Western blot实验流程

Western blot一.仪器及器皿：棕色广口瓶5个(50ml)，灭菌，烧杯3个灭菌，EP管，枪及枪头，分光光度计，超声破碎机，冷冻离心机，灭菌0.9%生理盐水，冰，灭菌水(1000ml)，两套灭菌器械。

二.药品配制：1.TBS×10(Tris Buffered Saline)：2.42 g Tris base8g NaCl100ml H2O, 用HCl调pH 7.6，4°C保存.(配TBST用)2．TBS：0.303 g Tris base0.4383g NaCl (150mM)0.05gSDS用HCl调pH至8.0(配裂解液用)，50ml约用2.1mlHCl。

3．0.5M Tris-HCl(pH6.8),50ml,:3gTris-base加灭菌水约30ml,用6N盐酸缓缓调pH至6.8（约用1ml），定容至50ml，4℃保存。

(若调小了，用5.6%NaHCO3调回) 。

1.5M Tris-HCl(pH8.8),50ml,9.08gTris-base加灭菌水约40ml,用6N盐酸缓缓调pH至8.8（约用2ml），定容至50ml，4℃保存。

4．5×Running buffer pH8.3,500ml：Tris-base 7.5g,Glycine(甘氨酸) 36g,SDS 2.5g加灭菌水至500ml, 4℃保存,用时若有沉淀析出可提前拿出置37℃，不用调pH值，用时按1：5稀释，即60ml的5×Running buffer加入240ml水。

5．30%acrylamide(丙稀酰胺贮液)：8.76g acrylamide, 0.24g N, N'-methylene-bisacrylamide(亚甲基双丙烯酰胺)，加少许灭菌H2O搅匀，最后定容至30 ml 。

用0.45 µm的过滤器过滤后4°C避光可保存30天。

6．10%SDS：5gSDS+50 ml H2O,(难溶，需较长时间)，常温保存。

7.10%APS (ammonium persulfate，过硫酸铵(粉剂也保存在4°C)：100mg APS +1ml H2O,EP管中即可，4°C保存1周，-20°C保存1个月，时间长了胶难凝。

.8.0.1% bromophenol blue dye溴酚蓝10ml溴酚蓝10mg加ddH2O至10ml，搅匀溶解，过滤除去未溶颗粒。

9. 2×Sample buffer(1:1)避光保存10%SDS (1g/10ml) 400μl0.5M Tris(pH6.8) (0.6055g/10ml) 250μl100% Glycerol(甘油，丙三醇) 200μl2-mercaptoethanol(巯基乙醇) 100μl0.1% bromophenol blue (10mg/10ml) 80μl总计1030μl 避光4°C保存。

4×Sample buffer(1:1)避光保存：10.胶Stain Solution(蛋白染液):100mgCoomassie Brilliant Blue G 250(考马斯亮蓝)溶于50ml95%的乙醇，加入100ml 85%的H3PO4,及50mlddH2O, 4°C保存于棕色瓶中。

Coomassie Brilliant Blue R 250(考马斯亮蓝-R250)：R250 0.5g甲醇 225ml →定容至500ml冰醋酸 50ml11. 胶Destain Solution(脱色液)for Coomassie Brilliant Blue：acetic acid(冰乙酸) 100mlmethanol(甲醇) 100ml加水至1000ml .若转完膜后染色则不用10及11，改用12和13。

12.NC膜染色液：0.1%氨基黑染液：氨基黑 0.2gmethanol(甲醇) 90ml冰醋酸 20ml加水至200ml.13．NC膜脱色液：methanol(甲醇) 180ml冰醋酸 4ml加水至200ml.14．配转膜液(transfer buffer)：Tris 6.06gGlycine 28.8gMethanol (甲醇) 400mlDDH2O to 2000ml，混匀后不用调pH值， 4℃保存。

(提前将前两种配成800ml，为2×transfer buffer转膜时取400ml加入400mlH2O，另加200 ml Methanol (甲醇)即可)。

注：所用水最好为灭菌的去离子水便于长期保存。

三实验步骤.(一)提取蛋白并测蛋白浓度：1．开离心机，4 °C；2. 配裂解液：1mlTBS(pH至8.0)加入10μlNP-40,1μl Pepstatin(1μg/ml), 胃蛋白酶抑制剂A，溶于DMSO（二甲基亚枫），-20°C保存1μl Leupeptin(1μg/ml), 亮抑蛋白酶肽，溶于ddH2O,-20°C保存1μl Aprotinin(1μg/ml),抑蛋白酶肽，溶于ddH2O,-20°C保存。

5μl PMSF(100μg/ml),phenyl methylsulfonyl fluoride ,苯甲基磺酰氟，溶于异丙醇（isopropanol），-20°C保存。

