调味料,等等,是实现水产蛋白质资源功能化、高值化利用的重要技术.鲢鱼(H yp ophthal m ich thy s m o litrix )是一种食用价值较低、产量很大的淡水鱼,研究鲢鱼蛋白质的酶水解技术,并对其酶解蛋白进行氨基酸分子量范围分析,不但对鲢鱼的深加工和高值化利用具有重要的理论和应用价值,而且可以减少资源浪费和环境污染.本文对比研究了碱性蛋白酶和复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白质的工艺条件,为鲢鱼蛋白质酶解产物的高值化利用提供了一定的理论依据.1 材料与方法1 1 实验材料1)原料.鲢鱼购于集美菜市场.2)试剂.碱性蛋白酶、复合蛋白酶购于诺维信公司;甲醛、Na OH 、HC l 均为分析纯.集美大学学报(自然科学版)第13卷3)仪器设备.电子天平(Scout Pro ,奥豪斯国际贸易上海有限公司);分光光度计(UV -2000,尤尼柯仪器有限公司);酸度计(P H 211型,北京哈纳科仪科技有限公司);磁力搅拌器(79-1,常州国华电器有限公司);离心机(TD5M -W S,湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司);恒温水浴锅(HH -4,国华电器有限公司);冰箱(BCD-215,海尔集团).1 2 实验方法1)原料处理.将鲢鱼去头去骨后切块,用搅碎机绞成糜状,加入9倍体积的水,用HC l 将p H 值调至2 42左右,使蛋白质大部分溶解,滤去不溶物,用N a OH 将滤液pH 值调至5 4,使蛋白质沉淀,5000r/m i n 离心15m in ,收集蛋白质,冷冻干燥备用[2].2)酶解实验.配制鲢鱼蛋白质水溶液和酶液,分别水浴预热5m i n ,二者2!1(体积比)均匀混合,调至合适的p H 值,放入相应温度的水浴锅中水解.反应一定时间后(反应过程中不断用Na OH 溶液和HC l 溶液进行调节,使反应体系维持在所需的p H 值),用移液管吸取5mL 水解液,加入5mL 质量分数10%的三氯乙酸终止反应,测定其游离氨基态氮含量[3-4].以相同条件下先加入三氯乙酸的反应结果作为对照.每个实验及测定均平行3次.3)测定方法.总蛋白质含量:凯氏定氮法[5];氨基态氮含量:甲醛滴定法.2 结果与分析2 1 原料前处理及水解温度对酶水解的影响为了研究前处理及温度对鲢鱼蛋白质酶解的影响,配制质量分数为1%的鲢鱼蛋白质水溶液,分成2份,1份未做任何处理,1份经沸水煮5m i n ,加入质量分数为0 1%的蛋白质酶液,再根据实验需要各自分成若干份,分别置于35、40、45、50、55 条件下水解20m i n ,反应过程中维持体系p H 值不变(碱性蛋白酶反应体系p H =8;复合蛋白酶反应体系p H =6 5).反应结束后测定水解液的氨基态氮含量,结果如图1所示.由图1可以看出,用碱性蛋白酶水解鲢鱼蛋白质,在45 时出现了氨基态氮的峰值;用复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白质,在50 时出现了氨基态氮的峰值,这说明用碱性蛋白酶水解鲢鱼蛋白质的最适水解温度在45 左右,而用复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白质的最适水解温度在50 左右.相对未变性处理的蛋白质而言,热变性后的鱼蛋白质可能由于高级结构被破坏,酶与蛋白质作用位点之间的接触频率增大,水解产物氨基态氮的含量普遍增加,其增加率见表1,说明热处理变性有利于碱性蛋白酶和复合蛋白酶对鲢鱼蛋白质的进一步水解.表1 鲢鱼蛋白质热处理后在不同温度下水解产物的增加率Tab 1 E ff ec t o f hea t trea t m ent on t heincreas i n g ra t e o f ammon iaca l n itrogen温度/增加率/%碱性蛋白酶复合蛋白酶3520040401145147501717552002 2 底物浓度对酶水解的影响在其他条件固定不变的情况下(加酶量质量分数0 1%,碱性蛋白酶反应体系pH 值8 0,反应时间20m i n ,温度45 ;复合蛋白酶反应体系p H 值6 5,反应时间20m in ,温度50 ),改变体系∀206∀第3期杨远帆,等:2种蛋白酶对鲢鱼蛋白质的酶解作用∀207∀集美大学学报(自然科学版)第13卷 从图4、图5可以看出,当反应体系的底物浓度达到一定值时,继续加入酶粉并没有相应地增加产物浓度和得率;虽然在第一次加酶粉的同时加入适量底物可以使产物浓度增加,但得率却降低了,再次加入酶粉和底物,产物量没有进一步增加,而得率则继续减少.这表明,当产物浓度达到某一程度时,酶对蛋白质的作用程度降低.2 5 2种蛋白酶对鱼蛋白质的分段水解由于不同的蛋白酶对蛋白质作用的位点不同,所以水解产物的分子大小、功能特性及氨基态氮含量都可能不同.为了研究用2种蛋白酶分阶段水解鲢鱼蛋白质的特点,进行两组实验,一组用质量分数6%的鱼蛋白质和质量分数0 1%的碱性蛋白酶液,控制p H 值8 0,45 水解35m i n ,加热灭酶后加入质量分数0 1%的复合蛋白酶粉,控制pH 值6 5,50 反应20m in .