实时定量 PCR 技术

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实验六实时定量PCR技术实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

实时荧光定量PCR仪包括热循环仪，检测系统，计算机及软件分析系统。

一、实验原理谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（Ct值）与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代Ct值。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

定量的方法一般常用的有3种，SYBR green I，TaqMan探针定量及Molecular Beacon.图1. Ct值的确定SYBR荧光染料在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

但是在有非特异扩增的情况下，不能采用SYBR green I 定量，因为非特异的扩增片断也会贡献荧光增量。

TaqMan荧光探针,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步. TaqMan探针特异性地结合在靶序列上，只有真正发生靶序列扩增的反应才会有荧光增量的产生。

荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线图2. 定量原理：初始模板量的对数与C(T)循环数之间呈线性关系近几年来荧光定量PCR技术广泛应用于DNA定量、RNA定量、SNP分析和基因型分析等方面。

这里主要讨论荧光定量PCR技术在分子生态研究中的应用。

在微生物分子生态研究中，常常需要对生态系统中的有益微生物或有害微生物进行定量及跟踪定量检测，如在外界环境发生变化、系统功能发生紊乱、人为干扰等的情况下，对之进行动态跟踪定量检测，对于环境检测以及环境治理效果的的预测和评价上具有重要意义。

而传统的对于系统中重要的功能微生物的定量往往采取纯培养的办法，该方法虽然准确，但也只能针对那些易培养的微生物，且由于其费时费力，往往难以在实际的生产中应用。

随着分子生物学的发展，人们采取设置内标的办法，在同一管PCR反应中，进行2个独立的PCR扩增反应，这种方法虽说在理论上可行，但也由于其中的竞争、不特异等不确定的PCR反应本身的原因，结果并不理想。

通过荧光原位杂交（FISH）的方法进行定量准确直观，然而，当菌群数量水平较低时，又很难做到定量。

实时荧光定量 PCR技术的问世，解决了上述定量方法的不足，具有特异性更强，能有效解决PCR污染问题，自动化程度更高等优点，实时定量PCR技术已广泛应用于研究自然环境的微生物生态系统中如：土壤、水体、沉积物、活性污泥、肠道等复杂微生物生态系统中重要功能种群的定量研究中(1, 3, 7, 8, 10-14, 16)。

例如，在对人的肠道微生物生态学的研究中，对肠道中各类微生物的定量研究有很多文献报道。

如对肠道中起重要作用的一个功能菌——双歧杆菌（Bifidobacteria）的定量。

健康成人肠道中大约含有1014个细菌细胞，这个数量大约是人体器官细胞数的10倍，如此庞大的微生物量，对人体的健康起着及其重要的作用，而不同个体又有自身所特有的微生物菌群结构。

肠道功能的紊乱往往与肠道微生物菌群结构的变化（失调）紧密相关，那么对肠道菌群的动态变化进行跟踪研究就显得尤为重要。

双歧杆菌是儿童和成人肠道中的重要的优势功能菌之一，可以降解人体不易消化的碳水化合物，可治疗便秘，慢性腹泻，从而保护肝脏，防治高血压和动脉硬化，改善乳糖消化不良症，起营养作用和抗衰老作用。

而儿童和成人体内的数量却有所不同，对这一重要功能菌的定量以及定量地跟踪该菌在不同健康状态下的动态变化具有重要意义。

设计双歧杆菌的专一性（genus- or species-specific）的引物，提取肠道微生物混合的总的基因组DNA，利用SYBR green I 或Taqman探针进行实时的荧光定量，就可以很快速便捷的对一系列动态跟踪的样品进行定量，也可以大规模的平行比较其数量的多少(10)。

Favier等人对不同年龄的人体肠道中乳酸杆菌的量进行了检测(9)。

Bartosch等人对健康老年人和住院老年人，以及抗生素治疗对老年人肠道微生物菌群结构的影响进行了定量检测，发现住院老年人中菌群16S rDNA的拷贝数明显低于健康老年人的，抗生素治疗对菌群结构影响也较大(2)。

Favier等人用该技术结合DGGE连续10个月检测了健康婴儿肠道微生物的演替过程(6)。

乳酸杆菌产生的有机酸被认为是引起牙周脱钙的主要原因，从而引起牙齿脱落，Byun et al. 等人对65例牙龋病人口腔中的乳酸菌进行了定量研究 (4)，发现该类菌确实大量存在于牙龋病人的口腔中。

实时定量PCR技术也被用来分析食草动物食性改变后瘤胃内优势微生物种群的动态变化 (17)。

Pseudoalteromonas species是海洋中的一个非常重要的微生物，与多种海洋真核生物相关，其所产生的活性物质具有抗细菌、除海藻、抗真菌等作用，Skovhus 等人用实时定量的PCR技术对海洋样品中该种群的数量进行了评估 (15)。

