甘蓝型油菜单倍体遗传转化优化试验

甘蓝型油菜花柄遗传转化体系的创建刘洋;徐漫;赵德刚【摘要】为获得转基因油菜植株,以甘蓝型油菜品种特选4号花柄为外植体,确定了不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,并进行了花柄外植体的转化试验,得到了抗卡那霉素(Kan)植株,并对影响转化的一些因素进行了研究.结果表明:卡那霉素对芽再生均具有很强的抑制作用,最佳筛选浓度为15 mg/L；花柄外植体在MS+3 mg/L 6-BA+1.0 mg/L2,4-D培养基上预培养72h时,经农杆菌(OD600≈0.4)侵染3 min后共培养2d,获得了抗卡那霉素并通过PCR鉴定和GUS 报告基因检测的转基因植株15株,遗传转化效率为5.19％.%In order to obtain transgenic rape plants, a transformation test was conducted taking the flower stalk of B. napus cultivar Texuan 4 as the explants, and Kan-resistant plant was obtained, some factors affecting transformation were studied. The results showed that the optimal adventitious buds induction medium was MS+6-BA3. 0 mg/L + NAA 0. 1 mg/L, and the optimal kanamycin concentration for screening was 15 mg/L. When flower stalk explants were precultured on the MS medium containing the combination of 1. 0 mg/L 2. 4D and 3 mg/L 6-BA for 72 hours,and then infected with A. tumefaciens (OD600 =0. 4) for 3 minutes and co-cultured for two days, 15 kanamycin resistance plants were obtained and passed PCR identification and GUS detection. The transformation frequency reached 5. 19%.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2013(041)002【总页数】5页(P1-5)【关键词】油菜;花柄;外植体;遗传转化【作者】刘洋;徐漫;赵德刚【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学贵州省农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地,贵州贵阳550025;贵州大学贵州省农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】S565.403.2油菜系十字花科芸薹属植物，分为白菜型（Brassica rapaL.）、芥菜型（Brassica juncea L.）和甘蓝型（Brassica napus L.）3种栽培种，其中，甘蓝型油菜在全球的种植面积最为广泛，芥菜型次之，白菜型最少。

甘蓝型油菜产量性状及其杂种优势遗传基础的全基因组解
析的开题报告
题目：甘蓝型油菜产量性状及其杂种优势遗传基础的全基因组解析
研究背景：
油菜是我国重要的油料作物之一，在全球也有广泛的种植。

由于其较高的产油量和质量，油菜的种植、加工及利用价值不断提升。

目前，甘蓝型油菜是我国油菜种植
面积较大的品种之一，其产量性状及杂种优势遗传机制研究已成为当前油菜遗传学研
究的热点。

发展现状：
随着深度测序技术的迅速发展，全基因组测序已成为解析复杂性状遗传基础的有力工具。

已有研究使用全基因组测序技术分析了油菜的遗传多样性及基因组组装情况，并揭示了大量新的遗传信息。

然而，对于甘蓝型油菜产量性状及其杂种优势遗传基础
的全基因组解析还很少见。

研究内容：
本次研究拟使用全基因组测序技术，对不同产量表型甘蓝型油菜品种及其杂种后代的全基因组序列数据进行分析，挖掘产量性状相关的关键基因和通路，探究杂种优
势形成的遗传机制。

研究方法：
首先，选取表现出不同产量表型的甘蓝型油菜品种及其杂种后代，进行全基因组测序，并进行基因组比对、SNP分析、RNA测序等分析，获取关键基因和通路信息。

然后，对关键基因进行功能验证及表达模式分析，进一步验证其与产量性状及杂种优
势形成的相关性，揭示遗传机制。

研究意义：
本次研究将揭示甘蓝型油菜产量性状及其杂种优势遗传基础的全基因组解析，为进一步优化油菜种植与提高产量提供理论依据。

同时，对油菜遗传学研究的深入发展
也具有重要意义。

油菜单倍体遗传转化的条件作者：申敏来源：《广东蚕业》 2019年第11期DOI：10.3969/j.issn.2095-1205.2019.11.14申敏（长治职业技术学院山西长治 046000）作者简介：申敏（1987- ），女，山西潞城人，硕士，研究方向：食品生物技术。

摘要小孢子作为一种单倍体材料可以进行外源基因遗传转化，这种方式可以加快转基因材料纯合速度，在染色体加倍后，导入的外源性状能以纯合体的形式体现。

排除了隐性干扰，提高了选择的准确性。

文章从单倍体概念及原理、转化的主要技术环节及其特点、后代鉴定等进行了分析。

关键词单倍体；遗传转化；进展中图分类号:S513 文献标识码:A 文章编号:2095-1205(2019)11-27-02油菜是一种重要的油料作物，现阶段大部分研究进行转化的材料大都是二倍体的组织，得到的转基因植株经常是杂合体[1]，在后代培养中容易造成外源基因的丢失，限制了在基因改良中的优势利用。

