最新第七章-工业微生物原生质体育种和原生质体融合课件ppt
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《原生质体融合育种》课件
原生质体融合育种
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
《原生质体育种》课件
化学诱变
使用化学诱变剂处理原生 质体，诱发基因突变，筛 选具有优良性状的新品种 。
细胞融合
将不同物种或同一物种不 同品系的原生质体进行融 合，以获得具有杂种优势 的新品种。
原生质体育种的应用
培育抗逆性强的新品种
改良作物的品质
通过原生质体育种技术，可以筛选出具有 较强抗逆性的新品种，如抗旱、抗寒、抗 盐碱等。
详细描述
物理法包括电融合、激光融合等，这些方法利用物理能量来诱导原生质体的融 合。化学法则是利用化学物质如聚乙二醇等诱导原生质体的融合。这些方法的 选择取决于实验条件和目的。
原生质体融合的应用
总结词
原生质体融合在植物育种、基因工程和生物技术等领 域有广泛的应用。
详细描述
在植物育种方面，原生质体融合可以用于创造新的植物 品种，通过将不同亲本的原生质体融合，可以产生具有 优良性状的杂种细胞，进而培育出新的植物品种。在基 因工程领域，原生质体融合可以用于基因转移和基因编 辑，通过将外源基因导入原生质体，可以实现基因的转 移和表达。此外，原生质体融合还可以用于研究细胞融 合的机制和细胞生物学特性，为生物技术的发展提供重 要的理论支持和实践经验。
现植物的遗传改良。
细胞融合
02
将不同植物的原生质体进行融合，创造新的植物品种或改良现
有品种。
细胞培养生产有用次生代谢产物
03
利用原生质体培养生产具有药用、工业或其他用途的次生代谢
产物。
02
原生质体融合
原生质体融合的定义
总结词
原生质体融合是将两种或多种植物细胞原生质体通过物理或化学方法融合，形成一个杂种细胞的技术 。
原生质体育种
目录
• 原生质体培养 • 原生质体融合 • 原生质体育种技术 • 原生质体育种的优势与挑战 • 原生质体育种案例分析
植物原生质体组织培养PPT课件
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
Organelle, DNA uptake
第3页/共83页
Cell cloning
意义
• 植物细胞育种中的核质替换 • 细胞质杂种的获得 • 远缘杂交创造新物种细胞 • 细胞器的互作研究
• 酚藏花红染色法（0.1%)
• 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
第23页/共83页
影响原生质体数量和活力的因素
• 供试材料及预处理方法 • 酶解条件：
第6页/共83页
原生质体分离的方法
酶解分离法 机械分 离 法
第7页/共83页
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液
中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原 生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组 织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
• 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种 类受到限制。
第4页/共83页
植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
第5页/共83页
用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
原生质体融合技术简介
(1)渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不 仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶 和底物的结合。渗透压稳定剂多采用Kcl、NaCl等 无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有 机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌 中多用蔗糖，丁二酸钠、NaCl等；在酵母菌中多 用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。 稳定剂的使用浓度一般均在o．3一o．8mol/L之间。
在链霉菌原生质体融合育种方面
邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新留素产生菌 的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产 生原养型重组体的频率为10-4。其中有58% 产生巴龙霉素，并从中获得了产量比原始菌 株(300ug/ml)提高5—6倍的融合子。
杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定 霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株 进行融合，以自身抗生素抗性为标记选择种 间融合子，从而获得了一株正定霉素产量较 亲株提高了2.6倍的融合子。
另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
(1) 菌体的前处理 为了使酶的作用效果更好一些， 可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入 一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的 细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰 甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D—丙氨酸之间的联 结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的 细壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。
原生质体融合技术简介
一 原生质体融合
定义：原生质体融合就是将两个亲株的细 胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在 高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的 球状原生质体。然后将两个亲株的原生质 体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融， 使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发 生两次基因组之间的接触、交换、遗传重 组，在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
《原生质体融合育种》课件
稻米和小麦的基因交换
细胞工程育种的应用
通过原生质体融合育种，实现稻 米和小麦遗传特性的交换， 以提 高两个农作物的产量和适应能力。
利用细胞工程技术和原生质体融 合，可以快速培育出抗性强、高 产优良品种。
植物基因编辑的进展
