植物组织培养 第3章 植物组织培养技术愈伤组织的分化与再分化、脱分化及形态发生(2)

植物组织培养的核心步骤
植物组织培养的核心步骤主要包括外植体的脱分化和再分化。

1. 外植体的脱分化形成愈伤组织。

在这个过程中，植物细胞会失去原有的组织结构和功能，转变为具有分生能力的细胞，进而形成愈伤组织。

2. 愈伤组织再分化形成胚状体。

在愈伤组织的基础上，通过调节培养基中的激素比例和其他环境因素，可以诱导愈伤组织分化成具有特定形态和功能的胚状体，这是植物组织培养中的关键步骤之一。

此外，植物组织培养还包括固体培养法和液体培养法等不同的培养方法。

固体培养法使用琼脂固化培养基来培养植物材料，而液体培养法则使用不加固化剂的液体培养基。

液体培养法中，通常需要通过搅动或振动培养液以确保氧气的供给。

以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅植物组织培养相关文献或咨询植物学家。

植物组织培养复习材料一、名词解释。

1、植物组织培养(plant tissue culture) :植物的离体器官、组织或细胞在人工制备的培养基上进行无菌培养，并在人工控制的环境条件下，使其发育成完整植株的科学技术2、脱分化(dedifferentiation ):指失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞即愈伤组织的现象。

3、再分化(redifferentiation ):愈伤组织形成不定芽或不定根或胚状体。

4、外植体(explant):植物组织培养过程中从活体植株上切去下来的用于离体培养的一切材料。

(如器官、组织、细胞、原生质体、种子等)5、愈伤组织(callus):原本指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。

在组培中，则指人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。

6、器官发生：胚胎时期由胚层器官原基发育成器官的过程。

包括细胞分化和器官形成。

7、胚状体发生：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。

可进一步发育成植株。

8、细胞全能性(cell totipotency ):指植物的每一个细胞都携带有一完整的基因组, 并具有发育成完整植株的潜在能力。

9、细胞分化：一个尚未特化的细胞发育出特征性结构和功能的过程。

10、极性:细胞(也可指器官或植株)内的一端与另一端在形态结构和生理生化上的差异。

11、试管苗：通过组织培养产生的植株。

12、看护培养:是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。

这块愈伤组织被称为看护组织。

13、固相化培养：将细胞或原生质体固着在琼脂糖、藻（月元）酸盐或多聚赖氨酸中，然后将他们放入液体培养基中震荡培养。

这种培养方法既利用了振荡培养室营养物质和气体易于交换的优点，有利用了固相化使细胞免受振荡时剪切力的作用。

14、悬浮细胞培养:将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增值的技术。

第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。

大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。

愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。

一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。

细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。

持续十几小时~几天。

2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。

3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。

若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。

2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。

颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。

一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。

3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。

迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。

其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。

生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。

二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。

愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。

植物组织培养的过程是什么？根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术——植物的组织培养技术植物组织培养的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。

植物组织培养的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。

不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。

再适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科植物组织的培养方法：1、非试管微组织快繁非试管微组织快繁技术是将外植体（一般要求带一叶一芽）放置在室内外普通沙子培养基上进行培养，利用植物腋芽自然倍增达到快速繁殖的目的。

一般植物7～15天可以生长出根系。

此技术投资低，操作环节少。

2、试管组织培养试管组织培养是将外植体（即离体组织、器官或细胞）放置在试管等器皿中在无菌的条件下进行组织培养获得试管苗。

植物组织培养的优点：1、占用空间小，不受地区、季节限制。

2、不携带病毒3、培养周期短4、可用组培中的愈伤组织支取特殊的生化制品5、可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物6、可诱导之分化成需要的器官，如根和芽7、解决有些植物产种子少或无的难题，8、不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征9、投资少，经济效益高10、繁殖方式多，试用品种多植物组织培养一般分为以下几种：1、胚胎培养指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。

《植物的组织培养技术》1．植物组织培养的理论基础：细胞全能型。

2．植物组织培养的流程：离体的植物组织或细胞→愈伤组织→根或芽等器官3．愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。

4．离体的（高度分化的）植物组织或细胞形成愈伤组织的过程，称为脱分化（去分化）。

脱分化产生的愈伤组织继续进行培养形成根或芽等器官的过程叫做再分化。

再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。

5．生物个体发育过程中细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程叫细胞分化。

6．细胞分化本质：基因选择性表达。

7．植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。

8．菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝（生长旺盛嫩枝）作材料。

9．植物的组织培养的培养基：MS 培养基。

10．MS 培养基营养的（一般情况下只有①～⑤）成分：①大量元素是N 、P 、S 、K 、Ca 、Mg ，②微量元素是Fe 、Mn 、B 、Zn 、Cu 、Mo 、I 、Co ，③植物激素，④蔗糖，⑤琼脂，⑥有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素等。

