棉花细菌人工染色体文库构建方法探讨

棉花VIGS流程棉花VIGS（病毒诱导基因沉默）是一种利用RNA干扰技术抑制植物宿主的基因表达的方法。

该技术可用于研究棉花病毒感染机制、病原菌-植物相互作用以及棉花基因功能的研究等。

下面是棉花VIGS流程的详细说明。

1. 构建病毒载体：选择适合的病毒载体是进行VIGS实验的第一步。

常用的病毒载体有烟草花叶病毒（Tobacco rattle virus，TRV）和番茄花叶病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）等。

将所需的人工合成的DNA片段插入病毒载体的适当位点，构建具有目标基因片段的病毒载体。

2.复制病毒载体：将构建好的病毒载体DNA转化到感受性细菌中，经过培养和筛选，得到大量的病毒载体。

3.植株接种：选择棉花的适合发育阶段的幼苗，对其进行病毒接种。

通常是在两片真叶之间的叶片表面用注射器注入病毒载体溶液。

同时将一部分棉花叶片用水作为对照组。

4.观察和记录：在接种后的一段时间内，观察和记录棉花植株的表型变化，如叶片的颜色，形态，生长状态等。

通常观察时间为接种后的7-14天。

5.提取RNA：在观察期结束后，选择受病毒感染的病株和对照组的叶片，将其快速冻结并粉碎。

通过RNA提取试剂盒等方法，从样品中提取总RNA。

6.制备cDNA：将提取的总RNA进行逆转录反应，合成cDNA。

逆转录反应需使用逆转录酶和随机引物。

7. 多重PCR（Polymerase Chain Reaction）：设计特异性引物，使用cDNA作为模板进行PCR反应，以检测目标基因的表达水平。

PCR反应条件和循环数根据具体实验设计进行调整。

8.分析PCR产物：将PCR产物进行凝胶电泳，用琼脂糖凝胶作为分离介质，通过电场作用将PCR产物分离开。

将凝胶置于紫外线扫描仪下进行鉴定和定量分析。

9.数据分析：根据PCR产物的大小和强度，分析棉花基因表达水平的变化。

与对照组相比，表达量较低的PCR产物对应的基因受到了抑制。

作者： 程华
作者机构： 安阳工学院,河南,安阳,455000
出版物刊名： 安阳工学院学报
页码： 43-47页
主题词： 染色体;核型分析;遗传图谱;物理图谱
摘要：棉花是世界上最主要的纤维作物,关系着国民经济的命脉.棉花的研究与水稻、小麦等农作物比较相对落后.本文简述了染色体研究的发展史,从核型分析、遗传图谱和物理图谱三个方面介绍了染色体研究的方法,阐述了棉花染色体研究的现状.这对棉花的细胞遗传学和作物育种学的研究都具有一定的指导意义,并为棉花基因组测序工作贡献一份绵薄之力.。

可转化人工染色体(TAC)文库载体DNA的制备李晓玲;李克秀;赵洪锟;赵茂林;董英山【摘要】对可转化人工染色体(TAC)pYLTAC747NH/sacB文库载体DNA的制备条件进行了较系统的模索和研究.结果表明,该文库载体经碱裂解法提取、QIAGEN Plasmid Mini kit纯化后,可获得较纯净的载体DNA.对其闭环载体DNA分别用不同酶量的Hinid Ⅲ酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳检测得出其最佳Hind Ⅲ完全酶切条件为2 U Hind Ⅲ/μg闭环载体DNA、37℃酶切30 min;分别用0.5 MBU和1 MBU HK脱磷酶/μg对其线性载体DNA进行脱磷处理,经电泳和载体自连产物电转化检测表明其适宜的完全脱磷条件为1 MBU HK脱磷酶/μg线性载体DNA,30℃脱磷1 h；将所制备的线性载体DNA与λ DNA/Hind Ⅲ酶切片段进行连接,连接产物转化频率较高,其电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞频率可达到9.6×10s.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】6页(P199-204)【关键词】可转化人工染色体(TAC);文库载体;酶切;脱磷【作者】李晓玲;李克秀;赵洪锟;赵茂林;董英山【作者单位】吉林省农业科学院生物技术研究中心,长春130033;长春工业大学化学与生命科学学院,长春130012;长春工业大学化学与生命科学学院,长春130012;吉林省农业科学院生物技术研究中心,长春130033;中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京100101;吉林省农业科学院生物技术研究中心,长春130033【正文语种】中文随着分子生物学技术的普及和越来越多的植物基因序列的获得，基因功能分析变得日趋重要而紧迫。