通过原生质体融合育种的细胞工 程技术，实现植物基因编辑， 能 够更精准地改良植物性状技术，将植物细胞分离并制备出原生质体。
2
随机融合和定向融合的区别
随机融合是将制备好的原生质体混合后融合，而定向融合是特定选择要融合的原生质 体进行融合。
3
影响融合效率的因素
原生质体浓度、温度、融合时间等因素会对融合效率产生重要影响。
应用案例
了解原生质体融合育种在农业和植物科学领域的具体应用案例。
优缺点
了解原生质体融合育种的优势、局限性以及未来发展方向。
原生质体融合育种的优点
快速获取新品种、遗传特性可控、有效提高农作物产量。
原生质体融合育种的缺点
融合效率低、变异性高、对环境的适应能力有限。
未来发展趋势
进一步改进原生质体融合育种技术，提高融合效率和品种稳定性。
结论
通过本课件的学习，我们了解了原生质体融合育种的基本原理、应用案例、优缺点以及未来发展趋势。 原生质体融合育种具有巨大的应用潜力，将助力农作物产量提升和遗传特性的改良。
《原生质体融合育种》PPT课 件
让我们一起了解原生质体融合育种的奥秘与应用。
介绍
原生质体融合育种是一种基因育种技术，通过将不同植物的原生质体融合，实现基因交流和遗传特性的 选择性增强。
什么是原生质体融合育种
原生质体融合育种是通过融合植物细胞的原生质体， 实现不同植物间基因的交流，以达到遗传性状 的改良。
微生物原生质体融合育种精品PPT课件
☺促融时间：促融时间增加可以使原生质体融合机会增多，但是，PEG对原 生质体有毒，为保证原生质体的再生能力，促融时间不宜过长。
☺无机离子：原生质体融合过程中需要一定量的 Ca2+和Mg2+促进融合， 而 K+、 Na+会显著降低融合率， 融合时一般 Ca2 +0 . 01 mol / L、 Mg2+0 . 02 mol / L 为佳。各菌种间略有差异。
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3、原生质体再生
原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生 。不同微生物的原生质体最 适再生条件存在一定的差异 ▪ 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁 合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。 ▪ 菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全， 营养供给不足再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。 ▪ Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与 活性。
过
低速离心数分钟
程
除去上清液，收集沉淀物
0.1 mol/L CaCl2洗涤两次 用融合液悬浮制备的融合体
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原生质体融合的影响因素
☺PEG浓度：PEG既是促融剂又是渗透压稳定剂，低浓度低分子量的PEG促 融效果不好，也容易导致原生质体破裂。但是高浓度的PEG会导致原生质 体收缩，降低融合频率，而且过高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。一 般为40%。
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写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
☺无机离子：原生质体融合过程中需要一定量的 Ca2+和Mg2+促进融合， 而 K+、 Na+会显著降低融合率， 融合时一般 Ca2 +0 . 01 mol / L、 Mg2+0 . 02 mol / L 为佳。各菌种间略有差异。
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3、原生质体再生
原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生 。不同微生物的原生质体最 适再生条件存在一定的差异 ▪ 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁 合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。 ▪ 菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全， 营养供给不足再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。 ▪ Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与 活性。
过
低速离心数分钟
程
除去上清液，收集沉淀物
0.1 mol/L CaCl2洗涤两次 用融合液悬浮制备的融合体
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原生质体融合的影响因素
☺PEG浓度：PEG既是促融剂又是渗透压稳定剂，低浓度低分子量的PEG促 融效果不好，也容易导致原生质体破裂。但是高浓度的PEG会导致原生质 体收缩，降低融合频率，而且过高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。一 般为40%。
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写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
原生质体融合育种PPT课件
是保藏时间很短。
第35页/共62页
（二）原生质体再生
• 原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完 成再生实验，为融合体再生和复原做好准备。
• 原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形 态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生 质体的再生。
第36页/共62页
影响原生质体再生的因素（略）
• 菌体生理状态 • 稳定剂 • 酶浓度与酶作用时间 • 再生培养基的组成 • 原生质体的密度
……
第37页/共62页
三、原生质体融合
（一）融合剂和融合手段
• 化学融合剂，普遍采用PEG介导的化学融合法。
✓在PEG介导融合时，通常需要一定浓度的Ca2+和Mg2+，能更有 效地促进融合。
PEG法 原 生 质 体 的 融 合 图 示
c) 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处 理后所出现的产量上升缓慢的现象。
d) 杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递规律，丰富和 促进遗传学理论的发展。
第5页/共62页
杂交育种缺陷：
a) 只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因； b) 杂交进程缓慢，过程繁琐，育种时间长； c) 只能进行本物种或亲缘关系较近的物种杂交，不能克服远源
3. 利用灭活原生质体检出融合体 A A
AB
4. 利用荧光染色法选择融合体5. 利用双亲对碳源利用不同而检出×融
√
