组织对氧磷酶1(PON1)有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂盒
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对氧磷酶与癌关系的研究进展页数:3
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组织及血液酸性磷酸酶(ACP)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
组织及血液酸性磷酸酶（ACP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC2130规格：50T/24S产品内容：提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体30mL×1瓶，4℃避光保存，变成蓝绿色不能使用。
标准品：液体1mL×1支，2μmol/mL酚标准液，4℃保存。
临用前蒸馏水稀释至0.5μmol/mL备用。
产品说明：ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸，常见于巨噬细胞的溶酶体内。
ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。
在酸性环境中，ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚，苯酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算ACP活性。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、粗酶液提取：称取约0.1g组织，加提取液1mL充分研磨，4℃、10000rpm离心10min，取上清液待测。
血液可直接用于测定，如果浓度高的话，用提取液稀释。
二、测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。
2.试剂一置于37℃水浴中预热30min以上。
试剂名称（μL）测定管对照管空白管标准管蒸馏水--100-0.5μmol/mL标准品---100上清液100---试剂一200200200200试剂二200200200200混匀后置于37℃水浴中保温15min试剂三600600600600上清液-100--混匀后于510nm测定吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管。
三、ACP活性计算：1.按蛋白浓度计算活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
PON1基因在肝细胞癌中的表达及其对临床预后的意义和免疫浸润分析
PON1基因在肝细胞癌中的表达及其对临床预后的意义和免疫浸润分析龙小玲;卜昆鹏;曹昭;黄军强;马彩芳;卢秋龙;曾焕;张云;舒宏【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2024(28)4【摘要】目的探索人对氧磷酶-1(PON1)基因在肝细胞癌(HCC)的表达及其对临床预后的意义和免疫浸润分析。
方法首先使用在线数据库TIMER、HCCDB和Kaplan-Meier Plotter,获得HCC患者PON1的基因表达水平及预后价值。
并收集2011年4月至2015年6月在广西医科大学附属肿瘤医院接受手术治疗的90例HCC患者的癌及癌旁肝组织,检测PON1基因表达水平,结合临床相关参数,采用Cox回归分析,筛选与肝癌患者预后有意义的参数并构建预后模型。
最后进行相关性分析,评估免疫细胞浸润特征。
结果PON1的基因表达水平在HCC组织中均显著低于癌旁,且PON1低表达与HCC的预后不良相关(P<0.05)。
PON1 mRNA水平、BCLC分期、CNLC分期、T分期、微血管侵犯(MVI)数量、血管侵犯、血清AFP水平与HCC预后显著相关(P<0.05)。
BCLC分期、血清AFP、PON1 mRNA 表达水平是HCC患者预后的独立危险因素。
联合三个指标建立的1、2、3年总生存期预后列线图模型具有良好的预测性能及临床实用价值(C-index=0.757)。
免疫浸润分析显示,PON1与HCC中多种免疫浸润细胞显著相关(P<0.05)。
结论低表达的PON1可作为肝癌患者预后不良的潜在标志物,PON1联合血清AFP水平、BCLC分期构建的预测模型,可有效预测肝癌患者预后。
【总页数】6页(P405-410)【作者】龙小玲;卜昆鹏;曹昭;黄军强;马彩芳;卢秋龙;曾焕;张云;舒宏【作者单位】广西医科大学附属肿瘤医院;广西医科大学第一附属医院【正文语种】中文【中图分类】R735.7【相关文献】P39在肝细胞癌中的表达及其与预后、免疫浸润的相关性分析2.基于生物信息学分析STMN1基因在肝细胞癌中预后及免疫浸润的临床意义3.PLA2G7基因在宫颈癌中的表达及与临床预后和免疫浸润的关系4.RRM2在肝细胞癌中的表达及其与预后、免疫浸润的相关性分析5.TREM2在肝细胞癌中的表达与预后、免疫浸润及药物敏感性的分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
活性氧检测试剂盒 说明书
北京索莱宝科技有限公司
活性氧检测试剂盒 Reactive oxygen species assay kit
货号：CA1410
规格：100-500T
产品内容：
10 mM DCFH-DA in DMSO 活性氧供体 说明书
0.1 ml 1 ml 1份
20 ºC 保存 20 ºC 保存
