大鳞副泥鳅(2n♀)×泥鳅(4n♂)杂种后代染色体带型及FISH分析
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大鳞副泥鳅(2n♀)×泥鳅(4n♂)杂种后代染色体带型及FISH 分析收稿日期：2011-04-28基金项目：辽宁省科学技术计划重大、重点项目（2008203001）作者简介：贾光风（1982-），男，助理工程师，学士，研究方向为水产养殖。
*通讯作者：李雅娟，教授，研究方向为水产动物遗传育种。
E-mail:liyajuan@贾光风1，李雅娟2*，钱聪2，高敏2（1.大连市甘井子区农林水利和海洋渔业局中国海监甘井子区大队，辽宁大连116033；2.大连海洋大学生命科学与技术学院，辽宁大连116023）摘要：文章对二倍体大鳞副泥鳅♀×四倍体泥鳅♂杂交后代的染色体进行Ag-NORs 、CMA3/DA/DAPI 及FISH 等系列研究。
结果表明，①在对照组泥鳅×泥鳅（2n×2n ）杂交后代的间期核和中期分裂相中最高银染点数为2个，杂交组2n×4n 杂种后代的间期核和中期分裂相中最高银染点数为3个；②在对照组2n×2n 杂交后代有丝分裂中期分裂相中，2条中部着丝粒染色体（M ）的端部区域显示有明亮的CMA3阳性部位，杂交组2n×4n 杂种后代有丝分裂中期分裂相中3条中部着丝粒染色体（M ）的端部区域显示明亮的CMA3阳性部位；③应用荧光原位杂交（FISH ）技术可以将核糖体5.8S+28S rDNA 清楚地定位在杂交后代中期染色体中部着丝粒染色体（M ）的端部区域。
在对照组2n×2n 中期染色体上可以检测到二簇杂交信号，而在杂交组后代中期染色体上可以检测到三簇杂交信号。
通过Ag-NORs 、CMA3/DA/DAPI 荧光显带及核糖体5.8S+28S rDNA 的FISH 定位在杂交后代得到的NORs 位点相吻合，位点数目为3个。
该结果为杂种后代提供了直接的三倍体细胞遗传学证据。
关键词：大鳞副泥鳅；泥鳅；四倍体；Ag-NORs ；CMA3/DA/DAPI ；FISH中图分类号：S917文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2011）09-0072-04Chromosome banding and FISH with rDNA probe in Paramisgurnus dabryanus (2n ♀)×Misgurnus anguillicaudatus (4n ♂)/JIA Guangfeng 1,LI Yajuan 2,QIAN Cong 2,GAO Min 2(1.China Marine Surveillance Corp of Ganjingzi District,Agricultureand Forestry Irrigation Bureau,Ganjingzi District Dalian,Dalian Liaoning 116033,China;2.Life Sci-ence and Technology Institute,Dalian Ocean University,Dalian Liaoning 116023,China)Abstract:Chromosomes of breedings of the diploid Paramisgurnus dabryanus and tetraploidMisgurnus anguillicaudatus were analyzed by staining with Ag,chromomycinA3(CMA3)/distamycin A(DA),and DA/4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),and using fluorescence in stu hybridization (FISH)with 5.8S+28SrDNA as a probe.Results were as follows:(1)The maximum number of Ag-NORs weretwo in both interphase and metaphase in the control group 2n ×2n,while they were both three in thecross 2n×4n;(2)CMA3positive sites were two in 2n×2n,on the telomeric position of the short arms of Mchromosomes,while four positive sites in 2n×4n were detected on the same location.