合体
B
BB
×
第43页/共62页
1．利用营养缺陷型标记选择融合体
• 融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，在基本培养基上 只有融合体生长而双亲本原生质体不能形成菌落。
• 此法较为准确可靠，缺点是易使部分表型延迟的融合体 漏选、工作量大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性 状丧失或降低。
第35页/共62页
（二）原生质体再生
• 原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完 成再生实验，为融合体再生和复原做好准备。
• 原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形 态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生 质体的再生。
第36页/共62页
影响原生质体再生的因素（略）
• 菌体生理状态 • 稳定剂 • 酶浓度与酶作用时间 • 再生培养基的组成 • 原生质体的密度
……
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三、原生质体融合
（一）融合剂和融合手段
• 化学融合剂，普遍采用PEG介导的化学融合法。
✓在PEG介导融合时，通常需要一定浓度的Ca2+和Mg2+，能更有 效地促进融合。
PEG法 原 生 质 体 的 融 合 图 示
c) 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处 理后所出现的产量上升缓慢的现象。
d) 杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递规律，丰富和 促进遗传学理论的发展。
第5页/共62页
杂交育种缺陷：
a) 只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因； b) 杂交进程缓慢，过程繁琐，育种时间长； c) 只能进行本物种或亲缘关系较近的物种杂交，不能克服远源
3. 利用灭活原生质体检出融合体 A A
AB
4. 利用荧光染色法选择融合体5. 利用双亲对碳源利用不同而检出×融
√
合体
B
BB
×
第43页/共62页
1．利用营养缺陷型标记选择融合体
• 融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，在基本培养基上 只有融合体生长而双亲本原生质体不能形成菌落。
• 此法较为准确可靠，缺点是易使部分表型延迟的融合体 漏选、工作量大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性 状丧失或降低。
工业微生物诱变育种PPT课件共37页
工业微生物诱变育种PPT课件
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
5.2 营养缺陷型突变株的应用
工业微生物育种中，用于积累代谢中间产物 作为杂交、重组育种的遗传标记 用于微生物代谢途径研究 在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研
究中用作标记菌株
6 温度敏感突变株的筛选P184
温度敏感突变株（temperature-sensitive mutant, TS突变体）： 突变株在一定温度范围内（许可温度）正常生长，其表型 和野生型没有区别，但超出这一温度范围（非许可温度）， 则不能生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或某些代谢 停止或减弱。
5. 1.2 淘汰野生型菌株 方法1：抗生素法
细菌：
用加有青霉素的基本培养基分离培养诱变处理后的 菌体，野生型菌株因为繁殖产生的子细胞不能合成正 常细胞壁而死亡，而对不能繁殖的营养缺陷型细胞因 为在基本培养基中不能繁殖而得以保留
具体方法和步骤见P176
5. 1.2 淘汰野生型菌株 方法1：抗生素法
TS突变主要是由必需基因发生突变，致使该基因在一定温 度条件下无法正常表达，或其编码的酶失活，造成细胞不 能正常生长。
6.1 TS突变株的选育方法
6.1.1 TS突变株的诱发 TS突变主要由基因错义突变所致，要选择易于引 起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚 硝酸、UV等诱变剂。
6.1.2 淘汰野生型菌株/TS菌株富集培养 1 抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下培养 一定时间，杀灭在该温度下生长的野生型菌株， 再离心除去抗生素，分离 2 其它方法 (P185) H3放射性同位素前体法
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
5.2 营养缺陷型突变株的应用
工业微生物育种中，用于积累代谢中间产物 作为杂交、重组育种的遗传标记 用于微生物代谢途径研究 在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研
究中用作标记菌株
6 温度敏感突变株的筛选P184
温度敏感突变株（temperature-sensitive mutant, TS突变体）： 突变株在一定温度范围内（许可温度）正常生长，其表型 和野生型没有区别，但超出这一温度范围（非许可温度）， 则不能生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或某些代谢 停止或减弱。
5. 1.2 淘汰野生型菌株 方法1：抗生素法
细菌：
用加有青霉素的基本培养基分离培养诱变处理后的 菌体，野生型菌株因为繁殖产生的子细胞不能合成正 常细胞壁而死亡，而对不能繁殖的营养缺陷型细胞因 为在基本培养基中不能繁殖而得以保留
具体方法和步骤见P176
5. 1.2 淘汰野生型菌株 方法1：抗生素法
TS突变主要是由必需基因发生突变，致使该基因在一定温 度条件下无法正常表达，或其编码的酶失活，造成细胞不 能正常生长。
6.1 TS突变株的选育方法
6.1.1 TS突变株的诱发 TS突变主要由基因错义突变所致，要选择易于引 起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚 硝酸、UV等诱变剂。
6.1.2 淘汰野生型菌株/TS菌株富集培养 1 抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下培养 一定时间，杀灭在该温度下生长的野生型菌株， 再离心除去抗生素，分离 2 其它方法 (P185) H3放射性同位素前体法
第七章杂交育种
08.04.2021
47
遗传标记除常用的营养缺陷和抗性标记之外，也可采用热 致死(灭活)、孢子颜色和菌落形态等作为标记。
1. 如果目的是为了进行遗传分析，应该采用带隐性基因的 营养缺陷型菌株或抗性菌株。
不足之处：
①原生质体融合后DNA交换和重组随机发生，增加重 组体分离筛选的难度。
②细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传 物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的重组频 率，使远缘融合杂交存在较大困难。
08.04.2021
44
二、原生质体融合育种的原理
