下载文档原格式
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过电泳分离蛋白质样品的方法得到了广泛的应用。
本文将着重介绍SDS-PAGE电泳的基本原理。
一、SDS-PAGE电泳的概念SDS-PAGE是一种已经被广泛应用的蛋白质分离技术，它的全称是聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。
这种电泳技术利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过直流电场将蛋白质样品分离出不同电荷和大小的蛋白质成分。
二、SDS-PAGE电泳的原理1. 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳中所使用的凝胶是由聚丙烯酰胺构成的。
聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，可以根据蛋白质的大小和电荷来调整孔隙的大小，从而实现不同大小的蛋白质的分离。
2. SDS处理SDS是指月桂基硫酸钠，它是一种阴离子表面活性剂。
在SDS-PAGE 电泳中，将样品中的蛋白质经过SDS处理后，蛋白质表面都会均匀地吸附一定数量的SDS分子，并且使蛋白质呈负电荷。
这样，所有的蛋白质分子都会带有类似的电荷密度，可以消除蛋白质的本身的电荷特性，使蛋白质在电场作用下只受到电场力的作用，而不受到其他因素干扰。
3. 蛋白质分离将经过SDS处理的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，然后通过电泳进行分离。
经电泳分离后，蛋白质会根据其大小和电荷迁移到不同位置，从而使不同的蛋白质分离开来。
三、SDS-PAGE电泳的应用SDS-PAGE电泳技术在生物化学和分子生物学研究领域应用广泛。
它可以用于研究蛋白质的分子量、纯度和比例，也可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，同时还可以用于鉴定蛋白质的异构体等。
四、SDS-PAGE电泳的发展SDS-PAGE电泳技术自问世以来，经过不断的改进和完善，在蛋白质分离和分析领域一直处于领先地位。
未来，随着科学技术的不断进步，SDS-PAGE电泳技术也将会迎来新的发展，并在更广泛的领域得到应用。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
通过SDS（十二烷基硫酸钠，Sodium Dodecyl Sulfate）将蛋白质变性并赋予负电荷，在凝胶电泳中，根据蛋白质的分子量大小，使蛋白质在电场中向阳极方向运动，从而实现蛋白质的分离。
SDS-PAGE广泛应用于蛋白质的分子量测定、复杂蛋白质混合物的分离、蛋白质组学研究等领域。
它具有简单易行、高分辨率、高灵敏度以及可以与其他技术（如质谱、Western blot 等）结合等优点。
本文将介绍SDS-PAGE的原理、实验步骤和关键注意事项，并提供相关的Markdown文本格式输出，以便读者在实验中参考。
2. 原理SDS-PAGE的原理基于SDS的作用。
SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，能够使蛋白质在水溶液中均匀地带上负电荷，同时使蛋白质变性并展开成线性构象。
在电泳过程中，SDS包裹在蛋白质中，使蛋白质的电荷密度保持均一，从而使蛋白质的迁移速率仅与蛋白质的分子量有关，而与蛋白质的电荷无关。
SDS-PAGE通常在聚丙烯酰胺凝胶上进行。
聚丙烯酰胺是一种化学稳定性强的凝胶材料，通过聚合物的交联形成网状结构。
在凝胶电泳过程中，根据蛋白质分子量的不同，蛋白质能够在凝胶孔隙中以不同程度的速率迁移。
3. 实验步骤3.1. 制备凝胶1.准备1.5 M的Tris缓冲液，pH 8.8。
2.准备汀凝胶的原液，将30%丙烯酰胺溶液、1.5 MTris缓冲液和10%过硫酸铵按照体积比例（29:1:10）混合均匀。
3.快速加入TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）溶液至原液中，并迅速倒入凝胶模具中。
4.在凝胶模具上方加入异丙醇以防止凝胶表面生成凝胶。
3.2. 样品处理1.取适量的蛋白质样品。
2.加入相应的样品加载缓冲液（含有SDS和还原剂，以及测量样品体积比例的溶液）。
3.在冰上煮沸5分钟，使蛋白质样品变性并带上负电荷。
第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。
SDS-PAGE电泳的基本原理和应用1. SDS-PAGE电泳的基本原理1.1 电泳原理SDS-PAGE是一种基于凝胶电泳的蛋白质分析技术。
其中SDS是十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate）的缩写，是一种表面活性剂，能够使蛋白质样品中的蛋白质在电场作用下带负电荷，同时也能够给蛋白质提供线性结构。
1.2 凝胶电泳凝胶电泳是一种利用膠體凝膠將生物物质分开的电泳技术。
在SDS-PAGE中，常使用聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）作为电泳介质。
聚丙烯酰胺凝胶是一种聚合物凝胶，通过调整聚丙烯酰胺单体和交联剂的比例，可以调整凝胶的孔径。
1.3 SDS-PAGE的步骤SDS-PAGE主要包括以下几个步骤：•准备样品：将待测蛋白质样品添加SDS、还原剂和草酸，使蛋白质样品变性和解离。
