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Western Blot 实验步骤(自己总结)

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Western Blot步骤北京协和医学院 阜外心血管病医院 心外科 心血管病国家重点实验室吴益和一．心肌总蛋白提取（一）——TRIzol® Reagent蛋白质的提取1. 准备试剂：异丙醇；含0.3M盐酸胍的95%乙醇；无水乙醇； 1%SDS。

1. 含0.3M盐酸胍的95%乙醇：盐酸胍（分子量95.53）：95%乙醇=14.3295g：500ml2．1%SDS：SDS：H2O=0.5g：50ml2. 操作步骤：1. 取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～8℃12000×g离心10分钟弃上清；2. 准备0.3M盐酸胍（guanidine hydrochloride）的95%乙醇洗涤液；3. 用含0.3M盐酸胍（guanidine hydrochloride）的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。

每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟（Note: .蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇中2～8℃一个月以上或-20℃一年以上）；4. 2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清；5. 重复3-4两次以上；6. 在三次洗涤后加2ml无水乙醇到蛋白质沉淀中，涡旋混匀15秒（Note: .蛋白质沉淀可保存在无水乙醇中2～8℃一个月以上或-20℃一年以上）；；7. 室温下孵化20分钟；8. 2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清；9. 风干蛋白质沉淀5-10分钟(可以延长时间直到满意为止)，不要干燥过度；10.蛋白质重悬浮：1）用1% SDS（十二烷基硫酸钠）溶解蛋白质(200 μL)，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解；2）2～8℃10000×g离心10分钟除去不溶物；3）将包含蛋白质的上清转移到新的EP管中（此时分离得到的蛋白质样品可直接用于Western Blot（之前先测浓度）或-20℃保存备用）；4）因为不同溶剂中某些蛋白质的溶解性不同，SDS溶液中蛋白质的可溶性差，如果蛋白质沉淀在SDS溶液中不可溶，那么可以选择下面的溶剂(Hummon et. al., 2007)来溶解蛋白质沉淀：1% SDS and 62.5 mM sarkosyl（肌氨酰:裂解病毒颗粒或感染细胞的一种去污剂）at pH 8.0–8.8；　9.5 M urea and 2% CHAPS, pH 9.1； 250mM glycerol（甘油）, 10mM TEA, and 4% CHAPS； 2% diethylamine（二乙胺）； 10M Urea（尿素）。

3. 常见问题分析：1. 得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底；B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。

2. 蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。

3. 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。

要不直接用裂解液或SDS缓冲液来代替1% SDS溶解蛋白质采用上述方法提取的蛋白，可以用lowry法或BCA法进行蛋白定量一．心肌总蛋白提取（二）——裂解液法提取总蛋白1．材料心肌：手术室活检标本试剂：蛋白裂解液,碧云天，产品编号P0013仪器：组织匀浆机，Tekmar2．方法和过程：(1)将心肌组织块（2×2×2mm）放入含有裂解液的1.5ml EP管中（裂解液含量视组织量而定），用微量匀浆器进行冰上迅速低温匀浆，直到看不见颗粒为止。

（如果需要测磷酸化蛋白，则在裂解液中加入磷酸酶抑制剂（普利来公司），具体方法见说明书）(2)将匀浆液移至EP管中，冰上放置10分钟，14000rpm/min，4℃，离心15分钟，取上清，-80℃保存备用，待测浓度。

二．蛋白浓度测定1．材料准备：试剂：碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）产品编号P0010仪器：酶标仪（BIO-RAD 680）2．方法步骤（见试剂盒说明书）：(1)取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（30mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。

配制后可立即使用，也可-20℃长期保存；(2)稀释标准品：取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至0.5mg/ml(蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。

但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品)。

稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可-20℃长期保存；(3)配制BCA工作液：按50体积试剂A加1体积试剂B配制适量工作液，充分混匀（配制的量视样本量而定，200µl/孔）。

工作液室温24小时内稳定。

(4)加标准品：将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20µl加入96孔板的标准品孔中（做副孔），加标准品稀释液补足到20µl。