原理：原生质体融合本质是二亲本菌株去除细胞壁后的 一种体细胞杂交育种方法。 两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶去除细 胞壁后，在促融剂诱导作用下，两个裸露的原生质体接 触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形 成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基 因重组目的，最后对重组体进行生产性能、生理生化和 遗传特性分析。
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原生质体转化育种
是将整条染色体DNA或片断DNA或质粒DNA 转化原生质体的技术，转化育种为实现定向育种 的目标和原生质体育种技术开拓了一个更广阔的 领域。
一般来说，用染色体DNA或其他线状DNA转
化原生质体效率较低，而用质粒DNA能得到高频
转化率，完整质粒、单链质粒和重组质粒都能成
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常见原生质体育种方法：
原生质体再生育种 原生质体诱变育种 原生质体转化育种 原生质体融合育种 …
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原生质体再生育种
原生质体再生育种是将微生物制备原生质体后直 接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得 到优良性状提高的正变菌株。原生质体再生育种不 用任何诱变剂处理，而能产生比常规诱变还高的正 变率。
原生质体培养与体细胞杂交PPT讲稿
合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏 烟草体细胞杂种。
NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。
第三节、原生质体融合
（二）高pH-高Ca离子 法
1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶 液在37℃时，诱发烟草叶肉原 生质体融合。
第三节、原生质体融合
（四）PEG结合高钙-高pH诱导法
最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质 体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加 高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生 质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体 细胞团---筛选---再生杂合细胞
液洗1次。
第一节、原生质体分离 及纯化
3 、 界面法
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其 中一种溶液密度大于原生质体的密度， 另一种溶液小于原生质体的密度。
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
第一节、原生质体分离 及纯化
（二） 原生质体活力测定
1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有 饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原 生质体。
2、染色识别
• 1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力
的不被染色，死亡的被染上色。
• 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧
光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质 体。
第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交
第二节 原生质体培养
一、培养基
pH 渗透压
碳源 培养基
钙镁
氮源 生长物质
第二节、原生质体培养
方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7% 琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲 养层，再将生活力正常的原生质体与 0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。
NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。
第三节、原生质体融合
（二）高pH-高Ca离子 法
1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶 液在37℃时，诱发烟草叶肉原 生质体融合。
第三节、原生质体融合
（四）PEG结合高钙-高pH诱导法
最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质 体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加 高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生 质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体 细胞团---筛选---再生杂合细胞
液洗1次。
第一节、原生质体分离 及纯化
3 、 界面法
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其 中一种溶液密度大于原生质体的密度， 另一种溶液小于原生质体的密度。
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
第一节、原生质体分离 及纯化
（二） 原生质体活力测定
1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有 饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原 生质体。
2、染色识别
• 1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力
的不被染色，死亡的被染上色。
• 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧
光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质 体。
第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交
第二节 原生质体培养
一、培养基
pH 渗透压
碳源 培养基
钙镁
氮源 生长物质
第二节、原生质体培养
方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7% 琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲 养层，再将生活力正常的原生质体与 0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。