产品简介：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化
物(O2•−, H2O2, •OH, ONOO−, •NO)等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过
程。采用 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用也是较灵敏的细胞内活性氧检探针。
DCFH-DA 没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为 dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在时 DCFH 被氧化
3. PBS 洗涤细胞 2 次。 三、荧光检测
采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表活性氧水平。也可进行微板荧 光分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每 10 分钟分时逐点检测荧光强弱。对于流式细 胞仪可将细胞用胰酶消化 PBS 洗涤后重悬检测。
1. 加入 DCFH-DA 于培养基，推荐初始工作浓度为 10 µM。对不同的细胞和处理，DCFH-DA 工作浓度可 为 100 nM~20 µM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 对细胞 的影响。以 DMSO 作为溶剂对照。
2. 37 ºC 孵育细胞 30min~至几个小时，通常 30-60min 即可。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、 DCFH-DA 浓度有关。
活性氧检测试剂盒 Reactive oxygen species assay kit
货号：CA1410
规格：100-500T
产品内容：
10 mM DCFH-DA in DMSO 活性氧供体 说明书
0.1 ml 1 ml 1份
20 ºC 保存 20 ºC 保存
产品简介：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化
物(O2•−, H2O2, •OH, ONOO−, •NO)等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过
程。采用 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用也是较灵敏的细胞内活性氧检探针。
DCFH-DA 没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为 dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在时 DCFH 被氧化
3. PBS 洗涤细胞 2 次。 三、荧光检测
采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表活性氧水平。也可进行微板荧 光分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每 10 分钟分时逐点检测荧光强弱。对于流式细 胞仪可将细胞用胰酶消化 PBS 洗涤后重悬检测。
1. 加入 DCFH-DA 于培养基，推荐初始工作浓度为 10 µM。对不同的细胞和处理，DCFH-DA 工作浓度可 为 100 nM~20 µM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 对细胞 的影响。以 DMSO 作为溶剂对照。
2. 37 ºC 孵育细胞 30min~至几个小时，通常 30-60min 即可。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、 DCFH-DA 浓度有关。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
3、荧光检测： ①、将上述收集好的细胞沉淀用 PBS 重悬，并用于检测；
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
ATP酶活性检测试剂盒
ATP酶活性检测试剂盒（样本无需高速离心样本无需高速离心，，可测Na+k+、Ca2+Mg2+、Ca2+、Mg2+_ATPase)说明书修订日期：2019.01.22 Cat number：KGT026Store at -20 for for 6 months℃For Research Use Only（科研专用）一、试剂盒介绍ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用。
本试剂盒的测定原理是依据ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。
本试剂盒可测不需要高速离心的红细胞膜以及不需要高速离心的组织匀浆中的ATPase。
二、试剂组份组份名称KGT02650tests保存条件试剂A 10mL×3试剂B 10mL×1试剂C 10mL×12-8℃试剂D 粉剂×3 -20℃试剂E 粉剂×1试剂F 粉剂×12-8℃试剂G 10mL×2 RT试剂H 粉剂×3试剂I 粉剂×12-8℃试剂J：2.5 mol/L 硫酸100mL×1 RT 试剂K：10 m mol/L 标准磷储液10mL×1 2-8℃试剂D：-20℃以下保存6个月。
用时每支加双蒸水至5ml，现用现配。