(5)加样品：加2μl样品到96孔板的样品孔中，加18μl PBS(最好用1%SDS或裂解液，保持与原样本中的一致)，使总体积达到20μl。

(6)加工作液：每孔加入200µl步骤2所配制工作液。

(7)37℃静置20-30分钟。

可室温放置2小时。

(8)酶标仪测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。

(9)EXCEL绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。

附：倍比稀释方法1.取8个EP tubes；2.第1管加入25μl 0.5mg/ml蛋白标准品，其余各管加入25μl ddH2O(最好用1%SDS或裂解液，保持与样本中的一致)；3.向第2个tube中加25μl BSA蛋白标准品，混合均匀后从第2个tube中取25μl稀释后的BSA到第3个有25μl ddH2O的tube中，混合均匀；再从第3个tube中取25μl第二次稀释后的BSA到第4个有25μl ddH2O的tube中；……直到第7个tube；4.第8个管为空白孔，单加ddH2O(最好用1%SDS或裂解液，保持与样本中的一致)；5.如此配制出稀释了1倍，2倍，4倍，8倍，16倍，32倍,64倍，空白……的蛋白标准品溶液。

三．Western Blot用蛋白样品制备1．材料：5×loading buffer（普利莱公司）或4×loading buffer（Takara公司）2．方法：样品 40μg蛋白量 10-40µg,我的20µg足已4μl（20μl体系）/6μl（30μl体系）5×SDS loading buffer或4×loading buffer 5μl（20μl体系）/7.5μl（30μl体系）上样缓冲液中含有DTT，不需要再加DTT加ddH2O 至总体积20μl（30μl）100℃，加热5min使蛋白变性，立即放冰中速冷，-20℃放置备用。

（上样总体积一般不超过20μl，加样孔的最大限度可加30μl样品。

）四．聚丙稀酰胺凝胶电泳1. SDS聚丙稀酰胺凝胶的配制（自制胶）准备：玻璃板用水冲干净，直立晾干，餐巾纸擦干净。

装上玻璃板，前后推动，最后往前拉些距离，扣上开关。

槽下面的海绵条带些水，可以部分抵抗漏水。

放装有玻璃板的架子于槽上，先放下部，再靠上部，加紧。

加入水，液面稍高些，等15分钟，看是否漏水。

然后拿整个槽将水倒掉，再用吸水纸吸干玻璃板内的残余水份。

1）安装玻璃板z玻璃板洗干净即可z小玻璃板向前，两玻璃板间夹上spacer，拧紧螺栓固定（安装一定要平，防漏水）z加满蒸馏水，看是否漏水，静置 15min（记录漏液体积，以胶补充）z用窄滤纸条吸干两玻璃板间的水滴2）按分子量配制一定浓度的分离胶（12%，体积10ml）ddH2O 3.3ml 30%丙烯酰胺溶液 4.0ml1.5 mol/L Tris（PH8.8）2.5ml10%SDS溶液 100μl10%过硫酸铵（AP） 100μlTEMED 4μlz加TEMED之前，充分混匀内容物，一旦加入TEMED，快速旋动混合物。

z在两玻璃板的间隙中灌胶，每板约3.5ml，加至旁边绿色柱子的上缘（如开始有漏液现象，则要补上漏的那部分体积）z在胶溶液上加满ddH2O（或加无水乙醇可以消泡），室温30min（可防止氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应）附：标准的：SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kDa）15 10-4312 12-6010 20-807.5 36-945.0 57-212网上的：分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质<10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-10>5×1052-5核酸(RNA)<10415–20104–1055-10105-2×1062-2.63）分离胶聚合完全后倾去上层水，用窄滤纸尽可能排去凝胶上的水，再用纸巾的边缘吸净残留液体（倾斜胶，吸水纸放于一侧洗净水分），用记号笔做一个分离胶上沿记号，以备电泳换压。

4）按试剂配制部分给出的数值在小瓶中配置5ml/2块板的积层胶ddH2O 3.4ml 30%丙烯酰胺溶液 830μl1.0 mol/L Tris（PH6.8） 630μl10%SDS溶液 50μl10%过硫酸铵（AP） 50μlTEMED 5μlz加TEMED之前，充分混匀内容物，一旦加入TEMED，快速旋动混合物z在两玻璃板的间隙中灌胶，每板约2mlz灌好胶后立即在积层胶溶液中插入Teflon梳子，小心避免混入气泡z再加入积层胶以充满梳子之间的空隙，室温下垂直放置30min。

等待期间拿出蛋白marker及样本放在冰中，并配制1×电泳液：400ml 5×电泳液+1600mlddH2O。

每个电泳槽内加大约800ml电泳液，先加外槽，再加内槽。

内槽必须用新的电泳液，外槽可以用旧的电泳液（只能用2次）。

附：制备胶1. 不同分子量需要的缓冲液：15 kDa to 260 kDa (MOPS Buffer),3.5 kDa to 160 kDa (MES Buffer)2. 拿出蛋白marker及样本放在冰中，并配制1×电泳液：每次需500ml， ddH2O稀释。