第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合
间形成细胞质通道（37℃下
1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为
H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。
膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
具体步骤
DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们 与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链 紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射 峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm ，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细 胞核的位置。
（二）原生质体融合
1、融合亲本选育 • 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株
原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和 选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发 生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合 是有效的融合，概率为33.33%，当然还有多个原 生质体融合到一起的可能。
特点
融合率高、重复性与可控制性强。 装置精巧、方便简单。 可在显微镜下观察或录像融合过程。 可能会造成不可恢复的细胞损伤。
(2)生物法
各种病毒都具有凝集细胞的能力，它一边粘接在一 个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，从 而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。
仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA 与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活 而常采用。
1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为
H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。
膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
具体步骤
DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们 与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链 紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射 峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm ，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细 胞核的位置。
（二）原生质体融合
1、融合亲本选育 • 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株
原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和 选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发 生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合 是有效的融合，概率为33.33%，当然还有多个原 生质体融合到一起的可能。
特点
融合率高、重复性与可控制性强。 装置精巧、方便简单。 可在显微镜下观察或录像融合过程。 可能会造成不可恢复的细胞损伤。
(2)生物法
各种病毒都具有凝集细胞的能力，它一边粘接在一 个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，从 而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。
仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA 与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活 而常采用。
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离心其沉淀物，高速离心弃上清液，的纯化原生 质体。
原生质体的保存
真菌0-4℃保存2天
影响原生质体存活的遗传因素
• 细菌易再生可达90%以上，有些种类也很低； • 小单孢菌只有10%； • 放线菌可达50%； • 丝状真菌“产黄青霉”40-60%。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。
膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
具体步骤
DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们 与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链 紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射 峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm ，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细 胞核的位置。
二 、发展历史
细胞融合现象最初是在动物细胞中表现的。 1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组
织中的多核细胞情况。 1875年观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞
发生的合并现象。
1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ) 能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。
20世纪七十年代初，华裔加籍科学家高国楠发现 聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了 植物细胞融合的研究。
第七章-工业微生物原生 质体育种和原生质体融合
第一节 原生质体育种
一、原生质体再生育种 出发菌株的选择→菌种活化和与培养→原生 质体制备→原生质体再生→高产菌株分离→ 复筛→遗传性状鉴定→菌种特性和发酵特性 研究