(3)By FISH,5.8S+28SrDNA signals were clearly detected in the above telomeric Ag-NOR and CMA3-positive sites in theshort arms of M chromosome pair or trio.Two signals were detected in the control group,and three inthe cross group.FISH position of ribosomal 5.8S+28S rDNA in hybrid progenies was corresponding withthe results of Ag-NORs,CMA3/DA/DAPI,and the number were all three.Results provided an cytoge-netic proof that the hybrid progenies were triploid.Key words:Paramisgurnus dabryanus ;Misgurnus anguillicaudatus ;tetraploids;Ag-NORs;CMA3/DA/DAPI;FISH第42卷第9期东北农业大学学报42(9):72~752011年9月Journal of Northeast Agricultural University Sep.2011泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）和大鳞副泥鳅（Pararnisgurn dabryanus）是我国常见的小型经济鱼类。
近几年来，随着市场经济的发展和出口量的不断增加，再加上自然水域环境受到人为的破坏，生产量逐年下降，很难满足市场的需求。
目前养殖规模逐年扩大，已经成为目前主要的养殖品种。
因此，良种的选育就显得十分重要。
人工诱导三倍体鱼类以其育性差、生长快等特性而成为鱼类遗传育种研究的热点。
但人工诱导三倍体等方法存在产量低、不稳定和难操作的特点，无法满足产业化的要求。
四倍体被认为是三倍体产业化发展的关键，因为利用四倍体与二倍体杂交理论上可以产生100%的三倍体。
目前，有关大鳞副泥鳅和泥鳅杂交的受精细胞学、染色体变化及遗传分析已有报道[1-3]，但关于杂交后代分子细胞遗传学方面的研究未见报道。
因此，本文通过对二倍体大鳞副泥鳅和四倍体泥鳅的杂交后代的染色体进行Ag-NORs、CMA3/DA/DAPI及FISH等系列分析，旨在为杂交后代提供直接的三倍体细胞遗传学证据，也为大规模生产全三倍体泥鳅提供有效途径。
1材料和方法1.1亲鱼的采集泥鳅（4n）来自湖北省洪湖市,大鳞副泥鳅和泥鳅（2n）来自大连农贸市场。
其倍性经血红细胞核体积测量、流式细胞仪检测确定。
实验室水族箱暂养，暂养温度为（25±1）℃。
1.2人工催产及授精挑选性腺发育良好的泥鳅（2n和4n）和大鳞副泥鳅（2n）注射绒毛膜促性腺激素（HCG）（注射剂量：♀20-25IU·g-1，♂减半），12h后轻压大鳞副泥鳅（2n）及泥鳅（2n）腹部即有卵排出，分别收集于不同的9cm培养皿中，泥鳅（2n、4n）按生殖孔下边两侧，用毛细管分别收集精液于塑料离心管中（用淡水生理盐水稀释100倍），干法授精。
试验分为2组，即杂交组大鳞副泥鳅×泥鳅（2n×4n）和对照组泥鳅×泥鳅（2n×2n）。
应该有大鳞副泥鳅（2n×2n）与泥鳅（4n×4n）作为双对照，否则和以证明三倍体的带型介于二倍体和四倍体之间。
1.3幼鱼培育孵化和幼鱼培育的温度为（25±1）℃。
经常更换曝气的水，保持室内空气新鲜和流通。
及时用吸管吸出死亡的胚胎。
1.4染色体标本制备取发育眼胞期的胚胎30~50个，用镊子去卵膜和卵黄放入盛有0.0025%的秋水仙素中处理45min，0.8%的柠檬酸低渗20min，卡诺固定液（甲醇 冰醋酸=3 1）固定，冷冻过夜。
冷滴片，镜检。
-80℃冰箱冷冻保存。
1.5银染（Ag-NOR）参照Howell and Black的快速银染法进行[4]。
50%硝酸银与2%明胶（内含1%甲酸）以2 1混匀后滴在染色体标本上，加盖片后，于70℃温箱内处理2min。
当整张玻片呈棕黄色时取出，流水冲去盖片，干燥后镜检。
1.6CMA3/DA/DAPI三重荧光染色参照Schweizer和Schweizer的方法[5-6]，略有改动。
0.5mg·mL-1Chromomycin A3（CMA3）染色40 min，MacIlvaine buffer（MI，pH7）漂洗2次，0.1 mg·mL-1Distamycin A（DA）染色15min，MI缓冲液漂洗2次，0.5μg·mL-14,6-diamidino-2-pheny-lindole（DAPI）染色15min,MI缓冲液漂洗2次,甘油和MI缓冲液1 1封片，荧光显微镜下观察拍照。
1.7染色体荧光原位杂交（FISH）本试验采用Fujiwara的荧光原位杂交（FISH）技术方法并稍加修改[7]。
从-80℃冰箱中取出染色体标本，放入65℃恒温箱干燥2h。
染色体标本放入70℃的70%甲酰胺/ 2XSSC（pH7.0）溶液中处理2min，迅速移入-20℃预冷的装有70%酒精的染色缸内脱水10min，再移入100%的-20℃预冷酒精内脱水5min，空气干燥。
把人的5.8S+28SrDNA探针用生物素（Biotin-11-dUTP）进行标记。
标记后的探针用酒精进行纯化，100%脱离子甲酰胺溶解，75℃处理10 min，迅速移到冰水中。
变性后的探针加入杂交混合液中，混匀后取40μL滴到变性后的染色体标本上，覆上封口膜后放入37℃恒温箱中杂交一个晚上。
轻轻揭掉封口膜，染色体标本放入500%甲酰胺/2×SSC溶液42℃漂洗20min，2×SSC室温漂洗20min，1×SSC室温漂洗20min，4×SSC室温漂洗5min。