据此 Liu等[1] 结合 PAC(P1-derived artificial chromosome)载体和BIBAC载体的特点，构建了多个植物可转化人工染色体(transformation-competent artificial chromosome，TAC)载体。

河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。

A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。

要求表达的重组蛋白C端带His标签。

答案：设计引物时应注意：（1）酶切位点前后应添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。

（2）His标签位于酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的片段插入时的顺序不倒转。

（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证引物可以顺利结合。

上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。

下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. cDNA文库是包含有细胞中所有mRNA，因此该文库能包含细胞所有的遗传信息。

（）答案：错误解析：cDNA文库不包含有细胞中所有mRNA，因此该文库也不能包含细胞神经细胞所有的遗传信息。

cDNA小说作品只是包含有特定细胞类型和发育中细胞时期的表达信息。

2. 蛋白质在小于等电点的pH溶液中，向阳极移动，而在大于等电点的pH溶液中，将向阴极移动。

（）答案：错误解析：蛋白质在小于等电点的pH溶液中带正电，电泳时向阴极移动；在大于等电点的pH溶液中带负电，色谱法时向阳极移动。

yac构建基因文库的原理基因文库是基因学研究中重要的工具，为科学家们提供了进行基因分析、克隆和研究特定基因功能的样本库。

而YAC (Yeast Artificial Chromosome)构建基因文库的原理是一种常用的方法。

本文将介绍YAC构建基因文库的原理及其应用。

一、YAC是一种由酵母人工染色体构建的载体。

它模拟了真实染色体的结构和功能，在文库构建中发挥了重要作用。

下面将详细介绍YAC构建基因文库的原理。

1.1 插入DNA的分离与纯化首先，需要从待构建文库的DNA样本中提取目标基因或DNA片段。

常用的方法是以高盐浓度裂解细胞并使用离心技术分离DNA。

接下来，通过利用酶的作用或聚合酶链反应(PCR)扩增目标基因或DNA片段。

1.2 YAC载体的制备接下来，需要制备YAC载体。

YAC是一种由酵母细胞中的元染色体、端点遗传元件和负载DNA序列构成的人工染色体。

首先，从酵母细胞中提取元染色体并进行线性化。

然后，将线性化的元染色体与负载DNA序列进行连接，通常使用酵母线性参加酶进行连接。

1.3 插入DNA与YAC载体的连接接下来，将经过分离纯化的DNA片段与制备好的YAC载体进行连连接。

主要通过使用DNA连接酶催化该反应。

连接完成后，获得了含有目标基因或DNA片段的YAC载体。

1.4 YAC构建基因文库的转化与筛选最后，将构建好的YAC载体转化至特定的酵母细胞中。

在转化过程中，通过液基策略或固体基策略将转化体放置于特定培养基中，酵母细胞可在其中生长。

根据目标基因的功能或特定实验需求，采用适当的筛选方法，如选择性培养基培养、PCR检测等，筛选出包含目标基因或DNA片段的YAC克隆。

二、YAC构建基因文库的应用YAC构建基因文库的原理为科学家们提供了重要的工具，具有广泛的应用。

下面介绍几个YAC构建基因文库的应用领域：2.1 基因克隆和表达YAC构建基因文库可以用于基因克隆和表达，帮助科学家们快速获得目标基因，并进一步了解其功能和调控机制。