•准备凝胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，将之倒入电泳槽中，插入电泳板。
•加载样品：将准备好的样品加入凝胶双孔板中，注意标记样品位置。
•电泳：将准备好的样品盖在电泳槽上，接上电源进行电泳分离。
•显色染色：将分离出的蛋白质进行显色染色，以观察结果。
•图像分析：利用成像仪或凝胶图像分析系统对染色的凝胶图像进行定量分析。
2. SDS-PAGE电泳的应用2.1 蛋白质分析SDS-PAGE电泳是蛋白质分析的基础技术，通过对蛋白质样品进行电泳分离，可以获得蛋白质的表观分子质量、纯度和组成信息。
这对于研究蛋白质结构、功能以及与疾病的关系等具有重要意义。
2.2 分子生物学研究SDS-PAGE电泳在分子生物学研究中有多种应用。
例如，可以用于检测基因表达的变化，比较不同条件下的蛋白质组分等。
此外，SDS-PAGE也可以用于鉴定蛋白质的亚细胞定位、研究蛋白质与其他分子（如核酸、小分子化合物等）的相互作用等方面。
2.3 药物研发SDS-PAGE电泳在药物研发领域也有广泛应用。
例如，可以用于药物候选化合物与蛋白质之间的相互作用研究，评估药物的结合能力和亲合力。
sds-page蛋白凝胶电泳原理
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离
和分析技术。
其原理基于蛋白质的电荷密度和分子质量。
1. SDS（十二烷基硫酸钠）：在SDS-PAGE中，SDS被用作
溶胀剂。
SDS能够与蛋白质中的氢键和疏水作用相互作用，
使蛋白质的二级、三级结构被破坏并线性展开。
SDS与蛋白
质发生作用后，每个蛋白质分子上的SDS数量差不多是相同的，即每个氨基酸上有约2.7个SDS分子。
2. 聚丙烯酰胺凝胶：SDS处理后的蛋白质在凝胶中呈均匀线
性状。
聚丙烯酰胺是一种电泳凝胶，可形成细小的孔隙结构。
这些孔隙可以分离不同分子质量的蛋白质。
3. 电泳过程：在凝胶上形成一个电场，蛋白质带有负电荷，向阳极迁移。
溶胶中的离子也会随之迁移，以维持电中性。
由于SDS已经使蛋白质的结构线性化，其迁移速度主要取决于分
子质量。
较大分子所需的孔隙更大，迁移速度更慢，较小分子则迁移更快。
4. 可视化和测量：分离结束后，可以通过染色剂（如Coomassie Brilliant Blue）将蛋白质染色。
染色剂与蛋白质结合，形成蓝色或紫色的带状条纹，使蛋白质带的位置可见。
在染色后，可以使用图像分析软件测量带的强度和相对迁移距离，从而推断蛋白质的分子质量。
通过SDS-PAGE，可以将不同分子质量的蛋白质分离开来，
并进行定量分析。
它是一种常用的蛋白质研究技术，在生物化学、生命科学和临床诊断等领域得到广泛应用。
SDS—PAGE凝胶电泳（细致分析）SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤1.名称：SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）⼗⼆烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2.原理：此项技术的原理，是根据样品中蛋⽩质分⼦量⼤⼩的不同，使其在电泳胶中分离。
不同的蛋⽩质在不同的pH值下表现出不同的电荷，同时蛋⽩质具有不同的⼤⼩和形状。
为了使蛋⽩在电泳中的迁移率只与分⼦量有关，我们在上样前，通常会进⾏⼀些处理。
上样缓冲液由Tris-HCl（pH6.8）、⽢油，10％SDS、β-巯基⼄醇、0.1％溴酚蓝以及蒸馏⽔组成。
其各⾃的作⽤如下述：SDS 即⼗⼆烷基硫酸钠，是⼀种阴离⼦表⾯活性剂，它可以断开分⼦内和分⼦间的氢键，破坏蛋⽩质分⼦的⼆级和三级结构；β-巯基⼄醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的⼆硫键。
由于SDS和巯基⼄醇的作⽤，蛋⽩质完全变性和解聚，解离成亚基或者单个肽链，因此测定结果只是亚基或者单个肽链的分⼦量。
同时，SDS与蛋⽩质结合引起蛋⽩质的构象改变，形成长椭圆棒状，不同蛋⽩质短轴长度都⼀样，长轴随蛋⽩分⼦量不同⽽不同，这样就消除了性状的影响。
另外，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋⽩- SDS胶束，所带的负电荷⼤⼤超过了蛋⽩原有的电荷量，这样就消除了不同分⼦间的电荷差异和结构差异。
⽢油⽤以增⼤样品液密度，使加样时样品溶液可以快速沉⼊样品凹槽底部。
样品处理液中通常还加⼊溴酚蓝染料，⽤于监控整个电泳过程。
SDS-PAGE⼀般采⽤的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相⽐，能够有较⾼的分辨率。
浓缩胶的作⽤是有堆积作⽤，凝胶浓度较⼩，孔径较⼤，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过⼤孔径凝胶的迁移作⽤⽽被浓缩⾄⼀个狭窄的区带。
样品液和浓缩胶中Tris-HCl均为pH6.8,上下槽缓冲液含Tris-⽢氨酸（pH8.3）,分离胶含Tris-HCl(Ph8.8).电泳启动时，蛋⽩样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。
蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳一目的掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法二原理SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。