小孢子或是小孢子衍生胚、花粉和小孢子培育体系在多种有重要商业价值的高等植物中已经有过报道。

依据小孢子本身的特性可以使得小孢子作为基因纯合的优良受体。

在染色体加倍后，导入的外源性状能以纯合体的形式体现。

这种方法还可以用来在经过了胚胎的基因转移和突变重新得到单个植株的同质植株。

单倍体最关键的优点是转基因会使转化株马上表达转化性状，简化了遗传分析，增加基因剂量。

单倍体转化技术已经被广泛应用于杂交后纯系品种快速繁殖。

1 油菜单倍体转化的外植体小孢子衍生的胚、单倍体茎段、茎节间、茎段、叶柄、子叶下胚轴、原生质体和小孢子等各种外植体可以用在遗传转化实验。

小孢子再生能力非常强，后期更易获得需的材料。

刚分离的小孢子作为转化受体选择主花序或第一次分枝花序3～4 mm的花蕾，在油菜花药培养中，只有单核晚期的小孢子可能发育成胚状体。

在开花四天摘取3～4 mm的花蕾时，小孢子的发育一致性较好[2]。

对于甘蓝型油菜，从器官、组织、细胞三个水平研究了供体植株不同外植体部位再生情况及影响再生反应的一些因素，并对甘蓝型油菜小孢子来源的再生组培苗进行了倍性水平的鉴定[2]，结果表明，利用茎段节间再生腋芽是一种较好的快速再生植株方式，具有出芽快，遗传特性保持好的特点，茎段具有较强的分化芽能力，而叶柄和叶片难以诱导芽分化。

甘蓝型油菜单倍体遗传转化优化试验作者：申敏殷家明来源：《天津农业科学》2012年第03期摘要：以甘蓝型油菜单倍体试管苗或花粉胚状体作为试验材料进行遗传转化。

结果表明，花粉胚状体在液体培养基加入2，4-D 1.0 mg·L-1 预培养6 d，得到的绿色愈伤率最高；甘蓝型油菜花粉植株PCK121茎段在预培养基（6-BA 0.5 mg·L-1 +2,4-D 2.0 mg·L-1）上预培养后得到的绿色抗性愈伤率最高；油菜单倍体试管苗叶柄和茎段在预培养时间0～10 d后转化均可产生抗性愈伤；在培养基中添加2，4-D时，很容易产生绿色抗性愈伤，这是因为此时培养物对卡那霉素的耐受性增加。

关键词：甘蓝型油菜；遗传转化；单倍体中图分类号：S565.4 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.03.003Preliminary Study on Genetic Transformation of Brassica napus HaploidSHEN Min，YIN Jia-ming（College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China）Ａｂｓｔｒａｃｔ: Brassica napus haploid test-tube plantlets or pollen embryoids were used as materials for transformation. The results showed that pollen embryoids precultured in liquid medium by adding 2,4-D 1.0 mg·L-1 for six days had the highest green callus percentage. The stem of the pollen-derived plantlets PCK121 got a maximum green callus percentage in meduim with 6-BA0.5mg·L-1+2，4-D 2.0 mg·L-1. The leave petiole and shoot-stem transformed after 0~10 days preculture could produce resistent callus. Resistent callus could be easily obtained when the acceptor were cultured in medium with 2,4-D, which suggested that the cultures had increasing resistence to kanamycine.Key words: Brassica napus; genetic transformation; haploid研究表明，黄籽频率高的油菜品种含油量高，饼粕中蛋白含量高。

甘蓝型油菜离体培养再生体系的优化作者：郭婷婷周晓婴张维来源：《江苏农业科学》2016年第07期摘要：为优化甘蓝型油菜离体培养再生体系，本研究分析了影响再生频率的多个关键因素，包括品种、外植体类型、苗龄、预培养时间以及激素浓度与配比等。

结果表明：品种对再生频率影响较大，Westar的外植体再生频率高于宁油18号和中双11号；不同外植体再生频率也存在差异，子叶柄的再生频率显著高于下胚轴；苗龄以4 d较好，预培养时间以2 d较适宜；预培养基中激素2，4-D最适浓度为1 mg/L，分化培养基中，6-BA/NAA比例为10 ∶ 1时子叶柄的再生频率最高，为70.79%，6-BA/NAA比例为9 ∶ 1时下胚轴的再生频率最高，达到96.73%。

