SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。

其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。

具体原理如下：
1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。

2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。

3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。

4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。

5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。

需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。

下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。

SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。

相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。

蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。

通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。

这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。

SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。

（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。

这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。

（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。

随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。

（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。

目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。

SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。

其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。

通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。

实验教学教案首页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量（设计性）相关知识1.电泳？2.影响电泳速率的因素？3.SDS 的作用？4.β－乙醇的作用？ 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）：3.分类：自然胶电泳、变性胶电泳、等电聚焦电泳、梯度胶电泳、双向电泳、印迹转移电泳。

4.不连续缓冲系统：SDS －PAGE 电泳体系为不连续电泳体系。

5．分离胶浓度的选择和配制方法SDS *双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。

常用的标准蛋白质的Mr丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺TEMED过硫酸铵聚丙烯酰胺凝胶 ＋pH 6.8pH8.8Tris-GlyTris-Gly pH8.3不同分离胶的配制方法5%注意：根据实验目的、实验要求、实验条件在实验前写出实验设计方案一、实验目的、实验要求、实验条件实验目的1．用SDS－PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量；2．熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。

实验要求1.能够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，注意几个设计点:①如标准蛋白质的选择依据；②分离胶的确定与制备：浓度大小的依据是？分离胶配制量多少的依据是？③灌胶方法的选择？④上样量的确定：依据蛋白质浓度大小确定上样量，一般是样品在含1~6种蛋白且各占比例相当的情况下浓度在1~2mg/ml时、对凝胶大小在8×8.2时，上样量为10~20ul；⑤电泳时电压控制多大的选择；⑥能够对实验过程中出现的问题加能解决，能够独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。

2．利用标准曲线计算出待测蛋白质样品的Mr。

实验条件1．实验所需的实验试剂和材料。

2.实验所需的主要实验仪器。

二、实验原理带电颗粒在单位电场中泳动的速度称为迁移率或泳动度（mobility）。

泳动度与带电颗粒所带静电荷的数量、颗粒大小和形状有关。

一般来说，颗粒所带静电荷的数量越多，颗粒越小，越接近球形，则泳动度越大。

SDS即十二烷基硫酸钠（sodium dodycyl sulfate），是一种阴离子去污剂。

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实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。

在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品, 则蛋白质分子中的二硫键被还原, 1g蛋白质可定量结合1.4g SDS。

由于SDS呈解离状态, 使蛋白质亚基带上大量的负电荷, 其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度, 在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时, 它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离, 有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。

用这种方法测定蛋白质的Mr, 简便、快速, 只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。

所得的结果, 在Mr为15000~200000的范围内, 与用其他方法测得的Mr相比, 误差一般在±10%以内。

因此SDS测定Mr的方法, 已得到非常广泛的应用和迅速的发展。

现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。

实验证明, 在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后, 巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。

在一定的条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。

由于十二烷基硫酸根带负电, 使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷, 它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。

1.在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时, 应注意以下几个问题:如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象, 就不能得到准确的结果。

影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个: ⑴二硫键是否完全被还原: 只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下, SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去, 并使之具有相同的构象。

实验七 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量一、 实验原理了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量 二、实验原理带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液(η)条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。

若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。

1967年Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate ，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。

加入SDS 之所以能获得如此的效应，是因为SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。

同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS 相结合[溶液中的SDS 总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W ／W)的比例结合]，形成SDS 一蛋白质复合物。

其结果： (1)由于SDS 解离后带有很强的负电荷，致使SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。

(2)SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。

不同SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。

这样SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。

需要注意的是：为使SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。

因此，在用SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种经常使用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合进程由自由基催化完成。

的经常使用方式有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以(TEMED)为加速剂。

在聚合进程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维。

PAGE依照其有无浓缩效应，分为持续系统和不持续系统两大类，持续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，要紧靠电荷和。

不持续系统中由于离子成份，pH，凝胶浓度及电位梯度的不持续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因此其分离条带清楚度及分辨率均较前者佳。

不持续体系由电极缓冲液、浓缩胶及所组成。

浓缩胶是由AP 而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为Tris-HCl。

电极缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH 值使不持续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成份的不持续性，这是样品浓缩的要紧因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的断裂。

在和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，如此就排除不同分子间的电荷不同和结构不同。

SDS-PAGE一样采纳的是不持续缓冲系统，与持续缓冲系统相较，能够有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，通过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭小的区带。