基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量三试剂和器材试剂：1低分子量标准蛋白质2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液）3 凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4°暗处贮存，一个月内使用4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至1000ml5 10%(w/v)SDS6 10%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配）7 四甲基乙二胺（TEMED）8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。
9 2×样品稀释液：SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。
以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。
10 固定液：500ml 乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml11 脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml12 染色液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽四操作步骤1分离胶制备：凝胶浓度5% 7.5% 10% 12.5% 15%凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 151mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2 11.2 11.2水ml 13.7 11.2 1.2 8.7 3.710% SDS ml 0.310% 过硫酸铵ml 0.1TEMED (μL) 20将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形成凹槽处处平齐，而后插入“加样梳”，在室温下放置1小时左右，分离胶即可完全凝集。
凝聚后，慢慢取出“加样梳”，取出时应防止把加样孔弄破，取出“加样梳”后，在形成的加样孔中加入蒸馏水，冲洗未凝集的丙烯酰胺，倒出加样孔中的蒸馏水后，在加入已稀释的电极缓冲液。
2, 样品制备：标准蛋白质制备待测蛋白样品制备：液体待测样品，可取500μL，加入等体积的“2×样品稀释液”，混匀，在沸水浴中加热5min,取出，冷却至室温备用。
若液体待测样品蛋白质浓度太稀可经浓缩后再制备。
3，点样用微量进样针吸取上述蛋白质样品20μL分别加入到各个加样孔中，为了获得准确的结果，每个样品应做两次重复。
4，电泳将电泳槽与电泳仪连结，在电泳槽中加入已经稀释的电极缓冲液，打开电源，选择合适电压，保持恒电压300V，进行电泳，直至样品中燃料迁移至离下端1cm处，停止。
5，固定，染色，脱色将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上（染色时间需根据凝胶厚度适当调整）。
取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。
凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。
凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。
淀粉酶活性电泳浓缩胶（单板）：水：1.8ml 凝胶贮液：0.5ml PH6.8缓冲液：0.78ml10%SDS :34μL TEMED:30μL10%AP:25μL上样要少，4μL即可；电泳完毕后，胶用清水冲洗两遍，再用2mol/l Tris溶液浸泡1h；蒸馏水洗干净，倒入1%淀粉溶液，震荡水浴锅中，37°反应10min；取出，加入碘-KI（0.2%：2%）溶液显色；灯箱观察拍照。
糖电泳电极缓冲液0.09 MTris0.08M硼酸2.6mMEDTA胶7.5ml凝胶贮液15ml贮液7.5ml水TEMED 60 微升10%AP 90微升贮液0.2 Mtris0.2m 硼酸2mmEDTA进样缓冲液4×2M蔗糖（10ml贮液)在实验中, 对电泳缓冲系统进行了改进, 即采用pH 9.4 硼砂- 氢氧化钠缓冲液; 同时对电泳条件进行了优化探讨, 重点对多糖PAS染色方法进行研究, 得到较佳的多糖和糖蛋白电泳后的PAS染色法:即先用10%TCA 处理5 min; 再用1% 高碘酸处理15 min; 蒸馏水洗涤3 次, 每次5 min; 倒入Schiff试剂避光染色30 min; 然后用0.5% 偏重亚硫酸钠洗3 次, 每次5 min。
以上各步均在室温下及转速为85 r·min-1 的脱色摇床中进行, 于7% 的醋酸溶液中保存。
此法操作更加简便, 染色处理过程更加快速, 所需时间为1.8 h。
（王玉琪,巫光宏, 林先丰, 贺丽平, 黄卓烈.多糖和糖蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进.植物生理学通讯, 2009,45(2):169-172）阿利辛蓝-硝酸银染色1. 1 mg/ml 阿利辛蓝水溶液30min，吸走染料2.除离子水洗涤数次，并可以在除离子水中过夜3.胶在3.4 mM重铬酸钾-3.2 mM 硝酸中处理7min，除离子水水洗数次4.凝胶浸泡在12 mM硝酸银(100w日光灯下30-40cm)处理25min5.吸走硝酸银,迅速倒入0.28M碳酸钠(含有6mM甲醛),然后迅速倒掉6.重新倒入该溶液,将胶浸没后再次倒掉7.再次倒入该溶液, 直到显色, 加入0.1M醋酸溶液冲洗，终止反应。
