Western Blot相关试剂配方及详细实验步骤

Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。

1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。

1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。

1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。

1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。

1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。

1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。

1.8 脱色液（蛋白胶考染后脱色）甲醇 30 mL冰醋酸 10 mLddH2O up to 100 mL注意：甲醇具有挥发性，对人体的神经系统和血液系统影响最大，它经消化道、呼吸道或皮肤摄入都会产生毒性反应，甲醇蒸气能损害人的呼吸道粘膜和视力，使用过程中最好戴口罩。

脱色液常温放置即可。

1.9 考马斯亮蓝染色液（100 mL）考马斯亮蓝R-250 0.25 g甲醇 45 mLddH2O 45 mL冰醋酸 10 mL过滤除去颗粒状物质。

1.10 10×TBS缓冲液Tris (MW: 121.14) 12.11 gNaCl 87.66 gH2O up to 1 L调PH 7.4~8.0高压灭菌后，室温保存即可。

1.11 洗脱液(TBS-T)10×TBS 100 mLH2O up to 1 LTween 20/80 0.5 mL加了Tween 20/80后的洗脱液，需要置于4℃保存。

1.12 10×PBS缓冲液NaCl 80 gNa2HPO4 28.8 gKH2PO4 2 gH2O up to 1 L高压灭菌后，室温保存即可。

1.13 洗脱液(PBS-T)10×PBS 100 mLH2O up to 1 LTween 20/80 0.5 mL加了Tween 20/80后的洗脱液，需要置于4℃保存；PBS-T与TBS-T同功。

1.14 封闭液（现配）脱脂奶粉 5 g1×T/PBS-T up to 100 mL混匀后，与4℃可保存一周，若加了防腐剂，一抗可以回收循环使用直到杂不出蛋白为止。

1.15 一抗孵育液（鼠源His抗体为例）封闭液 15 mL鼠源His抗体 2 μL冰上操作，于4℃保存即可，可回收使用。

1.16 二抗孵育液（鼠抗为例）封闭液 10 mL鼠抗 2 μL现配现用，不用回收。

1.17 100 mM PMSF (苯甲基磺酰氟)PMSF 0.174 g异丙醇 up to 10 mL混匀后分装到1.5 mL离心管中，每管1 mL，置于-20℃保存，其工作液一般为1 mM，我们实验室使用的是2 mM的工作液，有剧毒，使用时注意安全，吸入、误服或通过皮肤吸收，都可致命。

2. 实验步骤（原核表达为例）2.1 菌种培养将原核表达载体转化BL21感受态细胞，之后涂板（含抗生素的培养基，一般是卡纳或氯霉素），过夜培养后，挑选单克隆到装有2 mL LB培养基（Kan+）的10 mL离心管中，在摇床中（37℃，225 rpm）过夜活化（12 h左右）。

2.2 原核表达菌扩大培养按1:100的比例稀释（如在装有25 mL抗性LB培养基的50 mL离心管中加入250 μL菌种培养液），在摇床中（37℃，225 rpm）培养2 h。

2.3 OD值测量提前开好超净工作台的紫外，将扩大培养的菌在超净工作台中吸取1 mL放入1.5 mL的EP管中，待检测，记得吸取无菌的LB培养基去调零。

大肠杆菌菌液OD值为0.5~0.6时为对数期最佳，此时的细胞活性最佳。

以A732的分光光度计为例，说明OD值测量的详细过程。

（1）开机：实验室的分光光度计有些问题，需要提前40 min打开，第一次打开，程序会卡在检查步骤四，需经过5 min后关掉，再打开，静候35 min。

（2）吸收光设置：按1（光度）→GOTO WL→输入“600”→ENTER→F1 (T% / ABS) →F3（测量屏幕）。

（3）调零：用1 mL移液枪吸取800 μL无菌的LB培养基（空白对照）加入比色皿中（应素平提供，若是全空的比色皿可能需要3 mL），放入测量位置→AUTO ZERO（稍等片刻，听到有跳闸声）→START→测得到LB培养基的OD值为0左右。

（4）菌液OD值测量：在超净工作台中量取1 mL菌液至1.5或2 mL PE管中，然后量取其中的800 μL至比色皿中（菌液换取应倒入固定的锥形瓶中，稍后高压灭菌，使抗生素失活），比色皿放入卡槽，点击START测量其OD值，将OD值调为0.6左右为佳（比如测到OD值为0.45，则再培养10 min继续测，OD 值为0.5~0.6最佳）。