（大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。

）11．植物激素主要是生长素和细胞分裂素，是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。

在培养基使用顺序 实验结果 生长素／ 细胞分裂素比值与结果先生长素，后细胞分裂素 有利于分裂但不分化 比值高时 促根分化，抑芽形成先细胞分裂素，后生长素 细胞既分裂也分化 比值低时 促芽分化，抑根形成同时使用 分化频率提高 比值适中 促进愈伤组织生长12．植物组织培养的影响因素：PH 、温度、光等。

13．MS 培养基采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

植物组织培养中的愈伤组织的形成及再分化
植物组织培养中使用的外植体一般是高度分化了的细胞,在植物体中是不会再分裂繁殖的,只是执行某种功能直至死亡。

这些细胞在培养基上培养时会由原来的分化状态变成分生状态的细胞,分裂产生愈伤组织,这个过程称为脱分化过程。

组织培养的研究结果表明分化细胞的脱分化需要两个条件,即创伤和外源激素。

目前人们对于脱分化过程的本质还不清楚。

分化细胞在细胞周期中是处于一种相对
静止状态的细胞(G
0期细胞),脱分化是要打破这种状态,使细胞进入细胞周期中的G
1
期,
并沿着G
1期→S期→G
2
期→M期的循环进行细胞分裂,形成愈伤组织。

现在发现细胞周期
受基因调控,一种称为编码细胞周期依赖性激酶的基因和一种细胞周期蛋白可能与植物细胞脱分化的第一次分裂启动有关。

那么,什么因素诱导细胞周期调控基因的作用,培养实践证明与外源激素有关。

至于激素如何诱导以及诱导作用的过程目前仍不清楚,有待深入研究。

当细胞脱分化形成愈伤组织后,经过一段时期的分裂,细胞群体又会产生分化,形成分生细胞或分生细胞团,由此再生成植株有两条途径:一是形成体细胞胚(功能类似于受精过程产生的胚),通过体细胞胚形成再生植株;二是通过器官发生的途径再生植株,分生细胞在一定的诱导条件下重建芽的分生组织,分化出芽后再生根,成为完整的植株。

对于植物组织培养来说,光照条件非常重要,包括光照强度、时间和波长。

但在愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养,而在分化再生的过程中一定要有光照。

愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞脱分化产生愈伤组织,如果在光照条件下容易分化产生维管等组织,不利于产生大量的愈伤组织。

阶段质量检测（三）植物的组织培养技术(时间：60分钟；满分：100分)一、选择题(每小题2.5分，共50分)1．下列有关植物组织培养的叙述，正确的是()A．外植体经再分化形成愈伤组织B．二倍体植株的体细胞经脱分化与再分化后得到稳定遗传的植株C．愈伤组织细胞的全能性比外植体低D．脱分化过程伴随着细胞的有丝分裂解析：选D外植体经脱分化形成愈伤组织，全能性提高；二倍体植物的体细胞经组织培养所得子代基因型不变，是否稳定遗传取决于所选材料自身是否为纯合子；脱分化同时伴随有细胞的有丝分裂，形成愈伤组织。

2．下列有关“菊花的组织培养”实验说法错误的是()A．培养基中需要添加一定的营养物质和激素B．在培养基灭菌后加入激素可以避免激素分子被高温破坏C．外植体的消毒既要考虑效果，又要考虑植物的耐受能力D．在组织培养不同阶段，需要使用不同激素含量的培养基解析：选B菊花组织培养中需要添加一定的营养物质和激素；在培养基灭菌前加入激素；外植体进行表面消毒时，既要考虑效果，又要考虑植物的耐受能力；在组织培养不同阶段，需要使用不同激素含量的培养基。

3．用高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误的是()A．该愈伤组织是细胞经过脱分化形成的B．该愈伤组织的细胞没有全能性C．该愈伤组织是高度液泡化呈无定形状态的一群薄壁细胞D．该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构解析：选B愈伤组织是外植体经脱分化和分裂形成的；愈伤组织细胞含有该生物全部的遗传物质，仍然具有全能性，且全能性比外植体高；愈伤组织是高度液泡化的无定形状态薄壁细胞组成的排列疏松、无规则的组织；愈伤组织经过再分化可以形成胚状体。