硝酸银染色PAGE+50%乙醇洗三次，15min/c i2%硫代硫酸钠稀释50倍染12min, 水洗3次，20s2%硝酸银稀释10倍，染20 min，水洗3次。
每次10s6%碳酸钠（50µ/100ml甲醛）显色，直到清晰，10%乙酸终止活性物质的SDS-PAGE电泳检测（夹层胶电泳）参照孙雪文等建立的Tricine-SDS-PAGE系统，对纯化的Fengycins进行电泳检测。
具体电泳体系见（表5-1，表5-2，表5-3）：表T ricin-SDS-PAGE电泳溶液T able Stock sollutions for T ricine-SDS-PAGE缓冲液Tris（mol/L）Triscine（mol/L）pH SDS（%）+极-极凝胶0.20.13.0/0.1/8.9a8.25b8.45a/0.10.3Notes：a means modified pH with HCl, b means no HCl added, natural pH is 8.25.表5-2 丙烯酰胺储存液T able 5-2 Acrylamide-bisacrylamide mixture丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺含量（w/v）丙烯酰胺含量（w/v）甲叉双丙烯酰胺含量（w/v）49.5%、3%（3C）49.5%、6%（6C）4846.51.53.0 表5-3 凝胶的组成T able 5-3 Composition of separating, spacer and stacking gels组成浓缩胶夹层胶致密胶3C凝胶储存液（mL）6C凝胶储存液（mL）凝胶缓冲液（mL）尿素（g）甘油（mL）加双蒸水定溶至（mL）0.3/0.93//2.231.22/2/0.265.22/222.160.36凝胶制作采用三层不连续胶的系统,先灌下边的致密胶和夹层胶,然后铺水层,待胶凝后,除去水层,灌上面的浓缩胶,小心插入梳子,静置30ml 加入150μl 10 %APS 和15μlTEMEDTricine–SDS-PAGE16 | VOL.1 NO.1 | 2006 | NATURE PROTOCOLSReducing sample buffers:•Buffer A: 12% SDS (wt/vol), 6% mercaptoethanol (vol/vol), 30% glycerol (wt/vol), 0.05% Coomassie blueG-250 (Serva), 150 mM Tris/HCl (pH 7.0)•Buffer A/4: buffer A diluted with 3 volumes of water•Buffer C: buffer A without glycerol•Nonreducing sample buffers:•Buffer B: 12% SDS (wt/vol), 30% glycerol (wt/vol), 0.05% Coomassie blue G-250 (Serva), 150 mM Tris/HCl (pH 7.0)•Buffer B/4: buffer B diluted with 3 volumes of water•Buffer D: buffer B without glycerol•Electrode buffer (semidry transfer only): 300 mM Tris, 100 mM acetic acid (pH 8.6)Electrode and gel buffers for Tricine–SDS-PAGE缓冲液Anode buffer（10×）Cathode buffer（10×）Gel buffer（3×）Tris（M） 1.0 1.0 3.0Triscine（M）- 1.0 -HCL（M）0.225 - 1.0SDS（%）- 1.0 0.3pH8.9 ~8.25 8.45Tricine obtained from Serva. Keep solutions at room temperature (20–25 °C). Do not correct the pH of the cathode buffer, which ideally should be closeto 8.25.AB-3 stock solution丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺含量（w/v）丙烯酰胺含量（w/v）甲叉双丙烯酰胺含量（w/v）49.5%、3%（3C）49.5%、6%（6C）4846.51.53.0For the acrylamide-bisacrylamide (AB)-3 stock solution(49.5% T, 3% C mixture), which is normally used, dissolve 48 g of acrylamideand 1.5 g of bisacrylamide (each twice-crystallized; Serva) in 100 ml of water. For the AB-6 stock solution (49.5% T, 6% C mixture), which is needed only foroptimal resolution of small proteins and