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质粒的体外重组在分子生物学和遗传工程中，质粒的体外重组是一种重要的技术。
通过这种技术，我们可以将两个或多个质粒进行重组，以创建具有新特性的质粒。
以下是质粒体外重组的步骤和相关内容。
1.准备质粒样品在进行体外重组之前，我们需要准备所需的质粒样品。
这些样品可以是细菌菌落、细菌培养液或经过纯化的质粒。
如果使用菌落或培养液，我们需要通过细菌的分离和培养来获得纯的质粒。
如果使用纯化的质粒，我们需要确保其质量和数量满足实验需求。
2.构建反应体系在进行体外重组时，我们需要构建一个反应体系，其中包括用于重组的质粒样品、限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其他必要的缓冲液和底物。
限制性核酸内切酶用于切割质粒和供体DNA，而DNA连接酶用于将它们重新连接在一起。
3.热激法或退火法处理在反应体系构建完成后，我们需要通过热激法或退火法处理来促进重组。
热激法通常用于将高温处理过的供体DNA插入到感受态细菌中，而退火法用于将低温处理过的供体DNA插入到细菌中。
4.转化入大肠杆菌在处理完成后，我们需要将重组的质粒转化入大肠杆菌中。
转化过程通常包括将重组质粒与大肠杆菌混合、添加钙离子、进行孵育和离心等步骤。
这些步骤有助于将重组质粒导入大肠杆菌中。
5.重组质粒的提取和检测在转化完成后，我们需要提取并检测重组质粒。
提取过程通常包括细胞裂解、去除杂质和纯化等步骤。
检测可以通过电泳、限制性分析、PCR等方法进行，以确保重组质粒的正确性和完整性。
6.质粒的扩增和纯化在提取和检测完成后，我们需要对重组质粒进行扩增和纯化。
扩增可以通过在大肠杆菌中进行培养来实现，而纯化则可以通过离子交换、凝胶电泳等方法进行。
这些步骤有助于提高重组质粒的质量和产量。
7.质粒的鉴定和分析在扩增和纯化完成后，我们需要对重组质粒进行鉴定和分析。
鉴定可以通过限制性分析、电泳、测序等方法进行，以确定重组质粒的结构和序列。
分析可以通过基因表达分析、功能研究等方法进行，以评估重组质粒的生物学活性。
基因克隆的主要方法目的基因是指要研究其生物学功能的一段编码特定蛋白的DNA 序列。
在基因克隆中，首先需要利用分子生物学技术，将目的基因从染色体上分离出来，获得基因序列并构建到载体上。
一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。
正向遗传学途径以克隆的基因所表现的功能为基础，通过基因的表达产物或表型性状鉴定进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则是着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的进一步发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。
简单地说，正向遗传学是从表型变化到基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
目前，在农业生物技术领域，已经从玉米、水稻、油菜、小麦、拟南芥、烟草、番茄等多种植物与动物及微生物中克隆得到了许多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。
1.功能克隆利用蛋白质的表达和功能信息分离鉴定出未知基因的方法称为未知基因的功能克隆（functional cloning）。
功能克隆法是根据性状的基本生化特征，鉴定已知基因的功能后分离目标基因的一种方法，该法是人类采用的第一个基因克隆策略。
其基本过程为：分离纯化感兴趣的蛋白质并测定部分氨基酸序列，设计相应的抗体待用；分离可能含有该蛋白的组织，提取RNA 和mRNA 进行体外翻译，在蛋白合成过程中，加入已制备的抗体，此时正在合成的该蛋白连同其模板mRNA 一同被沉淀；用蛋白酶消化沉淀中的蛋白质得到mRNA，进行反转录得到cDNA，进行测序获得要克隆的基因编码序列。
如果用功能克隆同源基因，其基本过程为：根据已知序列制备核苷酸探针或者蛋白抗体，杂交筛选cDNA文库或基因组文库，或者使用相应蛋白的抗体探针，筛选表达载体构建的cDNA 文库获得相应克隆，对选中的克隆进行测序，获得目的基因序列。
功能克隆的关键在于需要先分离出纯度高的蛋白质，测定其部分氨基酸序列或得到相应抗体；其次构建cDNA 文库或者基因组文库。
实验七DNA体外重组技术一．概念DNA重组：指不同来源的DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA 分子遗传信息的新的重组体DNA。
DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA 的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。
DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。
二．基本过程For personal use only in study and research; not for commercial use分、切、连、转、筛1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。
①目的基因的来源：ⅰ。
直接分离适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒DNA的提取分离。
首先通过组建几种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电泳分离DNA，应用相应DNA探针确定目的DNA后，从胶中回收DNA。
ⅱ。
人工合成序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成。
ⅲ。
由mRNA逆转录合成cDNA细胞总RNA分离mRNA分离目的基因mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成cDNA发卡环的消化cDNA的克隆ⅳ。
从基因组文库中筛选目的基因首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库（C文库），需要时利用探针技术将所需目的基因“钓”出来。
ⅴ。
PCR②载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。
理想的质粒克隆载体应具有的特性：ⅰ.能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增ⅱ.具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS, multiple cloning sites)，便于进行克隆ⅲ.分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制ⅳ.易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。
如抗生素抗性、α-互补显色反应（蓝白斑筛选）ⅴ.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件ⅵ.生物安全性好目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
分子生物学中的克隆策略克隆技术是分子生物学中应用最广泛的一项技术，其在基因工程、治疗、疫苗和药物研发等领域都有着重要的应用。
具体来说，克隆技术主要是指在体外复制和扩增特定DNA序列的过程。
为了实现有价值的克隆，需要选择合适的克隆策略。
一、催化剂-下游PCR法PCR是分子生物学实验室中最常用的技术之一，其可以扩增DNA的片段。
但是，PCR方法具有一定的局限性，PCR扩增的DNA片段长度不宜过长，而且与RNA结合后再翻译会产生较大的误差。
考虑到此种情况，研究者便设计了催化剂-下游PCR法。
在这种克隆策略中，研究者首先在DNA末端加入适当的序列标记（例如，带有限制酶切位点的标记），并在PCR反应体系中添加在另一条DNA链上特异性结合的相应催化剂，通过PCR扩增特定长度的DNA片段。
此外，在克隆过程中应注意，催化剂不能过多，否则可能引发非特异性放大，导致产物不纯。
二、限制酶-连接PCR法限制酶-连接PCR法是一种基于限制酶嗣中的DNA连接技术的克隆策略。
此种策略中，研究者在目标DNA的两端加入相同的限制酶切割位点，然后使用相应的限制酶处理目标DNA和载体DNA，以及用T4 DNA连接酶连接。
通过连接后，将连接后的目标DNA插入到适当的载体上并导入所需的表达宿主，如大肠杆菌（E. coli）, 单细胞藻等。
这种方法的优点是适用于大片段DNA的克隆，具有比较高的克隆效率和精确度。
此外，使用脚印标记探测目标DNA和核心连接位的研究也具有极大的借鉴意义。
三、COLD-PCR技术肿瘤组织中富含突变，突变基因的测序需要进行高度敏感的检测。
在这种情况下，COLD-PCR技术可以带来巨大的帮助。
COLD-PCR技术基于常规PCR方法进行改进，该策略使用高选择性扩增，以扩大突变基因，减小野生型基因，以达到高灵敏度检测突变基因以及基因突变率的效果。
通过这种技术，可以分离出包含目标突变基因的DNA片段，随后再进行DNA测序，以更好地理解该突变基因的生物学特性和相关性。
第四章克隆策略与体外重组一、填空题1．克隆策略有三层涵义：(1)第一层是—--------------—；(2)第二层涵义是—----------------—；(3)第三层涵义就是-------------------- 。
2．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：(1)—-----------------—(2)——------------------(3)—------------------—。
3．现有的基因克隆策略大体上分为三类：—--------------—、—------------—、—--------------—。
4．受体细胞的感受态是—--------------—。
5． DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)—---------------—(2)—------------—(3)————————————（4)—--------------------—。
6．平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比黏性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端DNA连接的效率。
常用的凝聚剂是--------------——。
7．一个细菌的表面大约有—-----------—个同DNA结合的位点。