余下的-20℃以下可保存一周。
试剂E：用时每支加双蒸水至5ml，适当加热溶解，4℃保存3个月。
试剂F：用时每支加双蒸水至10ml[注1]，充分加热使其完全溶解，室温保存。
试剂H：用时每瓶加双蒸水至40ml溶解，（溶解后避光4℃可保存一周）。
试剂I：用时加水至100ml溶解，室温保存3个月。
0.5umol/ml标准磷工作液配制：用时将试剂K作20倍稀释: 取0.5ml加蒸馏水定容至10ml。
定磷剂的配制：按双蒸水：2.5mol/L硫酸：试剂H：试剂I=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
细胞对氧磷酶1(PON1)芳香酯酶活性比色法定量检测试剂盒产
细胞对氧磷酶1（PON1）芳香酯酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞对氧磷酶1（PON1）芳香酯酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过对氧磷酶1反应系统中，水解有机磷酸，释放出对硝基苯产物，出现吸光峰值的变化，即采用光度法来测定细胞样品中酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种动物和人体细胞裂解悬液样品对氧磷酶1的有机磷酸酶活性检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景对氧磷酶（parapxonase；PON；EC3.1.8.1）是一种水解酯类（esters）、有机磷酸酯（organophosphate）和内酯（lactone）的多态性酶，分成三个亚型：PON1、PON2、PON3。
结构同源性在基因层面上达70%，在氨基酸层面上达65%。
其中PON1，为钙离子依赖性和高密度脂蛋白（high density lipoprotein；HDL）相关性糖蛋白，含有354氨基酸，43Kd分子量，分布在肝脏、肾脏、小肠和血清（50毫克/升）中。
具有有机磷酸酶（organophosphtase）、磷酸三酯酶（phosphotriesterase）、芳香酯酶（arylesterase）和硫内酯酶（thiolactonase）等多重活性：PON1与HDL结合，水解各种LDL和HDL上的氧化性磷酯，以及芳香族羧酸酯、芳香族和脂肪族内酯等，例如杀虫剂对硫磷（parathion）降解产物对氧磷（paraoxon）、毒死蜱（chlorpyriphos）、神经毒因子沙林（sarin）和索曼（soman）、同型半胱氨酸（homocysteine）硫内酯、二氢香豆素（dihydrocourmarin；DHC）、γ-丁内酯（γ-butyrolactone）等，延缓和抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein；LDL）氧化作用，阻止脂质过氧化物产生，保护脂蛋白以及质膜受到氧化损伤，达到抗粥样硬化（antiatherogenic）、解毒、抗氧化的功能。
紫外可见光分光光度计酶活性测定的实验流程和方法
葡萄糖 + ATP
己糖激酶 / Mg 2+
葡萄糖-6-磷酸 + ATP
葡萄糖－６－磷酸脱氢酶
葡萄糖-6-磷酸 + NADP
6-磷酸葡萄糖 + NADPH2
图 2：葡萄糖或 ATP 的间接酶检测 两种物质可以通过己糖激酶和葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶催化的偶联反 应得以确定（偶联测试系统 [1]）。通过生成的 NADPH2 的量来计算 两种物质的量。
糖酵解 几乎所有生物新陈代谢的一个中间环节就是葡萄糖分别在细 胞的细胞液或细胞质内进行的酶促降解。这一过程叫做糖酵 解。葡萄糖通过分步反应转化为 2 分子的丙酮酸。1 分子的 葡萄糖生成 2 分子的 ATP 和 2 分子以 NADPH2 形式存在的 氧化还原产物。然后，丙酮酸进入初步代谢途径，即丙酮酸 循环，进一步生成呼吸链的还原产物，最终转化为氧。最终 的降解产物是 H2O 和 CO2。
3C
迟”（Delay））加入己糖激酶开始的，总共检测时间为 6 分钟。
实验参数是根据初步实验使用 “单波长λ- 连续”（Singleλ-
continuous）（见上）设定的。以下公式分别用于计算酶活
性和底物浓度：
图 3：活性测定选项 A) 单波长λ- 连续 B) 简单动力学 C) 高级动力学 （Singleλ- continuous） （Simple kinteics） （Advanced kinetics）
Tris 缓冲液 pH 7.0 MgCl2 葡萄糖 NADP+ ATP 己糖激酶 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶
以上溶液均使用分子生物学用水进行制备，并在 Eppendorf IsoPack 冰盒中以 4 °C 保存。Tris 缓冲液在室温下保存。酶 在使用后立即放回冰箱。
人对氧磷酶PON酶联免疫分析试剂盒使用方法
人对氧磷酶(PON)酶联免疫分析试剂盒使用方法检测范围：96T3 nmol/L -80 nmol/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中对氧磷酶(PON)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人对氧磷酶(PON)水平。