peptides, dissolve 46.5 g of acrylamideand 3 g of bisacrylamide in 100 ml of water. ▲CRITICAL Keep thesolutionsat 7–10 °C, because crystallization occurs at 4 °C. ! CAUTION Acrylamide andbisacrylamide are highly neurotoxic. When handling these chemicals, weargloves and use a pipetting aid.Impact of fluroxypyr on riceFluroxypyr triggers oxidative damage by producing superoxide and hydrogen peroxide in rice (Oryza sativa) Ecotoxicology (2010) 19:124–132Guo Lin Wu，Jing Cui ，Ling Tao，Hong YangPolyacrylamide gel electrophoresisThree grams of tissues were homogenized with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM2-mercaptoethanl, 0.5 mM phenlmethyl and 1 mM EDTA. The homogenate was centrifuged at 15,000g at 4C for 20 min. The supernatant was used for the detection of isoenzymes. The isoenzymes of SOD, CA T and POD were separated on discontinuous polyacrylamide gels (PAGE) under the non-denaturing conditions. The stacking and separating gels contained 4.5 and 10% polyacrylamide, respectively. Proteins were electrophoretically separated at4C and 80 V in the stacking gel followed by 120 V in the separating gel (Zhou et al. 2007).Superoxide dismutase activity was determined on gels as described by Wang and Y ang (2005). The gels were rinsed in water and incubated in the dark for 30 min in theassay mixture containing 50 mM potassium phosphatebuffer (pH 7.8), 1 mM EDTA, 0.05 mM riboflavin,0.1 mM nitroblue tetrazolium and 0.3% N,N,N0,N0-tetramethylethylenediamine(TEMED). After that, the gels were rinsed with water and exposed on a light box for 10 min until the colorless bands of SOD activity in a purple background gel were visible. For peroxidase isoforms, the gels were stained for 20 min in 0.2 M acetate buffer（醋酸）(pH5.5) with 5 mM benzidine联苯胺and 5 mM H2O2 (Zhou et al.2007).For the detection of CA T isoenzyme activity, gels weresoaked in deionized water for 15 min. Subsequently, thegel was incubated in 0.03% H2O2 for 25 min and then carefully washed with deionized water to remove the residual H2O2. After that, the gel was stained in the solution of 1% (w/v) potassium ferricyanide铁氰化钾and 1% (w/v) ferric chloride氯化铁(Woodbury et al. 1971). This caused the gel to turn blue except at positions exhibiting CA T activity.When maximum contrast was achieved, the reaction wasstopped by rinsing the gel with deionized water. 铁氰化钾氯化铁组织研磨，50 mM pH 7.0 磷酸钾缓冲液，包含1 mM巯基乙醇，0.5 mM 苯甲基 1 mM EDTA 匀浆液15000g 4°离心20min, 上清用来酶测定。
