2011.3.3原生质体制备和转化

原生质体转化原理
原生质体转化原理
原生质体转化是一种生物技术，旨在将外源DNA引入宿主细胞以获得特定的遗传性状态或表观遗传变化。

原生质体转化原理是一种利用外源DNA（例如体外克隆的DNA和质粒）彻底改变宿主细胞的生理特性。

它为研究者提供了一种简便的方法来改变宿主细胞的遗传特性，同时也能够可靠地测定插入外源DNA的效果。

原生质体转化可以用于实验检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。

原生质体转化是一种简易的、可重复的、可控的、有效的技术，可以用来利用外源DNA改变宿主细胞的生理表型，插入和表达外源DNA成为宿主细胞的一部分。

原生质体转化可以被用来驱动各类基因的表达，修改受体的结构，调控蛋白质表达。

原生质体转化是一种可以用来将外源DNA进行插入的非常有效的技术，其优势在于很多具有特定功能的DNA可以被插入宿主细胞，可以较快的检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。

原生质体转化依赖于抗生素耐受性，以及抗性转录因子的表达。

这种抗生素耐受机制通过一系列复杂的交互作用使宿主细胞能够耐
受特定的抗生素，该抗生素是质粒DNA的载体，从而达到对特定DNA 序列的特异性。

另外，原生质体转化还可以依赖于转录抑制因子的表达，如亢余的转录抑制因子，以防止宿主细胞的表达被抑制，并保持外源DNA的表达稳定。

总而言之，原生质体转化是一种简便而可靠的技术，可以用来改变宿主细胞的遗传特性，实现对基因功能的检测，以及研究调控机制的功能。

原生质体制备的方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠原生质体制备的那些事儿。

你想想看啊，原生质体就像是一个小小的神秘世界，等着我们去探索和解锁呢！要制备它呀，就好像是一场精心策划的冒险。

咱先得选好材料，这就好比是要踏上征途得先选好一匹好马呀！不同的材料就像是不同性格的马，各有各的特点和脾气。

选对了，后面的路就好走多啦。

然后呢，就是处理环节啦。

这可得小心翼翼的，就跟雕刻一件艺术品似的，不能太用力也不能太轻了。

得掌握好那个度，不然可就前功尽弃喽！你说要是不小心给弄砸了，那得多懊恼呀！接着就是酶解啦。

这酶就像是一把神奇的钥匙，能打开原生质体这个神秘世界的大门。

可要选对酶哦，不然门打不开，咱不就白忙活啦！在这个过程中，时间和温度都很关键呢，就好像煮汤一样，火候得把握好。

等酶解完了，就得过滤啦。

这就好像是把沙子和金子分开，要把我们想要的原生质体给筛选出来。

这一步也不能马虎呀，得仔仔细细的。

然后呢，就是洗涤啦。

把那些杂质都洗掉，让原生质体干干净净的。

这就像是给宝贝洗澡一样，得温柔点，可别把它弄疼了。

最后呀，就是培养啦。

给原生质体创造一个舒适的环境，让它能好好地生长发育。

这就像是给小树苗找了个好地方种下去，得精心呵护着。

哎呀呀，制备原生质体可不是一件容易的事儿呀，但只要咱一步一步认真去做，就一定能成功！你说是不是？这过程虽然有点麻烦，但当你看到那一个个可爱的原生质体的时候，你就会觉得一切都值得啦！就像你辛苦种的花终于开了一样，那种喜悦呀，真的是没法形容！所以呀，别害怕困难，大胆去尝试吧！让我们一起在原生质体制备的世界里畅游，去发现更多的惊喜和奥秘！。

原生质体转化法原生质体转化法是以原生质体为受体的转基因方法的总称。

该方法包含两个重要的部分：原生质体的分离与再生和外源DNA 转化。

根据外源DNA 转化方法的不同可分为PEG介导转化法、电击法、脂质体介导转化法、显微注射法和农杆菌介导法等原生质体转化法。

原生质体的分离是原生质体转化法的核心步骤。

历史上原生质体的分离经历了以下三个重要阶段：（1）1892年，Klercker采用机械法进行了植物原生质体的分离。

（2）1960 年，Cocking 使用疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁，获得大量有活力的裸细胞（原生质体）。

（3）1968年，Takebe首次使用商品酶（离析酶和纤维素酶）消化掉了烟草叶肉细胞细胞壁，释放出原生质体。

自此，植物原生质体变成了一个热门的研究领域。

原生质体作为转化受体具有以下优点：（1）无细胞壁的原生质体的细胞全能性较普通细胞更好。

（2）原生质体是单细胞系统，没有或较少受周围细胞和微环境的影响。

（3）原生质体再生的植株也是由单细胞发育而来，性状易纯化且遗传稳定。

所以向原生质体导入外源基因比向其他外植体导入外源基因有更大的优势，成为遗传转化中一种良好的受体。

由于基因枪技术的不断发展，向植物体直接导入外源基因已不再像以前那么困难，所以原生质体转化法的应用日趋减少，但在特定条件下，如转移细胞器及DNA 大片段时仍有一定的应用价值。

一、基本原理植物细胞壁由中胶层（主要成分果胶质）、初生壁（主要成分纤维素和半纤维素）和次生壁（主要成分纤维素，一般也含有木质素）三部分组成，利用果胶酶和纤维素酶消化植物细胞壁，释放出原生质体。