用纯化的人对氧磷酶(PON)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入对氧磷酶(PON)，再与HRP标记的对氧磷酶(PON)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的对氧磷酶(PON)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人对氧磷酶(PON)浓度。
标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
Caspase1活性检测试剂盒比色法
试剂盒中提供了 caspase 1 催化产生的黄色产物 pNA，可以作为定量 caspase 1 酶活性的标 准品。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过 100µL 的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以 检测 20 个样品。
试剂准备 1. 裂解液融化后混匀并置于冰浴上备用。 2. 检测缓冲液融化后混匀并置于冰浴上备用。
气泡。随后再加入 10µL Ac-YVAD-pNA(2mM)。
3. 加入 Ac-YVAD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37°C 孵育 60-120min。发
ห้องสมุดไป่ตู้
现颜色变化比较明显时即可测定 A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可
以孵育过夜。
4. 样品的 A405 减去空白对照的 A405，即为样品中 caspase 1 催化产生的 pNA 产生的吸光度
二. 样品的收集： 1. 对于悬浮细胞：将没有诱导凋亡的对照品和诱导凋亡的样品，在 4°C 下，600g 离心 5min 后， 收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次。同前吸尽上清后，2×106 细胞加入 100µL 裂解液（建议加入 1%蛋白酶抑制剂（CC088）），重悬沉淀，冰浴裂解 15~20min。 下接步骤 4。 2. 对于贴壁细胞：将没有诱导凋亡的对照品和诱导凋亡的样品，吸取细胞培养液，备用。用胰 酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。在 4°C 下，600g 离心 5min 后，收集细胞，
1
小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次。同前吸尽上清后，2×106 细胞加
入 100µL 裂解液（建议加入 1%蛋白酶抑制剂（CC088）），重悬沉淀，冰浴裂解 15~20min。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过 100µL 的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以 检测 20 个样品。
试剂准备 1. 裂解液融化后混匀并置于冰浴上备用。 2. 检测缓冲液融化后混匀并置于冰浴上备用。
气泡。随后再加入 10µL Ac-YVAD-pNA(2mM)。
3. 加入 Ac-YVAD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37°C 孵育 60-120min。发
ห้องสมุดไป่ตู้
现颜色变化比较明显时即可测定 A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可
以孵育过夜。
4. 样品的 A405 减去空白对照的 A405，即为样品中 caspase 1 催化产生的 pNA 产生的吸光度
二. 样品的收集： 1. 对于悬浮细胞：将没有诱导凋亡的对照品和诱导凋亡的样品，在 4°C 下，600g 离心 5min 后， 收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次。同前吸尽上清后，2×106 细胞加入 100µL 裂解液（建议加入 1%蛋白酶抑制剂（CC088）），重悬沉淀，冰浴裂解 15~20min。 下接步骤 4。 2. 对于贴壁细胞：将没有诱导凋亡的对照品和诱导凋亡的样品，吸取细胞培养液，备用。用胰 酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。在 4°C 下，600g 离心 5min 后，收集细胞，
1
小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次。同前吸尽上清后，2×106 细胞加
入 100µL 裂解液（建议加入 1%蛋白酶抑制剂（CC088）），重悬沉淀，冰浴裂解 15~20min。
对氧磷酶1(PON1)及其基因多态性与动脉粥样硬化的关系
国心血管病研究 ２ ０ １ ４ １ 月第 １ ２ 卷第 １ 期
， ｌ ｅ ｓ ｅ 如Ｈ ｅ ｒ ａ ｌ ０ ，
∞ ｃ ｕ
ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ， Ｊ ａ ｎ ｕ ａ ｒ ｙ ２ ０ １ ４ ， 。 ｆ － １ ２ ， Ｎ ｏ 一
．
６ ７．
对氧磷酶 １ （ Ｐ Ｏ Ｎ １ ） 及其基 因多态性与 动脉 粥样硬 化 的关 系
作者单位 ： ０ ６ ３ ０ ０ ０ 河北省唐 山市 ， 河北联合大学临床医学系硕士研究生 （ 阴文丽） ； 北京中医药大学 东直 门医院东区 （ 潘 国忠）
通讯作者： 潘 国忠， Ｅ － 一 ｍａ ｉ ｌ ： ｐ ａ ｎ ｇ ｕ ｏ ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ ｌ ０ ８ ＠ｓ ｉ ｎ ａ ， ． ｔ ｏ ｍ
Ａｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐ ａ ｒ ａ ｏ ｘ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ － １ ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｉ ｓ ｍ ｗｉ ｔ ｈ ａ ｔ ｈｅ ｒ ｏ ｓ ｃ ｌ ｅ ｒ ｏ ｓ ｉ ｓ
阴文丽 （ 综述 ） 潘 国忠（ 审校 ）
习 型半胱氨酸 化 ， 从而损伤蛋 白正常 的生理功 能 ， 导致 细胞 Ｅ 亡、 自身免疫反应、 炎症反应 ， 形成动脉粥样硬 化 。 Ｈ Ｔ Ｌ在
习 型半胱 氨酸硫 内酯酶 （ Ｈ Ｔ ａ ｓ ｅ ） 的作用 下又 可水 解 为 Ｈ ｃ ｙ ，
蛋 白免受氧 化修饰 。 目前 Ｐ Ｏ Ｎ １发挥动 脉 粥样硬 化保护 作用 的机 制主要包
，
醇的合成、 促进胆固醇外流。 具体机制： （ ｊ ） Ｐ Ｏ Ｎ １ 能延缓 Ｌ Ｄ Ｌ
氧化 的进程 。Ｐ Ｏ Ｎ １ 延缓 Ｌ Ｄ Ｌ 氧化 的具体 机制 尚未被证 实 ，
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６ ７．
对氧磷酶 １ （ Ｐ Ｏ Ｎ １ ） 及其基 因多态性与 动脉 粥样硬 化 的关 系
作者单位 ： ０ ６ ３ ０ ０ ０ 河北省唐 山市 ， 河北联合大学临床医学系硕士研究生 （ 阴文丽） ； 北京中医药大学 东直 门医院东区 （ 潘 国忠）
通讯作者： 潘 国忠， Ｅ － 一 ｍａ ｉ ｌ ： ｐ ａ ｎ ｇ ｕ ｏ ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ ｌ ０ ８ ＠ｓ ｉ ｎ ａ ， ． ｔ ｏ ｍ
Ａｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐ ａ ｒ ａ ｏ ｘ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ － １ ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｉ ｓ ｍ ｗｉ ｔ ｈ ａ ｔ ｈｅ ｒ ｏ ｓ ｃ ｌ ｅ ｒ ｏ ｓ ｉ ｓ
阴文丽 （ 综述 ） 潘 国忠（ 审校 ）
习 型半胱氨酸 化 ， 从而损伤蛋 白正常 的生理功 能 ， 导致 细胞 Ｅ 亡、 自身免疫反应、 炎症反应 ， 形成动脉粥样硬 化 。 Ｈ Ｔ Ｌ在
习 型半胱 氨酸硫 内酯酶 （ Ｈ Ｔ ａ ｓ ｅ ） 的作用 下又 可水 解 为 Ｈ ｃ ｙ ，
蛋 白免受氧 化修饰 。 目前 Ｐ Ｏ Ｎ １发挥动 脉 粥样硬 化保护 作用 的机 制主要包
，
醇的合成、 促进胆固醇外流。 具体机制： （ ｊ ） Ｐ Ｏ Ｎ １ 能延缓 Ｌ Ｄ Ｌ
氧化 的进程 。Ｐ Ｏ Ｎ １ 延缓 Ｌ Ｄ Ｌ 氧化 的具体 机制 尚未被证 实 ，
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组织对氧磷酶1（PON1）有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
（中文版）
主要用途
组织对氧磷酶1（PON1）有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过对氧磷酶1反应系统中，水解有机磷酸，释放出对硝基苯产物，出现吸光峰值的变化，即采用光度法来测定组织样品中酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种动物和人体组织裂解悬液样品对氧磷酶1的有机磷酸酶活性检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
对氧磷酶（parapxonase；PON；EC3.1.8.1）是一种水解酯类（esters）、有机磷酸酯（organophosphate）和内酯（lactone）的多态性酶，分成三个亚型：PON1、PON2、PON3。
结构同源性在基因层面上达70%，在氨基酸层面上达65%。
其中PON1，为钙离子依赖性和高密度脂蛋白（high density lipoprotein；HDL）相关性糖蛋白，含有354氨基酸，43Kd分子量，分布在肝脏、肾脏、小肠和血清（50毫克/升）中。
具有有机磷酸酶（organophosphtase）、磷酸三酯酶（phosphotriesterase）、芳香酯酶（arylesterase）和硫内酯酶（thiolactonase）等多重活性：PON1与HDL结合，水解各种LDL和HDL上的氧化性磷酯，以及芳香族羧酸酯、芳香族和脂肪族内酯等，例如杀虫剂对硫磷（parathion）降解产物对氧磷（paraoxon）、毒死蜱（chlorpyriphos）、神经毒因子沙林（sarin）和索曼（soman）、同型半胱氨酸（homocysteine）硫内酯、二氢香豆素（dihydrocourmarin；DHC）、γ-丁内酯（γ-butyrolactone）等，延缓和抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein；LDL）氧化作用，阻止脂质过氧化物产生，保护脂蛋白以及质膜受到氧化损伤，达到抗粥样硬化（antiatherogenic）、解毒、抗氧化的功能。
PON1活性降低与慢性肾衰、糖尿病、外周神经病变、家属性高胆固醇血症、心血管疾病、肝纤维化等有关。