8． 1984年,Hung和Wesink发现如果两个不同的5’黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端，即可有效地相互连接：(1)—---------------—(2)—----------------— (3)——----------------。
9．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个—-------------—，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个—---------------—。
10．将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个—----------—，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个—-------------------—。
11．在构建cDNA克隆之前，可以用—-----------—来富集一特殊的核苷酸序列。
做法是用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA 分子杂交。
12．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用——技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。
13．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用—---------—可以将这段DNA进行百万倍的扩增。
14．SD序列是mRNA分子中同——结合的序列，其结构特征是—----------—的全部或一部分。
15．环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链DNA转化效率的—-----------—。
16．cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用—---------—为模板通过反转录成一个双链的、无——的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。
17．产生平末端的方法有：（1）----------------------（2）---------------------（3）----------------------。
18．不同细菌出现感受态的时期是不同的，如肺炎球菌感受态出现的时期是--------------、而枯草杆菌感受态的出现是在---------------------- 。
19．人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为—----------—时吸附DNA，—-------—时摄入DNA。
20．感受态细胞是可以诱导的，诱导的方法有—---------—、—----------------—、------------。
21．影响酶切的主要因素之一是底物DNA，底物的影响包括—------------------—，---------------------—，-----------------------，----------------。
22．salI是识别6个核苷酸的酶，其识别切割的理论值是——个碱基就有一个切点，但在哺乳动物中，大约——才有一个切点。
23.在精简基因组文库中，用标记的—------—同未标记的—----------—杂交，最后建成的是——————————库。
24．构建基因组文库时连接方法主要是—-------—；而构建cDNA文库，可用----------或一-------- 。
25．将携带有外源基因并能持久传递给子代的动物称为—---—动物，这些外源基因就叫做————————。
26．提高重组DNA分子对E．coli的转化效率，通常可采取—----------------—处理和-----------------------一。
二、判断题1．外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后，这个基因不再有任何功能。
2．用不同的产生黏性末端的限制性内切核酸酶分别切割载体和外源DNA，得到的黏性末端是不亲和的黏性末端。
3．基因组DNA文库是含有某一生物中全部DNA序列随机克隆的克隆群，而cDNA文库是含有某一生物中所有表达基因随机克隆的克隆群。
4．CDNA克隆较之基因组克隆最重要的优越性就是它们含有一个基因的完整序列。
5．通过差示杂交后制备的CDNA文库使克隆那些只在特定分化细胞表达基因的几率大为提高。
6．在染色体步移中，可通过DNA测序知道已到达所感兴趣的基因。
7．一旦有了一套已知顺序的基因组克隆，通过从文库中获得覆盖目的突变基因所在基因组区的所有克隆，就可以进行染色体步移。
8．根据遗传连锁作图把基因定位在基因组中是定位克隆的第一步，它为分离特定的人的基因提供了一个直接而快速的方法。
9．人工感受态和自然感受态细胞都能吸收线性和环状单链DNA。
10．人工导入基因和正常染色体基因间的同源重组，可以发生基因置换。
11．为了保证重组DNA分子在受体细胞中能够稳定地独立存在下来，通常用rec-r-m-表型的细胞株作为受体菌。
12．线性DNA片段被导人哺乳动物细胞后，在细胞内酶的作用下，很快相互连接成重复的DNA大片段，并能在随机位点整合到染色体中。
13．不匹配的黏性末端是不能通过黏性末端连接的。
14．用限制性内切核酸酶切割载体、供体DNA后，要加入EDTA-SDS中止液使限制性内切核酸酶失活，这样有利于重组连接。