3．拿冰置于冰盒内，裂解液配好后即放于冰水上；4．用1%戊巴比妥钠麻醉后取材，最好小于100mg，用冷TBS或冷生理盐水冲洗后（做蛋白最好灌流，做RNA要用70%酒喷毛，若不即用可在液氮中冷冻30min后，-70°C保存），加入裂解液(100mg/ml)，放于冰上，剪碎组织；剩余裂解液仍放于冰上，以备稀释样品用；5．超声破碎，小烧杯内有冰，EP管置于冰水上，稳定并降温，4×10s，560W，间隔10S，超至无块状即可；6．离心4 °C，12000g，20min离心机转动时打至time档性能稳定；开分光光度计，595nm；7．于灭菌烧杯中配染液：4ml(protein dye regent, Sigma)+16mlH2O8.配标准蛋白，成倍数(根据药盒说明，有线性关系的浓度分别为0,0.15，0.3，0.6，0.9μg/μl ，因此0.3μg/μl 的标准蛋白各取0.5，1，2，3μl，各两个样，取0.5μl时要在液面上吸，每次取完液要目测一下，2μl 为最下线，10μl为第二线)，并加入1ml染液；震荡混匀，测标品吸光值595nm，以备做曲线；用BLANK调0，再由低浓度向高浓度测，间隔时只需倒置于滤纸上吸干残液即可，箭头朝向光束方向，手指不要摸光面，杯内若有气泡，停一下再测，放置比色杯时位置要固定，用染液洗杯，用1cm光路测；9．取上清放于新EP管中，放于冰水上，取1μl加19μl ddH2O稀释20倍，从中再取1μl加入1ml 染液，室温后5min，测吸光值，各有两个样，应在混匀后30min之内测完。

10．对标品用Excel做图，输入吸光值及对应浓度（包括空白），做散点图，完成图后添加趋势线，截距为0，公式及R2(相关系数)均选，得到相应公式（Y= B×X），再计算浓度即可，结果应×20(稀释倍数)。

加样时每个孔应有50μg,用50/浓度即为加样量μl。

样品即用可放于冰上，否则分装后放于-70℃。

(二)电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis）1．检查电泳所需的各种试剂和器械（BIO-RAD第3代产品），并从4℃拿出药品；2．清洗电泳所用的玻璃板（平时浸泡于洗洁精液中），擦酒精(70%)，晾干或60-70℃烤干；3．装置电泳玻璃板（长板在内短板在外）并固定（卡住）；4．APS 和TEMED要最后用时再加，混匀，每边用枪从板左上角加入4ml，枪头内胶不要全推出，即再吸再加入，防止出气泡，加胶比5cm的刻度线稍高，用去离子水滑行方式加满覆盖压住胶（因为只在一角加入会使胶面不平），使凝固（水封下出现折光面），除去水层，用水冲洗2次，并用滤纸吸干残留的水分；等约30min。

加入浓缩胶,每边加满，立即插上梳子（平整面朝内，先一端插入，缓慢斜放至另一端插入）注意不要有气泡，可用70%酒精排出；等30min左右。

加完浓缩胶立刻开始准备样品，并打开水浴锅，100℃；胶凝后（可见齿边缘与胶有空隙）垂直拔出梳子；先用去离子水冲洗加样孔，再用Running buffer冲洗；5．准备样品，每孔使用总蛋白量50微克，计算使用的样本量，根据loading buffer的浓度，加样量为10μl，即样本量(50/浓度)用裂解液补充总体积至5μl再加入5μl Sample buffer（2×），另有marker 和一个Sample buffer（1×），上样时加在一侧（防止跑歪），也可不用。

（先加水，再加5μl Sample buffer，最后加蛋白），加完后离心再100℃水浴5min后放于冰上，准备上样。

6．放好电泳槽，将制好的胶板反过来（短面在内，如果跑单面胶，则放置好胶板后，另一面放塑料板，字面向内，夹紧），外加旧缓冲液Running buffer，两板之间加入稀释5倍的新缓冲液Running buffer(约用150ml，即35ml5×+140ml水)。

上样，吸样时枪要大于10μl（先调至8μl，再向大量程调枪，则余下进入，并保证枪尖上无气泡，但枪尖和管壁不要贴得太紧）。

100V，20min，再200V，45min。

（若在冰盒中电泳，时间可稍延长，但是浓缩胶一定要跑完才可以变电压再跑分离胶）。

(三)电泳转膜1．溴酚兰快达底部即可停止电泳；2．(切下Marker及样品1、 2、3的胶，用Coomassie Brilliant Blut G(考马斯亮蓝)染色约30min （摇床）后用Destain脱色液脱色2h，并于凝胶成像中观察)此步可省，可在转完膜后，将膜剪下再用氨基黑染色；3.配转膜液1000ml：取400ml 2×transfer buffer加入400mlH2O，另加200 ml Methanol (甲醇)即可；再加入1ml10％SDS利于转膜；4. PVDF 膜预处理：用甲醇浸泡1min→ddH2O 3个5min→转膜液浸泡15minNC膜（nitrocellulose membrane，硝酸纤维素膜）(8.5×5.5cm)直接用转膜液浸泡10min 切4张8.8×5.8cm滤纸(Whatman 3mm层析纸),与海绵垫均用转膜液浸泡10min；切除浓缩胶(记清方向及要剪下染全蛋白的膜长度，并用铅笔标记于NC膜上)，将胶于转膜液中浸泡10min；5．摆放顺序夹子黑色面+海绵(聚乙烯板)+2滤纸+凝胶（剪左角）+NC膜（不分正反面）+2滤纸+海绵+夹子白色面（三明治），注意每放一层用玻璃棒赶一次气泡，并要始终保持湿润，否则胶易碎；将三明治固定在转膜槽内，且夹子黑色面对转膜槽黑色面；一定要赶净气泡，否则会产生高背景或影响蛋白转移。