棉花细菌人工染色体文库构建方法探讨

棉花VIGS流程棉花VIGS（病毒诱导基因沉默）是一种利用RNA干扰技术抑制植物宿主的基因表达的方法。

该技术可用于研究棉花病毒感染机制、病原菌-植物相互作用以及棉花基因功能的研究等。

下面是棉花VIGS流程的详细说明。

1. 构建病毒载体：选择适合的病毒载体是进行VIGS实验的第一步。

常用的病毒载体有烟草花叶病毒（Tobacco rattle virus，TRV）和番茄花叶病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）等。

将所需的人工合成的DNA片段插入病毒载体的适当位点，构建具有目标基因片段的病毒载体。

2.复制病毒载体：将构建好的病毒载体DNA转化到感受性细菌中，经过培养和筛选，得到大量的病毒载体。

3.植株接种：选择棉花的适合发育阶段的幼苗，对其进行病毒接种。

通常是在两片真叶之间的叶片表面用注射器注入病毒载体溶液。

同时将一部分棉花叶片用水作为对照组。

4.观察和记录：在接种后的一段时间内，观察和记录棉花植株的表型变化，如叶片的颜色，形态，生长状态等。

通常观察时间为接种后的7-14天。

5.提取RNA：在观察期结束后，选择受病毒感染的病株和对照组的叶片，将其快速冻结并粉碎。

通过RNA提取试剂盒等方法，从样品中提取总RNA。

6.制备cDNA：将提取的总RNA进行逆转录反应，合成cDNA。

逆转录反应需使用逆转录酶和随机引物。

7. 多重PCR（Polymerase Chain Reaction）：设计特异性引物，使用cDNA作为模板进行PCR反应，以检测目标基因的表达水平。

PCR反应条件和循环数根据具体实验设计进行调整。

8.分析PCR产物：将PCR产物进行凝胶电泳，用琼脂糖凝胶作为分离介质，通过电场作用将PCR产物分离开。

将凝胶置于紫外线扫描仪下进行鉴定和定量分析。

9.数据分析：根据PCR产物的大小和强度，分析棉花基因表达水平的变化。

与对照组相比，表达量较低的PCR产物对应的基因受到了抑制。

作者： 程华
作者机构： 安阳工学院,河南,安阳,455000
出版物刊名： 安阳工学院学报
页码： 43-47页
主题词： 染色体;核型分析;遗传图谱;物理图谱
摘要：棉花是世界上最主要的纤维作物,关系着国民经济的命脉.棉花的研究与水稻、小麦等农作物比较相对落后.本文简述了染色体研究的发展史,从核型分析、遗传图谱和物理图谱三个方面介绍了染色体研究的方法,阐述了棉花染色体研究的现状.这对棉花的细胞遗传学和作物育种学的研究都具有一定的指导意义,并为棉花基因组测序工作贡献一份绵薄之力.。

可转化人工染色体(TAC)文库载体DNA的制备李晓玲;李克秀;赵洪锟;赵茂林;董英山【摘要】对可转化人工染色体(TAC)pYLTAC747NH/sacB文库载体DNA的制备条件进行了较系统的模索和研究.结果表明,该文库载体经碱裂解法提取、QIAGEN Plasmid Mini kit纯化后,可获得较纯净的载体DNA.对其闭环载体DNA分别用不同酶量的Hinid Ⅲ酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳检测得出其最佳Hind Ⅲ完全酶切条件为2 U Hind Ⅲ/μg闭环载体DNA、37℃酶切30 min;分别用0.5 MBU和1 MBU HK脱磷酶/μg对其线性载体DNA进行脱磷处理,经电泳和载体自连产物电转化检测表明其适宜的完全脱磷条件为1 MBU HK脱磷酶/μg线性载体DNA,30℃脱磷1 h；将所制备的线性载体DNA与λ DNA/Hind Ⅲ酶切片段进行连接,连接产物转化频率较高,其电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞频率可达到9.6×10s.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】6页(P199-204)【关键词】可转化人工染色体(TAC);文库载体;酶切;脱磷【作者】李晓玲;李克秀;赵洪锟;赵茂林;董英山【作者单位】吉林省农业科学院生物技术研究中心,长春130033;长春工业大学化学与生命科学学院,长春130012;长春工业大学化学与生命科学学院,长春130012;吉林省农业科学院生物技术研究中心,长春130033;中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京100101;吉林省农业科学院生物技术研究中心,长春130033【正文语种】中文随着分子生物学技术的普及和越来越多的植物基因序列的获得，基因功能分析变得日趋重要而紧迫。

据此 Liu等[1] 结合 PAC(P1-derived artificial chromosome)载体和BIBAC载体的特点，构建了多个植物可转化人工染色体(transformation-competent artificial chromosome，TAC)载体。

河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。

A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。

要求表达的重组蛋白C端带His标签。

答案：设计引物时应注意：（1）酶切位点前后应添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。

（2）His标签位于酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的片段插入时的顺序不倒转。

（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证引物可以顺利结合。

上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。

下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. cDNA文库是包含有细胞中所有mRNA，因此该文库能包含细胞所有的遗传信息。