15．限制性内切核酸酶BglⅡ识别的序列为A↓GATC丁， BamHI识别的序列为G↓GATCC，用它们分别切割载体DNA和供体DNA，不必使酶失活，就可以直接通过黏性末端连接法进行连接。
16．具有EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRⅡ末端的载体中。
17．不匹配的黏性末端可以通过部分填补后进行连接。
18．低丰度的mRNA不仅拷贝数少，而且种类也少。
19．同聚物接尾法构建重组体，不仅连接效率高，而且也很容易回收插人的片段。
三、选择题(单选或多选)1．重叠群(contig)是一群克隆，在这个克隆群体中各个体( )(a)相互之间重叠(b)都是来自不同生物的克隆(c)插入片段位于不同染色体的不同区段(d)位于同一染色体的不同区段2．根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。
在下列文库中， ( )是cDN A文库(a) YAC文库(b) MAC文库(c) 扣减文库(d) BAC文库3．下面关于多克隆位点(multipleclonesite,MCS)的描述，不正确的一句是( )(a)仅位于质粒载体中(b)具有多种酶的识别序列(c)不同酶的识别序列可以有重叠(d)一般是人工合成后添加到载体中4．部分填补是DNA体外重组中常用的一种技巧，填补时应( )(a)控制DNA聚合酶的用量(b)控制酶反应的时间(c)限制dNTP的种类(d)注意只能填补载体5．在下列限制性内切核酸酶中，( )的识别序列中有松弛碱基，选用这种酶时要考虑连接后外源DNA的插入方向。
(a)HindⅢ(b)EcoRⅡ(c)BamHI(d)Pstl6． EcoRI切割载体DNA和供体DNA所产生的片段在用于重组连接前要( )。
(a)用65℃处理5～10分钟使限制性内切核酸酶失活(b)用CIP处理载体DNA防止自身环化(c)进行琼脂糖凝胶电泳监测(d)上述说法都正确7．在cDNA技术中，所形成的发夹环可用( )(a)限制性内切核酸酶切除(b)用3’外切核酸酶切除(c)用S1核酸酶切除(d)用5’外切核酸酶切除8．在DNA的酶切反应系统中，通常：( )(a)用SSC缓冲液(b)加入Mg2+作辅助因子(c)加入BSA等保护剂(d)上述说法中，有两项是正确的9．黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( )(a)产生新切点 (b)易于回收外源片段(c)载体不易环化 (d)影响外源基因的表达10．在下列表型中，( )是基因工程上理想的受体菌表型(a)r+m+rec’(b)r-m-rec-(C)r-m-rec+(d)r+m+rec-11．关于DNA接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确?( )(a)给外源DNA添加适当的切点(b)人工构建载体(c)调整外源基因的可读框(d)增加调控元件12．DNA的结构对转化的影响很大，一般说来，转化效率最高的是：( )(a)完整的线性双链DNA(b)单链线性DNA(c)完整的环状双链DNA(d)开口的双链环状DNA13．cDNA文库包括该种生物的( )(a)某些蛋白质的结构基因(b)所有蛋白质的结构基因(c)所有结构基因(d)内含子和调控区14．下列关于建立cDNA文库的叙述中，哪一项是错误的?( )(a)从特定组织或细胞中提取DNA或RNA(b)用反转录酶合成mRNA的对应单链DNA(c)以新合成的单链DNA为模板合成双链DNA(d)新合成的双链DNA甲基化15．下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的? ( )(a)操作方便 (b)易于回收片段(c)易于定向重组 (d)载体易于自身环化，降低重组率16．关于cDNA的最正确的提法是：( )(a)同mRNA互补的单链DNA (b)同mRNA互补的双链DNA(c)以mRNA为模板合成的双链DNA (d)以上都正确17．关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?( )(a)具有可诱导性(b)具有可转移性(c)细菌生长的任何时期都可以出现(d)不同细菌出现感受态的比例是不同的四、简答题1． cDNA克隆与基因组克隆有何不同?2．怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去?3．有哪些可能的原因使一个基因在DNA库中丢失?4．简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。
5．一个双链DNA分子(为5’突出端)可采用哪些方法使之加上dAl00～120的尾巴?6．酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构?7．何谓YAC?主要特性是什么?8． Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里?9．在构建cDNA文库时，为什么常用GC接尾而不用AT接尾法连接?10．用限制性内切核酸酶切割DNA后，经电泳检查，发现有拖尾现象，其可能的原因是什么?11．欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题?12．假定你分离到一个E．coli的Thy-突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。