二、原生质体诱变育种 菌种活化和与培养→原生质体制备→原生质 体悬浮液稀释至一定浓度，取一定放入无菌 平皿中→ 紫外灯下诱变处理→ 置暗处后处 理→ 再生培养→高产菌株分离→复筛→遗传 性状鉴定→菌种特性和发酵特性研究
✓ Novozyme234来自Trichoderma harzianum
✓ Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 ✓ Gglucuronidase葡聚糖甘酸酶
4、影响原生质体制备的因素
1)菌体的前处理 为了将菌作一些前处理使酶作用的效果好一 些， 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。
2)菌体的培养时间 选择增殖期的菌体，使细胞易于原生质体化。
5)破壁时的pH值:对离子强度影响较大
6)渗透压稳定剂
等渗透压在原生质体制备中起到保护原生 质体免于膨裂，有助于酶和底物的结合， 渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗 糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。
5、原生质体制备程序
• 菌体培养：液体培养 固体培养 • 收集菌体：过滤收集、离心收集无菌水冲洗 • 洗涤菌体：等渗液冲洗等渗液与酶液相同 • 酶解处理：保温酶解 稀释终止酶解，离心去酶 • 过滤分离：过滤去掉为分界菌丝体 • 查速离心：收集大小密度均一的原生质体，低速
• 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般 都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法
物理法、化学法及生物法 。 原理
增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法
在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
2、微生物细胞壁组成
• 微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成不同， 酶解处理的有效酶也不一样，因此要求根据微生 物种类特性选择合适的酶。
• G+:糖肽、低聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛 酸磷壁酸
• G-：糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂 蛋白、二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳 糖
真核细胞壁组成
3)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是 二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为 一的过程。
4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融 合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。
6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
融合过程中细胞膜变化
类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
五、原生质体融合技术
• 原生质体制备 • 原生质体纯化 • 原生质体融合 • 融合子检出 • 融合子鉴定
（一）微生物原生质体制备
1、定义及特点 定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生 质体。 特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操 作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操 作。 具有全能性，能再生细胞壁。
种类 疫霉属 毛霉属 酵母属 镰刀霉属 裂褶菌数 鬼伞属
纤维素 25 0 0 0 0 0
几丁质 0 9 1 39 5 33
其他多糖 65 44 60 29 81 50
3、制备原生质体的酶类
自然界中多种生物都能合成破坏降解菌体细胞壁的酶，如蛋 清中的溶菌酶，蜗牛消化酶，寄生性微生物合成酶。 包括： • 纤维素酶 • 酵母裂解酶 • 几丁质酶 • 商品酶：
（二）原生质体融合
1、融合亲本选育 • 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株
原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和 选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发 生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合 是有效的融合，概率为33.33%，当然还有多个原 生质体融合到一起的可能。
3)酶浓度
对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类 要求不同，对酶的浓度也有差异。最佳酶 浓度还随不同的生长期的菌体而变化。
• 酶浓度合适，浓度太高对原生质体有破坏 作用，影响原生质体的再生
4)酶处理温度 :根据具体情况,细菌高,酵母 及霉菌稍低。过高的温度使酶失活，原生 质体失活；过低的温度酶活性不高，影响 原生质体细胞膜稳定性
细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞 伴随者细胞融合技术的成熟。
20世纪80年代，真正意义上的细胞工程诞生了， 细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。
三、原生质体融合育种的特点
1)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件 下形成类似于球形的原生质体。
2)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中 任何一株都可能起受体或供体的作用，因此 有利于不同种属间微生物的杂交。
原生质体的保存
真菌0-4℃保存2天
影响原生质体存活的遗传因素
• 细菌易再生可达90%以上，有些种类也很低； • 小单孢菌只有10%； • 放线菌可达50%； • 丝状真菌“产黄青霉”40-60%。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。
膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
具体步骤
DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们 与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链 紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射 峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm ，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细 胞核的位置。
二 、发展历史