3. 每个电泳槽内加大约500ml电泳液，先加内槽观察有无漏水，再加外槽。

内槽必须用新的电泳液，外槽可以用旧的电泳液（只能用2次）。

2. 上样电泳注：上样体积＜30ul,蛋白50-100ug（我的10-40ug）1）拔去梳子，用洗瓶加蒸馏水洗涤加样槽去除未聚合的丙烯酰胺(制备胶不用)。

2）把凝胶固定在电泳装置上，内外槽均加入1×Tris-Gly电泳缓冲液（固定凝胶时，短面玻璃朝里，制备胶则是有字方向朝外）z每个电泳槽内加大约500ml电泳液，先加内槽观察有无漏水，再加外槽。

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western blot实验流程(自己整理)

western blot实验流程(自己整理)

Western Blot实验步骤1.制胶2.细胞蛋白抽提步骤1.提前预冷离心机，溶解lysis buffer；2.将细胞沉淀置于冰上；1ml PBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；3.每107cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；4.置冰上10min，其间振荡2-3次；5.13000rpm离心10min，4℃；6.将上清转到小离心管中；7.取出1ul，用于Bradford测定蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率100℃，5min；提前预热。

中间打开盖子1~2次。

6.上样电泳（100V，90min）向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。

玻璃板内侧液面高于外侧。

然后开始上样，保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。

上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。

通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。

电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3 小时。

电泳时间根据具体情况定。

7.转膜（250mA，1h 30min）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板湿式电转膜1. 电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。

按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC 膜与胶，NC 膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。

2. 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC 膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。

westernblot电泳原理及步骤

westernblot电泳原理及步骤

westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。

它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。

二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。

-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。

-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。

2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。

-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。

-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。

3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。

-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。

-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。

-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。

-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。

三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。

-完全溶解样品，可加热至95°C处理。

2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。

-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。

-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。

3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。

-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。

Westernblot实验步骤及注意事项_WesternBlotting_易生物

Westernblot实验步骤及注意事项_WesternBlotting_易生物

Westernblot实验步骤及注意事项_WesternBlotting_易⽣物Western blot实验步骤及注意事项2009-05-25 23:46:38来源：易⽣物浏览次数：0 ⽹友评论 0条关键词：Westernblot⼀.实验步骤1. 组织块称重2. 利⽤液氮、研钵粉碎组织块3. 加⼊RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30µl，10 mg/ml PMSF），利⽤Polytron进⼀步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加⼊PMSF（每克组织30µl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移⼊离⼼管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进⾏Bradford⽐⾊法测定蛋⽩质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋⽩质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸⽔浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜⽤丽春红染⾊，胶⽤考马斯亮蓝染⾊14. Westernblot 试剂盒显⾊15. 分析⽐较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋⽩质电泳转移到硝酸纤维膜上。

1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，⽤5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的⽓泡。

2）在凝胶/滤膜外再包⼀张3mm滤纸（预先⽤转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有⽓泡。

3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照⼚家建议⽅法放⼊电泳装置中，凝胶⾯向阴极。

4）将上述装置放⼊缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

5）按照⼚家所⽰接通电源开始电泳转移。

6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

2. 将薄膜漂在氨基⿊中快速染⾊，直⾄分⼦量标准显现时取出，记录下标准位置。

WesternBlot操作流程

WesternBlot操作流程

WesternBlot操作流程Western Blot操作流程本⼈将⾃⼰做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。

因为每个实验室的条件不⼀样，所以本流程仅供参考，具体适合⾃⼰的实验操作需要⼤家摸索。

由于知识量有限，有些描述⽤词并不专业，请⼤家谅解。

⼀、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使⽤⽴春红检测是否蛋⽩是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：⼩⿏抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：⼭⽺抗⼩⿏，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影⼆、物料及配制1、电泳液：⼀包电泳粉+1000ml双蒸⽔（可回收使⽤）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸⽔3、转膜液：⼀包转膜粉+800ml双蒸⽔+200ml甲醇（可回收使⽤）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸⽔+1ml吐温20。

（⽆需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将⼩⿏抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待⽤，4度保存。

Ⅰ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待⽤，4度保存。

7、Ⅱ抗（内参）：将⼭⽺抗⼩⿏：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代⽤，4度保存。

Ⅱ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将⼭⽺抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待⽤，4度保存。

7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使⽤8、定影液：按说明书配制，可长期回收使⽤9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（⼀）制胶1、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制2、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所⽤溶液3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。

2）依次将所需试剂加⼊烧杯中，加⼊TEMED之后，混匀，⽤1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的⾓交替加⼊分离胶溶液，也可从左到右连续加⼊（⽬的：两种⽅法都可以使液⾯快速达到⽔平状态）。