以原生质体为转基因受体，采用转基因方法，如PEG介导转化法通过改变质膜透性，促进外源DNA 进入已分离的植物原生质体，然后经过转化原生质体组织培养获得转化植株。

二、转化方法主要包括植物原生质体的分离和外源基因转化两个重要部分。

拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉3．0.4M mannitol1.09g干粉4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6．加入10ml 水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。

2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g5mM KCl, KCl0.37g2mM MES（PH 5.7），MES0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。

里氏木霉原生质体的制备及转化摘要本实验通过将含潮霉素B抗性标记的质粒pAN7-1转化至里氏木酶原生质体中，在含100ug/ml潮霉素B的PDA平板上筛选转化子。

并予以验证，结果表明，在1kb处有潮霉素抗性基因组，其中浓度为107个/ml的转化子效果最好。

关键词里氏木酶原生质制备转化前言纤维素是自然界提供给人类的最宝贵的财富，植物每年通过光合作用产生数千亿吨的纤维素，但目前只有一小部分用于纺织、造纸、建筑和饲料等方面。

木霉属是迄今被认为纤维素酶成分最全面，分解天然纤维素活力最高的一类菌。

在育种方面利用高能电子、紫外线、亚硝基胍处理和原生质体融合等方法，使酶的活力得到很大的提高。

本试验对里氏木霉原生质体的制备及转化进行了研究,为进一步的育种工作奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株及质粒来源里氏木霉QM9414和质粒pAN7-1由深圳大学生命科学学院S402实验室刘刚老师提供。

1.1.2试剂及培养基的配制1.1.2.1 Mandels 营养盐浓缩液配制(NH4)2SO4 14 g，尿素 3 g，KH2PO420 g，CaCl2⋅2H2O 4 g，MgSO4⋅7H2O 3 g，ddH2O 定容至1L1.1.2.2 Mandels 微量元素浓缩液配制FeSO4⋅7H2O 5 g，ZnSO4⋅7H2O 1.7 g，CoCl2⋅6H2O 23.7 g，MnSO4⋅H2O 1.6 g，ddH2O 定容至1L1.1.2.3 1 M柠檬酸缓冲液配制柠檬酸210 g，NaOH（纯度96 %）78 g，ddH2O 750 ml，冷却后定容至1L1.1.2.4 60％的PEG400050 mM CaCl2，10 mM Tris·Cl（pH 7.5），60 g PEG4000加水定容到100 ml1M CaCl25ml，1M Tris·Cl（pH 7.5）1ml，PEG4000 60g，ddH2O定容至100 ml1.1.2.5 STC山梨醇218.6g（所需浓度为1.2 M），1M Tris·Cl（pH 7.5）10ml（所需浓度为10 mM），1M CaCl2 50ml（所需浓度为50 mM），ddH2O 定容至1L1.1.2.6 PDA培养基去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂(Agar) 15g，ddH2O定容至1L其中20 %土豆浸出液制作方法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。

植物细胞原生质体的制备与融合。

1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。

细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。

此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。

（2）原生质体融合：即体细胞杂交。

用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。

若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。

2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。

在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。

如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。

游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。

基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。

（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。

但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。

因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。

常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。

对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。

对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。

最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。

（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。

①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。

③酶解：除菌绿。

反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。

经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。

高粱原生质体的制备及转化方法研究谢鑫; 蒋君梅; 王勇; 任明见【期刊名称】《《种子》》【年(卷),期】2019(038)008【总页数】4页(P43-46)【关键词】高粱; 原生质体制备; 转化方法【作者】谢鑫; 蒋君梅; 王勇; 任明见【作者单位】贵州大学农学院贵阳 550025; 国家小麦改良中心贵州分中心贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】Q94-336; S514近年来对高粱的研究主要集中在采用基因工程手段培育抗病、抗寒、抗逆的高粱品种等方面[3-5]。

但是，由于高粱转化及再生体系技术还不成熟，制约了利用转基因技术研究高粱基因功能，而利用原生质体可以对植物基因功能进行快速验证，因而，对高粱原生质体制备与转化研究具有重要意义。

20世纪60年代，Cocking 等第一次从藻类分离出原生质体以来，陆续从小麦、玉米、水稻、大麦等禾本科植物及木本植物中成功分离出原生质体[6-8]，原生质体的应用也扩展到基因瞬时表达、蛋白亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、启动子分析以及种质资源改良等领域。

目前，有报道用高粱悬浮细胞制备原生质体的方法[9]，但是该方法费时、费力，不利于快速验证基因功能的需要。

本研究采用高粱黄化苗进行原生质制备，转化过程只需要2 d时间，简单、快速。

1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试植物材料供试的高粱样品为BTx 623，来自中国农业科学院生物技术研究所。

1.1.2 供试试剂纤维素酶Cellulose R 10 和果胶酶Macerozyme R 10购自日本Yakult Pharmaceutical公司；甘露糖、聚乙二醇4000、氯化钙、EDTA、氯化铯、MES、KCl等购自Sigma公司；甘油、正丁醇、异丙醇、醋酸钾、SDS、氯化钠、氢氧化钠等为国产试剂。

1.1.3 实验设备主要仪器：超速冷冻离心机(BECKMAN，L100-XP)、台式离心机(EPPENDORF，5424-R)、激光共聚焦显微镜(OLYMPUS，FV-1000)、普通光学显微镜(OLYMPUS)、光照培养箱、摇床和真空泵(WELCH，Model 2522 c-02)等。