Dionisi等人将该技术应用于研究活性污泥中，MLVSS 值在260到2,610 mg/L时，Nitrospira数量的多少(5)。

应用实时定量PCR 技术研究自然界复杂微生物群落中重要功能菌的数量，以及外界条件发生变化时其数量动态变化的检测，诸如此类的研究报道很多，在这里我们以定量猪肠道内拟杆菌的数量为例，介绍实时荧光定量PCR技术的使用方法。

二、实验目的定量待测样品中靶DNA含量的多少及其动态变化。

三、实验材料(1)试剂：Ex Taq酶系统（TaKaRa）标准质粒：拟杆菌16S rDNA特异片断的克隆质粒仔猪肠道微生物总的基因组DNA10 × SYBR green 1 (Amerson)dNTP引物：拟杆菌特异（group-specific）引物无菌双蒸水(2)仪器设备MJ optical 2 real-time 定量PCR仪PCR八联管四、操作步骤1.10倍拷贝数梯度稀释标准的DNA样品（如108，107，106，105），用于制作标准曲线（标准样品一般为经限制性内切酶酶切后的线性质粒）；2.准备好待测DNA样品；3.调配反应液，可能不同的扩增反应需要的扩增条件如Mg2+浓度，引物浓度等不同，需要逐一摸索，这里提供一个一般的条件，试剂加量(µl) ×10148.5 ddH2O 14.8520dNTP 210×Buffer 2.5 25Primer 1 0.5 5Primer 2 0.5 5Template 2 20Taq ase 0.15 1.510×SYBR green 1 2.5 25(23µl 分装)230∑ 254.分装后逐一加入模板，设置阴性对照，设至少3个标准样品，用于生成标准曲线；设置1管阴性对照，其它为待测样品；5.放入到定量PCR仪中，设置样品号，设置程序，运行程序；6.实时查看扩增情况；7.运行结束后，生成标准曲线，记录样品的拷贝数，用于数据分析；8.还可以测定产物的融解曲线，计算其Tm值。

五、注意事项1．标准样品最好为待测目标DNA克隆后的质粒，经酶切为线性DNA, 需要过柱纯化，测定浓度，计算拷贝数，制备好稀释梯度的DNA样品，稀释的好坏直接影响标准曲线的质量，也就直接影响的定量结果的可靠性；2. 操作过程要十分小心，避免分装到八联管时发生污染；3．设定阴性对照。