另一组用质量分数6%的鱼蛋白质和质量分数0 1%的复合蛋白酶液,先控制pH 值6 5,50 水解35m in ,然后加入质量分数0 1%的碱性蛋白酶粉,控制pH 值8 0,45 水解20m i n ,定时测定体系中氨基态氮质量含量,同时计算得率,结果如图6所示.由图6可以看出,碱性蛋白酶水解后加入复合蛋白酶,产物氨基态氮的质量含量从2 40g /L 增加到2 50g /L ,得率从7 57%增加到7 86%;而复合蛋白酶水解后加入碱性蛋白酶,产物氨基态氮的质量含量从1 97g /L 升至2 57g /L ,得率从6 40%增加到8 09%.也就是说,先复合蛋白酶后碱性蛋白酶的分段水解明显好于先碱性蛋白酶后复合蛋白酶的作用效果,表现为得率的明显提高.从图6曲线的趋势上看,还有提高的可能性,今后可就此做进一步的研究.3 结论1)碱性蛋白酶水解鲢鱼蛋白质在pH 8 0时的最适条件为:酶解温度45 ,酶解时间20m i n ,蛋白质质量分数低于6%,产物氨基态氮质量浓度低于2 55g /L .2)复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白质在pH 6 5时的最适条件为:酶解温度50 ,酶解时间20m i n ,蛋白质质量分数小于6%,氨基态氮质量浓度小于2 25g /L .∀208∀第3期杨远帆,等:2种蛋白酶对鲢鱼蛋白质的酶解作用3)用两种酶分段水解鲢鱼蛋白质,尤其是先复合蛋白酶后碱性蛋白酶的水解顺序,可明显提高水解产物的氨基态氮含量,增加水解产物的得率.[参考文献][1]赵玉红,孔保华.鱼蛋白水解的研究进展[J].肉类工业,2000(3):31 34.[2]陈申如,张其标,倪辉.酸法提取鲢鱼鱼肉蛋白质技术的研究[J].海洋水产研究,2004,25(5):61 64.[3]王长云,林洪,周东,等.从鳕鱼碎肉中提取水解蛋白[J].海洋湖沼通报,1995(4):33 39.[4]余杰,陈美珍.酶法制备水解鳗鱼头蛋白及其应用的研究[J].中国海洋药物杂志,2005(5):50 54.[5]王秀奇,秦淑媛,高天慧,等.基础生物化学实验[M ].北京:高等教育出版社,1999.E ffect of Two Proteases on Enzym atic Character forH ydrolysis of Silver Carp Protei nYANG Yuan fan ,N IH u,i C HEN Shen ru ,ZOU Q i n g m e,i C A I H u i nong ,HUANG Zhi yong(Schoo l of B i o techno l ogy Eng i neeri ng ,Ji m e iU n i ve rsity ,X ia m en 361021,Ch i na)Abst ract :Cond itions of enzy m olysis (such as pre treat m en,t te m perat u re ,substrate concentrations ,hydro l y sis ti m e and product concentration)o f silver car p protei n by a lca l a se and m ulti protease w ere studied .The resu lts showed that the opti m u m hydro l y sis conditi o n o f a lca lase fo r silver car p pro tein w as pH 8 0,45 ,20m i n ,protei n concentrati o n belo w 6%,product a m i n o n itrogen concentrati o n belo w 2 55g /L ;t h e op ti m u m hydro lysis conditi o n of m ulti protease w as p H 6 5,50 ,20m i n ,protein concentrati o n less t h an 6%,pr oduct a m ino n itr ogen concentration less than 2 25g /L ;hydro l y sis w ith t w o proteases i n t w o steps could greatly enhance the content o f the a m i n o n itr ogen and i n crease the recover y o f a mm on iacal n itro gen .These results w ere i m po rtant for t h e further utilization of lo w va l u e fish prote i n w ith enzy m atic m e t h ods .K ey w ords :silver carp pro tein ;a lca lase ;m u lti pr o tease ;hydro lysis conditi o n(责任编辑 马建华)∀209∀。