4．下列关于月季的花药培养，说法错误的是()A．花药的选择与培养基的组成影响花药培养的成功率B．在剥离花药时，要尽量不损伤花药，否则不利于愈伤组织或胚状体的形成C．培养出的植株常需作进一步的鉴定和筛选D．诱导产生愈伤组织的分裂方式是有丝分裂解析：选B剥离花药时，要尽量不损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织。

植物组织培养植物组织培养：在无菌的条件下，将离体的植物材料包括器官，组织，细胞以及原生质体在人工培养基上进行培养，使其再生发育成完整植株的过程，又称植物离体培养。

细胞全能性：植物体的任何一个细胞都携带该物种的全部遗传信息，离体细胞在一定的条件下具有发育成完整植株的潜在能力。

外植体：植物组织培养中离体的植物材料，包括植物器官，胚胎、组织、细胞和原生质体。

细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。

脱分化：已分化成熟的植物组织或器官回复到分生状态，细胞开始分裂形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。

再分化：是指在一定条件下，脱分化形成的愈伤组织转变成为具有一定结构、执行一定生理功能的细胞团和组织、并进一步形成完整植株的过程，即从愈伤组织再生形成完整植株的过程。

愈伤组织：植物体受伤后的伤口处或在植物组织培养中外植体切口处产生的一团不定型的薄壁组织。

离体无性繁殖：根据植物细胞全能性原理，在无菌条件先短时间内形成大量植株。

玻璃化苗：在植物组培中，茎叶形成透明矮小肿胀的形态，生根能力差。

问答题：1、无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，请根据自己的体会论述如何在植物组织培养过程中做到无菌？1）取少菌的材料（春夏，中午的幼芽）2）严格灭菌3）合理安排操作程序4）无菌保存5）操作规范2、组培在生产上的应用有哪些？学好植物组培的意义？1）植物快速繁殖：增殖速度快，成本低，易于批量生成和管理。

比如利用一小块叶片或一个茎尖，一年内可繁殖出1000-100000株幼苗2）脱除病毒：植物在生长过程中几乎都要蒙受到病毒的危害，采用茎尖培养方法可以除去植物体内的病毒。

脱毒苗恢复了原有的优良种性，生长势明显增强，整齐一致。

3）培养新品种：克服远缘杂交不亲合性；克服远缘杂交的不孕性；选择细胞突变体；单倍体育种；转基因育种。

4）植物次生代谢产物生产：利用植物组织后细胞的大规模培养，可以生产一些天然有机化合物，这些次生代谢产物，往往具有一些特定的功能，对人类有重要的影响和作用。

第三节植物组织培养技术教学建议植物组织培养的基础知识对于学生来说还是有一定难度的。

教师最好在课前准备已脱分化的愈伤组织和再分化的丛芽等材料,让学生在课堂上观察,以增进学生的感性认识,帮助学生理解植物组织培养的基本原理。

关于培养基,可以让学生通过与微生物培养基配方的对比来认识用于植物组织培养的培养基的特点。

关于植物激素的使用,可以引导学生回顾高中必修教材《稳态与环境》中细胞分裂素和生长素的作用。

本课题耗时较长,需要提前做好计划。

有关培养基母液的配制、培养基高压灭菌、组培苗的培养以及栽培管理等工作,可在课下进行。

如果课时紧张,外植体的消毒和接种也可以在课下进行。

课上学生只需做一些关键步骤的操作,如分化转瓶、丛芽继代、生根转瓶等。

建议第一课时完成基础知识教学,学习操作方法并使用各种母液配制培养基。

第二课时学习外植体接种或继代转瓶。

此后学生可以利用课下时间做观察记录。

第三课时做生根组培苗的移栽。

大田栽培或盆栽管理工作可以在课外组织同学来做。

参考资料1.无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键植物组织培养不同于扦插、分根、叶插等常规无性繁殖。

由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差,所以对培养条件的要求较高,对无菌操作的要求非常严格。

如果不小心引起污染,将可能造成培养工作的前功尽弃。

无菌技术包括培养基消毒灭菌和植物材料(外植体)的消毒灭菌。

对培养材料进行表面灭菌时,一方面要考虑药剂的消毒效果;另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。

不同药剂、不同植物材料,甚至不同器官要区别对待。

建议教师课前积极摸索成功经验,或先组织部分学生做外植体的接种,以培养实验骨干。

课上让骨干学生介绍经验,帮助大部分同学完成任务。

有条件的学校还可以将植物组织培养的全部过程拍摄成录像,供其他学生参考。

2.妥善处理被污染的培养物即使对于有经验的操作人员,操作后出现培养物被污染的情况也常有。

一般情况下,细菌污染可能是由接种人员造成的,如未戴口罩,接种时说话,或手及器械消毒不严等。