（5）关机：RETURN→MODE→F3（是）→关闭电源，清洗比色皿。

2.4 IPTG诱导吸出5 mL左右作为对照（不加IPTG），剩余的菌液中加入IPTG，其工作浓度约为0.8-1.0 mM（如在23 mL菌液中加入23 μL 浓度为1 M的IPTG），置于摇床中，16℃诱导培养10-12 h（注：IPTG浓度和诱导温度需要摸索，不同蛋白可能不一样，IPTG有毒，操作小心）。

如果没有蛋白表达就需要筛选条件了，如进行过0.4 mg/20 mL ，0.6 mg/20 mL，0.8 mg/20 mL，1.0 mg/20 mL，摇床温度25或28℃等。

2.5 收集细胞吸出1.8 mL菌液于2.0的EP管中，4℃，5000 rpm离心10 min收集细胞，将上清倒掉，加入1.8 mL PBS重悬（或bing buffer）细胞，并加入PMSF使终浓度为2 mM，并将其转移至5 mL离心管中，准备破碎细胞。

剩余的菌液于A732的立式离心机，4℃，5000 rpm离心10 min收集细胞，沉淀可以在-20℃保存；待日后使用。

2.6 细胞破碎利用超声波破碎仪裂解细胞，工作5 s停5 s，打8 min，看到原来比较浑浊的菌液变得比较澄清，说明细胞破碎得很好。

裂解过程需低温处理，将样品放于冰水混合物中进行破碎操作；细胞破碎后，12000 rpm，1 min，收集上清和沉淀，或将上清分装到1.5 mL离心管中，每管20 μL，保存于-80℃。

或直接进行SDS-PAGE检测，确定蛋白是否表达出来，是否会形成包埋体，同时调整蛋白浓度。

2.7 蛋白胶的制备先将玻璃板和梳子洗干净，晾干，然后配胶。

13% 分离胶的配制：去离子水 2.7 mL30% 丙烯酰胺 4.6 mL1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)2.5 mL10% SDS 100 μL10% AP 100 μLTEMED(四甲基乙二胺) 4 μL按如上顺序加样，加到SDS之后的样品都需要用枪头搅拌混匀，用1 mL的枪吸取分离胶加到已装好的板子上，然后用去离子水压线，大约半小时即可凝固。

注意：AP（过硫酸铵）对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性，吸入后引起鼻炎、喉炎、气短和咳嗽等；眼、皮肤接触可引起强烈刺激、疼痛甚至灼伤。

口服引起腹痛、恶心和呕吐。

长期皮肤接触可引起变应性皮炎。

TEMED(四甲基乙二胺)有毒，易燃，有腐蚀性和刺激性。

<5% 浓缩胶的配制：去离子水 3.4 mL30% 丙烯酰胺 830 μL1.0 M Tris-HCl (PH=6.8) 630 μL10% SDS 50 μL10% AP 50 μLTEMED 5 μL按如上顺序加样，加到SDS之后的样品都需要用枪头搅拌混匀，将压线的水倒干净，然后用1 mL的枪吸取浓缩胶加到已装好的板子上，插梳子，给1小时凝固时间。

2.8 煮样将已经分装好的20 μL/ 1 EP管中加入5 μL的5×Loading buffer，在煮样机中100℃煮12 min。

目前比较惯用的做法是将样品放到PCR管中，利用PCR 仪进行蛋白质变性工作。

2.9 点样跑胶Marker 为6 μL，样品7 μL，所有孔都要点上样品，让其平衡。

跑浓缩胶的条件为恒压90 V/20 min，分离胶为110 V/1.5 h，电泳至前沿溴酚蓝刚刚跑出。

注：①用移液器取7 μL样品；tip投紧靠玻璃板，慢慢加入样液，加入上样孔中切勿产生气泡（样液中一般会加入溴酚蓝作为指示剂）；②上样完成后，检查Running buffer是否过最低玻璃板，即胶块要浸在Running buffer中才能有电流通过；（使用新鲜的buffer）；③组装电泳仪（红色部分对准红色电极，黑色部分对准黑色电极），矮的一面在内测，待会会浸泡在Running buffer中。

90V，电流在60 mA左右为正常。

（先采用90V跑浓缩胶，后采用110V跑分离胶）2.10 考染用考马斯亮蓝考染1小时，然后用去离子水煮法脱色，考马斯亮蓝可以回收循环利用（先倒在小烧杯中，再倒到瓶子里）。

水煮法是先用1 L烧杯盛500 mL 水在电炉上煮开，然后放胶进去煮10分钟左右，然后换水，再煮，重复3次左右即可，注意不要让胶折叠，不然边缘有缺口的地方会裂，导致蛋白胶断裂；脱色好的胶拿到8楼的显影仪照胶。