细胞融合现象最初是在动物细胞中表现的。 1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组
织中的多核细胞情况。 1875年观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞
发生的合并现象。
1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ) 能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。
20世纪七十年代初，华裔加籍科学家高国楠发现 聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了 植物细胞融合的研究。
第七章-工业微生物原生 质体育种和原生质体融合
第一节 原生质体育种
一、原生质体再生育种 出发菌株的选择→菌种活化和与培养→原生 质体制备→原生质体再生→高产菌株分离→ 复筛→遗传性状鉴定→菌种特性和发酵特性 研究
二、原生质体诱变育种 菌种活化和与培养→原生质体制备→原生质 体悬浮液稀释至一定浓度，取一定放入无菌 平皿中→ 紫外灯下诱变处理→ 置暗处后处 理→ 再生培养→高产菌株分离→复筛→遗传 性状鉴定→菌种特性和发酵特性研究
✓ Novozyme234来自Trichoderma harzianum
✓ Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 ✓ Gglucuronidase葡聚糖甘酸酶
4、影响原生质体制备的因素
1)菌体的前处理 为了将菌作一些前处理使酶作用的效果好一 些， 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。
2)菌体的培养时间 选择增殖期的菌体，使细胞易于原生质体化。
5)破壁时的pH值:对离子强度影响较大
6)渗透压稳定剂
等渗透压在原生质体制备中起到保护原生 质体免于膨裂，有助于酶和底物的结合， 渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗 糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。
5、原生质体制备程序
• 菌体培养：液体培养 固体培养 • 收集菌体：过滤收集、离心收集无菌水冲洗 • 洗涤菌体：等渗液冲洗等渗液与酶液相同 • 酶解处理：保温酶解 稀释终止酶解，离心去酶 • 过滤分离：过滤去掉为分界菌丝体 • 查速离心：收集大小密度均一的原生质体，低速
• 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般 都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法
物理法、化学法及生物法 。 原理
增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法
在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
2、微生物细胞壁组成
• 微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成不同， 酶解处理的有效酶也不一样，因此要求根据微生 物种类特性选择合适的酶。
• G+:糖肽、低聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛 酸磷壁酸
• G-：糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂 蛋白、二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳 糖
真核细胞壁组成
3)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是 二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为 一的过程。
4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融 合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。
6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
融合过程中细胞膜变化
类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
五、原生质体融合技术
• 原生质体制备 • 原生质体纯化 • 原生质体融合 • 融合子检出 • 融合子鉴定
（一）微生物原生质体制备
1、定义及特点 定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生 质体。 特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操 作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操 作。 具有全能性，能再生细胞壁。
种类 疫霉属 毛霉属 酵母属 镰刀霉属 裂褶菌数 鬼伞属
纤维素 25 0 0 0 0 0
几丁质 0 9 1 39 5 33
其他多糖 65 44 60 29 81 50
3、制备原生质体的酶类
自然界中多种生物都能合成破坏降解菌体细胞壁的酶，如蛋 清中的溶菌酶，蜗牛消化酶，寄生性微生物合成酶。 包括： • 纤维素酶 • 酵母裂解酶 • 几丁质酶 • 商品酶：
（二）原生质体融合
1、融合亲本选育 • 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株
原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和 选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发 生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合 是有效的融合，概率为33.33%，当然还有多个原 生质体融合到一起的可能。
3)酶浓度
对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类 要求不同，对酶的浓度也有差异。最佳酶 浓度还随不同的生长期的菌体而变化。
• 酶浓度合适，浓度太高对原生质体有破坏 作用，影响原生质体的再生
4)酶处理温度 :根据具体情况,细菌高,酵母 及霉菌稍低。过高的温度使酶失活，原生 质体失活；过低的温度酶活性不高，影响 原生质体细胞膜稳定性
细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞 伴随者细胞融合技术的成熟。
20世纪80年代，真正意义上的细胞工程诞生了， 细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。
三、原生质体融合育种的特点
1)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件 下形成类似于球形的原生质体。
2)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中 任何一株都可能起受体或供体的作用，因此 有利于不同种属间微生物的杂交。