六、参考文献1. Bach, H.-J., J. Tomanova, M. Schloter, and J. C. Munch. 2002. Enumeration of total bacteriaand bacteria with genes for proteolytic activity in pure cultures and in environmental samplesby quantitative PCR mediated amplification. Journal of Microbiological Methods 49:235-245.2. Bartosch, S., A. Fite, G. T. Macfarlane, and M. E. T. McMurdo. 2004. Characterization ofBacterial Communities in Feces from Healthy Elderly V olunteers and Hospitalized ElderlyPatients by Using Real-Time PCR and Effects of Antibiotic Treatment on the Fecal Microbiota.Appl. Environ. Microbiol. 70:3575-3581.3. Bowers, H. A., T. Tengs, H. B. Glasgow, Jr., J. M. Burkholder, P. A. Rublee, and D. W. Oldach.2000. Development of Real-Time PCR Assays for Rapid Detection of Pfiesteria piscicida and Related Dinoflagellates. Appl. Environ. Microbiol. 66:4641-4648.4. Byun, R., M. A. Nadkarni, K. L. Chhour, F. E. Martin, N. A. Jacques, and N. Hunter. 2004.Quantitative analysis of diverse lactobacillus species present in advanced dental caries. J Clin Microbiol 42:3128-36.5. Dionisi, H. M., G. Harms, A. C. Layton, I. R. Gregory, J. Parker, S. A. Hawkins, K. G.Robinson, and G. S. Sayler. 2003. Power analysis for real-time PCR quantification of genesin activated sludge and analysis of the variability introduced by DNA extraction. Appl Environ Microbiol 69:6597-604.6. Favier, C. F., E. E. Vaughan, W. M. De Vos, and A. D. L. Akkermans. 2002. MolecularMonitoring of Succession of Bacterial Communities in Human Neonates. Appl. Environ.Microbiol. 68:219-226.7. Gerard, C., K. Olsson, R. Ramanathan, C. Reading, and E. Hanania. 1998. Improvedquantitation of minimal residual disease in multiple myeloma using real-time polymerasechain reaction and plasmid-DNA complementarity determining region III standards. CancerRes 58:3957-3964.8. Gruntzig, V., S. C. Nold, J. Zhou, and J. M. Tiedje. 2001. Pseudomonas stutzeri NitriteReductase Gene Abundance in Environmental Samples Measured by Real-Time PCR. Appl.Environ. Microbiol. 67:760-768.9. Guan, L. L., K. E. Hagen, G. W. Tannock, D. R. Korver, G. M. Fasenko, and G. E. Allison.2003. Detection and Identification of Lactobacillus Species in Crops of Broilers of DifferentAges by Using PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 69:6750-6757.10. Gueimonde, M., S. Tolkko, T. Korpimaki, and S. Salminen. 2004. New Real-TimeQuantitative PCR Procedure for Quantification of Bifidobacteria in Human Fecal Samples.Appl. Environ. Microbiol. 70:4165-4169.11. Harms, G., A. Layton, H. Dionisi, V. Garrett, S. Hawkins, K. Robinson, and G. Sayler. 2003.Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant.Environ Sci Technol 37:343-351.12. Hermansson, A., and P.-E. Lindgren. 2001. Quantification of Ammonia-Oxidizing Bacteria inArable Soil by Real-Time PCR. Appl. Environ. Microbiol. 67:972-976.13. Hristova, K. R., C. M. Lutenegger, and K. M. Scow. 2001. Detection and Quantification ofMethyl tert-Butyl Ether-Degrading Strain PM1 by Real-Time TaqMan PCR. Appl. Environ.Microbiol. 67:5154-5160.14. Skovhus, T. L., N. B. Ramsing, C. Holmstrom, S. Kjelleberg, and I. Dahllof. 2004. Real-TimeQuantitative PCR for Assessment of Abundance of Pseudoalteromonas Species in MarineSamples. Appl. Environ. Microbiol. 70:2373-2382.15. Skovhus, T. L., N. B. Ramsing, C. Holmstrom, S. Kjelleberg, and I. Dahllof. 2004. Real-timequantitative PCR for assessment of abundance of Pseudoalteromonas species in marinesamples. Appl Environ Microbiol 70:2373-82.16. Stults, J. R., O. Snoeyenbos-West, B. Methe, D. R. Lovley, and D. P. Chandler. 2001.Application of the 5' Fluorogenic Exonuclease Assay (TaqMan) for Quantitative RibosomalDNA and rRNA Analysis in Sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67:2781-2789.17. Tajima, K., R. I. Aminov, T. Nagamine, H. Matsui, M. Nakamura, and Y. Benno. 2001.Diet-dependent shifts in the bacterial population of the rumen revealed with real-time PCR.Appl Environ Microbiol 67:2766-74.（本章作者：魏桂芳）。

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。

自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。

随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。

本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。

文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。

接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。

文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。

通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。

二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。

其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。

实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。

定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。

实时荧光定量PCR技术

千里之行，始于足下。

Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。

实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。

染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。

荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。

目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。

二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。

2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。

3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。

4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。

三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。

荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。

荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。

实时定量pcr原理

实时定量pcr原理实时定量PCR原理。

实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是一种用于定量检测DNA或RNA的技术，它结合了PCR技术和荧光探针技术，能够在PCR过程中实时监测靶标的扩增情况，从而实现对靶标的定量分析。

本文将介绍实时定量PCR的原理及其在科研和临床中的应用。

实时定量PCR的原理。

实时定量PCR是在传统PCR技术的基础上发展而来的，其核心原理是通过不断测量PCR反应体系中的荧光信号强度来实时监测靶标的扩增情况。

在实时定量PCR中，通常使用荧光探针（如TaqMan探针、SYBR Green等）来标记靶标的扩增产物。

当PCR反应进行时，靶标的扩增产物会不断积累，荧光信号强度也会随之增加。

通过测量荧光信号强度的变化，可以确定靶标的起始量，并进行定量分析。

在实时定量PCR中，荧光信号强度的测量通常是通过实时荧光定量PCR仪来实现的。

这些仪器能够在PCR反应进行的同时，实时监测PCR管中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。

通过分析荧光信号曲线的特征，可以确定靶标的起始量，并计算出靶标在样本中的相对或绝对含量。

实时定量PCR的应用。

实时定量PCR在科研和临床中有着广泛的应用。

在基础科研领域，实时定量PCR常常用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型鉴定等方面。

通过实时定量PCR技术，研究人员可以快速、准确地获取靶标在样本中的含量信息，从而揭示基因表达调控、病原微生物的感染情况、基因型的分布规律等重要信息。

在临床诊断领域，实时定量PCR也被广泛应用于疾病诊断、药物疗效监测、遗传病筛查等方面。

实时定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，能够快速、准确地检测靶标在临床样本中的含量，为临床诊断和治疗提供重要依据。

总结。

实时定量PCR作为一种高效、准确的分子生物学技术，已经成为科研和临床领域中不可或缺的工具。

通过实时监测PCR反应体系中的荧光信号强度，实时定量PCR能够实现对靶标的快速、准确的定量分析，为科研和临床诊断提供了强大的技术支持。