经过优化后，油菜外植体再生频率得到显著提高。

关键词：油菜；离体培养；再生；优化；影响因素中图分类号： S634.304+.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0076-04油菜为世界第二大油料作物[1-3]，也是我国重要油料作物之一，在人类的生活和农业生产上有着极其重要的作用。

油菜花具有一定观赏价值，可用作旅游资源；油菜的茎叶可食用，还可用来饲养动物；油菜种子不仅可用来榨取食用油，饼粕还可用来做饲料。

此外，油菜属于可再生资源，低芥酸菜籽油中的脂肪酸碳链组成与柴油分子碳数相近，因此被认为是生物柴油最理想的原料[4]。

当今育种学家把提高油菜产量和品质，培育抗病和抗逆油菜新品种作为重要内容来研究[5]。

目前，组织培养技术被广泛地应用到油菜育种中[6]，并得到了大量不同优良特性的油菜种质资源[7-12]。

高效的植株再生体系是油菜基因工程育种中的重要环节。

在已有的研究报道中[13-18]，油菜可用下胚轴、子叶柄、根、茎、小孢子等作为外植体来进行组织培养。

经过多年研究，国内外许多机构已建立了较为成熟的油菜离体培养再生体系[19-21]。

然而，研究表明，在油菜组织培养中，不同基因型、不同外植体之间的最佳再生条件存在差异，这在一定程度上阻碍了油菜转基因研究的发展。

甘蓝型油菜的遗传转化作者：杜建中， 孙毅， 曹秋芬， 郝曜山， 刘龙龙， 贺健， DU Jian-zhong， SUN Yi， CAO Qiu-Fen， HAO Yao-Shan， LIU Long-Long， HE Jian作者单位：山西省农业生物技术研究中心,山西,太原,030031刊名：生物技术通讯英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2008，19(5)引用次数：0次1.唐桂香.周伟军提高甘蓝型油菜离体培养再生频率的研究[期刊论文]-浙江大学学报(农业与生命科学版)2001(5)2.林良斌.官春云.周小云.何业华.杨志新转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究[期刊论文]-作物学报 2002(2)3.Ooms G.Bains A.Burrell M Genetic manipulation in cultivars of oilseed rape(Brassica napus)using Agrobaeterium 1985(2)4.李学宝.郑世学.董五倍甘蓝型油菜抗虫转基因植株及其抗性分析[期刊论文]-遗传学报 1999(3)5.导入双价基因的转基因杂交油菜亲本及其对菌核病抗性的研究[期刊论文]-植物学通报 2005(3)6.林良斌.官春云油菜高效转化系统的研究[期刊论文]-作物学报 1999(4)7.黄琼华.杨光伟.李德谋.罗小英.裴炎农杆菌介导法将FPFJ基因导入油菜的研究初报[期刊论文]-西南农业大学学报 2002(2)8.董娜.林良斌.马占强农杆菌介导反义油酸脱饱和酶基因转化甘蓝型油菜[期刊论文]-分子植物育种 2004(5)9.Pua E C.Mehra-Palta A.Nagy F Transgenic plants of Brassica napus Lm 1987(8)10.王艳.曾幼玲.贺宾.秦丽.李金耀.高燕.张富春农杆菌介导NHX基因转化甘蓝型油菜的研究[期刊论文]-作物学报 2006(2)11.Klimaszewska K.Keller W A High frequency plant regeneration from thin cell layer explants of Brassica napus 1985(3)12.Xu Z H.Davey M R.Cocking E 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专利名称：不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系
专利类型：发明专利
发明人：冉毅东,高崑,张康
申请号：CN201910275835.0
申请日：20190408
公开号：CN109880788A
公开日：
20190614
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系。

本发明提供了一种利用甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子的方法，包括如下步骤：1)酶解甘蓝型油菜叶片制备得到原生质体；2)将外源核酸分子转入所述原生质体，得到转外源核酸分子的原生质体；再将所述转外源核酸分子的原生质体在C:B培养基中分裂培养，得到由原生质体分裂形成的细胞团；本发明以油菜无菌幼苗为起始材料，采用纤维素酶R‑10和离析酶R‑10，对油菜叶肉组织进行消化并利用密度梯度沉降的方法分离原生质体，获得了高纯度的原生质体。

通过聚二乙醇介导将目的基因导入油菜原生质体基因组中，经液体浅层培养以及后续分化再生，培育出大量油菜转基因植株。

申请人：天津吉诺沃生物科技有限公司
地址：301700 天津市武清区武清开发区福源道北侧创业总部基地C10号楼东侧一楼
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：白艳
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