PON2为44Kd分子量，分布在脑、肝脏、肺、肾脏、睾丸等大多数组织中，但血清中测不到。
PON2具有水解芳香酯和内酯酶的功能，但不能水解有机磷酸。
具有细胞内抗氧化作用，预防粥样硬化等功能。
PON3为40Kd分子量，主要分布在肝脏中，少量在肾脏中。
主要水解各种内酯和环状羧酸酯，具有抗氧化功能。
基于人工合成底物对硝基苯磷酸二乙酯（diethyl-p-nitrophenylphosphate），在对氧磷酶1的作用下，水解产生对硝基苯（p-nitrophenol）和磷酸二乙酯（diethyl phosphate），通过对硝基苯产物吸收峰值的变化（405nm波长），来定量分析对氧磷酶1的有机磷酸酶活性。
其反应系统为：
产品内容
清理液（Reagent A）毫升
裂解液（Reagent B）毫升
缓冲液（Reagent C）毫升
底物液（Reagent D）毫升
阴性液（Reagent E）毫升
产品说明书1份
保存方式
保存底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）具有毒性，注意操作安全；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品CAOZUO1的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
（微型）台式离心机：用于样品制备
比色皿或96孔板：用于光度测定的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光度分析
实验步骤
一、样品准备
1．手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量
2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．移入到一个液氮冻存管
5．即刻放进液氮罐过夜
6．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）7．放进一个15毫升锥形离心管
8．加入预冷的xx微升裂解液（Reagent B）
9．转移到预冷的1.5毫升离心管
10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀
11．置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
12．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）15．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1.开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长405nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
2.从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化
3.缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升底物液（Reagent D）
3．上下倾倒数次，混匀
4．在37℃温度下孵育3分钟
5．加入xx微升阴性液（Reagent E）
6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照（5分钟读数－0分钟读数）
四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升底物液（Reagent D）
3．上下倾倒数次，混匀
4．在37℃温度下孵育3分钟
5．加入50微升待测样品（100微克蛋白）
6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5分钟读数－0分钟读数）
五、计算样品活性
六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和待测样品
2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3．分别加入xx微升底物液（Reagent D）到所有孔里
4．轻轻摇动96孔板
5．在37℃温度下孵育3分钟
6．分别加入xx微升阴性液（Reagent E）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里
7．轻轻摇动96孔板
8．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
注意事项
1．本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作
2．操作时，须戴手套
3．底物液（Reagent D）具有毒性，注意操作安全
4．系统测试过程中，背景测定仅需1次
5．加样后3秒内光度测定
6．测定值由低到高变化；测定可持续5分钟
7．光度测定后，比色皿须清洗彻底
8．样本测定5分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
9．建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11．对氧磷酶1有机磷酸酶活性单位活性定义为：在37℃，pH 8.0条件下，每分钟内能够生成1微摩尔对硝基苯所需的酶量作为一个活性单位
12．本公司提供系列对氧磷酶检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感。