（）答案：错误解析：cDNA文库不包含有细胞中所有mRNA，因此该文库也不能包含细胞神经细胞所有的遗传信息。

cDNA小说作品只是包含有特定细胞类型和发育中细胞时期的表达信息。

2. 蛋白质在小于等电点的pH溶液中，向阳极移动，而在大于等电点的pH溶液中，将向阴极移动。

（）答案：错误解析：蛋白质在小于等电点的pH溶液中带正电，电泳时向阴极移动；在大于等电点的pH溶液中带负电，色谱法时向阳极移动。

yac构建基因文库的原理基因文库是基因学研究中重要的工具，为科学家们提供了进行基因分析、克隆和研究特定基因功能的样本库。

而YAC (Yeast Artificial Chromosome)构建基因文库的原理是一种常用的方法。

本文将介绍YAC构建基因文库的原理及其应用。

一、YAC是一种由酵母人工染色体构建的载体。

它模拟了真实染色体的结构和功能，在文库构建中发挥了重要作用。

下面将详细介绍YAC构建基因文库的原理。

1.1 插入DNA的分离与纯化首先，需要从待构建文库的DNA样本中提取目标基因或DNA片段。

常用的方法是以高盐浓度裂解细胞并使用离心技术分离DNA。

接下来，通过利用酶的作用或聚合酶链反应(PCR)扩增目标基因或DNA片段。

1.2 YAC载体的制备接下来，需要制备YAC载体。

YAC是一种由酵母细胞中的元染色体、端点遗传元件和负载DNA序列构成的人工染色体。

首先，从酵母细胞中提取元染色体并进行线性化。

然后，将线性化的元染色体与负载DNA序列进行连接，通常使用酵母线性参加酶进行连接。

1.3 插入DNA与YAC载体的连接接下来，将经过分离纯化的DNA片段与制备好的YAC载体进行连连接。

主要通过使用DNA连接酶催化该反应。

连接完成后，获得了含有目标基因或DNA片段的YAC载体。

1.4 YAC构建基因文库的转化与筛选最后，将构建好的YAC载体转化至特定的酵母细胞中。

在转化过程中，通过液基策略或固体基策略将转化体放置于特定培养基中，酵母细胞可在其中生长。

根据目标基因的功能或特定实验需求，采用适当的筛选方法，如选择性培养基培养、PCR检测等，筛选出包含目标基因或DNA片段的YAC克隆。

二、YAC构建基因文库的应用YAC构建基因文库的原理为科学家们提供了重要的工具，具有广泛的应用。

下面介绍几个YAC构建基因文库的应用领域：2.1 基因克隆和表达YAC构建基因文库可以用于基因克隆和表达，帮助科学家们快速获得目标基因，并进一步了解其功能和调控机制。

yac构建基因文库的原理基因文库是DNA片段的集合，其中每个片段都包含来自基因组的某个部分。

这些片段可以来自不同的染色体区域，并且可能包含整个基因或其部分。

YAC（酵母人工染色体）是一种用于构建基因文库的载体，它允许研究人员在酵母细胞中克隆和表达大片段的基因组DNA。

下面将详细介绍YAC构建基因文库的原理，主要包含以下几个方面：1. 构建构建YAC载体的第一步是制备适合克隆大片段DNA的载体。

通常，YAC载体包含一个选择标记（如抗性基因），允许在含有特定抗生素的培养基上筛选和识别含有YAC的克隆。

此外，YAC载体还应包含一个多克隆位点，用于插入感兴趣的基因组DNA片段。

2. 转化一旦制备了YAC载体，就可以将其转化到酵母细胞中。

转化过程通常涉及将酵母细胞与YAC载体共孵育，以使载体与酵母细胞的DNA结合。

然后，通过加入选择标记来筛选和识别成功转化的细胞。

3. 克隆化在成功转化后，研究人员需要筛选和识别含有重组YAC载体的细胞克隆。

通常，这可以通过多轮筛选和鉴定来完成。

首先，研究人员可以使用特定抗生素来筛选含有选择标记的细胞。

然后，他们可以使用 Southern 印迹分析或 PCR 等技术来鉴定含有重组YAC载体的克隆。

4. 筛选筛选是YAC构建基因文库的关键步骤之一。

通过筛选，研究人员可以识别包含所需基因组区域的有效克隆。

这通常涉及对重组YAC进行分子遗传分析，以确定其包含的基因组区域。

通过比较筛选结果和基因组图谱，研究人员可以选择正确的克隆用于进一步研究。

5. 鉴定一旦筛选出正确的克隆，研究人员需要对其进行进一步鉴定。

这可以通过一系列技术来完成，包括 Southern 印迹分析、PCR、测序和功能分析等。

通过这些技术，研究人员可以确定重组YAC中的基因组区域是否包含所需的目标基因或DNA片段。

此外，他们还可以验证克隆的可靠性和稳定性，以确保其可以用于进一步实验和研究。

总之，YAC构建基因文库是一个复杂的过程，涉及多个步骤和关键环节。

细菌人工染色体文库基因组DNA制备技术陈献伟;王会;关伟军;高剑峰【摘要】试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial charomosome,BAc)文库的构建奠定基础.以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的Hind Ⅲ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切.结果表明,Hind Ⅲ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL).该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC 文库的构建.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)005【总页数】4页(P79-82)【关键词】细菌人工染色体;基因组DNA;限制性内切酶;酶切【作者】陈献伟;王会;关伟军;高剑峰【作者单位】石河子大学生命科学学院,石河子,832003;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;石河子大学生命科学学院,石河子,832003【正文语种】中文【中图分类】Q343.2基因组文库是利用DNA重组技术将某种生物细胞核DNA的大部分或全部片段随机连接到克隆载体上,再转移至适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段无性繁殖系的总集,是含有某种生物全部或大部分随机片段的重组DNA克隆群体,又称为人工构建的“基因银行”(gene bank)。

BAC文库的建立,为今后的基因组学的研究提供了一个强有力的技术平台(Zhang等,1996),也成为图位克隆基因(景润春等,2000)、基因组物理作图(Tao等,2001)、基因组测序(Cayanis等,1998)、基因组组织结构分析、一些特殊基因组序列(Alu,SSR)简单筛选及基因表达调控和基因转化等研究的重要资源。