yac构建基因文库的原理基因文库是DNA片段的集合，其中每个片段都包含来自基因组的某个部分。

这些片段可以来自不同的染色体区域，并且可能包含整个基因或其部分。

YAC（酵母人工染色体）是一种用于构建基因文库的载体，它允许研究人员在酵母细胞中克隆和表达大片段的基因组DNA。

下面将详细介绍YAC构建基因文库的原理，主要包含以下几个方面：1. 构建构建YAC载体的第一步是制备适合克隆大片段DNA的载体。

通常，YAC载体包含一个选择标记（如抗性基因），允许在含有特定抗生素的培养基上筛选和识别含有YAC的克隆。

此外，YAC载体还应包含一个多克隆位点，用于插入感兴趣的基因组DNA片段。

2. 转化一旦制备了YAC载体，就可以将其转化到酵母细胞中。

转化过程通常涉及将酵母细胞与YAC载体共孵育，以使载体与酵母细胞的DNA结合。

然后，通过加入选择标记来筛选和识别成功转化的细胞。

3. 克隆化在成功转化后，研究人员需要筛选和识别含有重组YAC载体的细胞克隆。

通常，这可以通过多轮筛选和鉴定来完成。

首先，研究人员可以使用特定抗生素来筛选含有选择标记的细胞。

然后，他们可以使用 Southern 印迹分析或 PCR 等技术来鉴定含有重组YAC载体的克隆。

4. 筛选筛选是YAC构建基因文库的关键步骤之一。

通过筛选，研究人员可以识别包含所需基因组区域的有效克隆。

这通常涉及对重组YAC进行分子遗传分析，以确定其包含的基因组区域。

通过比较筛选结果和基因组图谱，研究人员可以选择正确的克隆用于进一步研究。

5. 鉴定一旦筛选出正确的克隆，研究人员需要对其进行进一步鉴定。

这可以通过一系列技术来完成，包括 Southern 印迹分析、PCR、测序和功能分析等。

通过这些技术，研究人员可以确定重组YAC中的基因组区域是否包含所需的目标基因或DNA片段。

此外，他们还可以验证克隆的可靠性和稳定性，以确保其可以用于进一步实验和研究。

总之，YAC构建基因文库是一个复杂的过程，涉及多个步骤和关键环节。

细菌人工染色体文库基因组DNA制备技术陈献伟;王会;关伟军;高剑峰【摘要】试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial charomosome,BAc)文库的构建奠定基础.以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的Hind Ⅲ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切.结果表明,Hind Ⅲ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL).该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC 文库的构建.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)005【总页数】4页(P79-82)【关键词】细菌人工染色体;基因组DNA;限制性内切酶;酶切【作者】陈献伟;王会;关伟军;高剑峰【作者单位】石河子大学生命科学学院,石河子,832003;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;石河子大学生命科学学院,石河子,832003【正文语种】中文【中图分类】Q343.2基因组文库是利用DNA重组技术将某种生物细胞核DNA的大部分或全部片段随机连接到克隆载体上,再转移至适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段无性繁殖系的总集,是含有某种生物全部或大部分随机片段的重组DNA克隆群体,又称为人工构建的“基因银行”(gene bank)。

BAC文库的建立,为今后的基因组学的研究提供了一个强有力的技术平台(Zhang等,1996),也成为图位克隆基因(景润春等,2000)、基因组物理作图(Tao等,2001)、基因组测序(Cayanis等,1998)、基因组组织结构分析、一些特殊基因组序列(Alu,SSR)简单筛选及基因表达调控和基因转化等研究的重要资源。

核农学报2023，37（11）：2158~2165Journal of Nuclear Agricultural Sciences非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选蔡肖李兴河王海涛刘存敬唐丽媛张素君张建宏*（河北省农林科学院棉花研究所/农业农村部黄淮海半干旱区生物学与遗传育种重点实验室/国家棉花改良中心河北分中心，河北石家庄050051）摘要：非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制，严重影响棉花的产量和品质。

为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白，本研究以陆地棉标准系TM-1为材料，采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库，获得的初级文库总克隆数为1.2×107 CFU，次级文库总克隆数为1.6×107 CFU，重组阳性率100%，酵母文库滴度为5.0×107 cells·mL-1，酵母克隆平均插入片段>1 000 bp，符合建库标准，可用于后续酵母双杂交筛选。

以GhJAZ1为诱饵，构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体，经毒性检测及自激活活性检测，明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性，可直接用于酵母文库筛选。

利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库，得到72个初筛阳性克隆，经测序、序列比对和酵母回转验证，获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。

选取其中4个候选蛋白，利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。

本研究结果为深入分析棉花非生物胁迫响应的调控网络奠定了良好的基础，为解析GhJAZ1低温应答分子机理提供了重要参考。

关键词：棉花；互作蛋白；酵母双杂交；非生物胁迫；GhJAZ1DOI：10.11869/j.issn.1000‑8551.2023.11.2158JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白作为E3泛素连接蛋白降解复合体SCF COI1的靶蛋白，是茉莉素（jasmonic acid，JA）信号转导途径中重要的转录抑制因子之一［1-2］。

河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出从组织中抽取RNA的关键步骤，并解释如何判断RNA质量。

答案：（1）从组织中提取RNA的步骤如下：①将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol 裂解液溶解样品，充分吹打混匀。

②每1ml TRIzol加入2.0ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min。

③4℃，10000g离心15min，此时RNA主要集中在水相中。

④将中多水相转移至新的离心管当中，加入等体积异丙醇，室温放置10min。

⑤4℃，10000g离心10min，此时可在离心管底部这时观察到深蓝色沉淀，即为RNA。

⑥用75冷的氯化氢洗涤沉淀，4℃，7500g以下，离心5min，弃上清。

⑦超净台中吹干，加入无RNase的水溶解。

（2）检测RNA质量的方法如下：①凝胶成像：取适量RNA溶液加入电泳缓冲液后，飞奔琼脂糖凝胶电泳，如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则认为RNA的质量是好的。

②吸光度检测：换用紫外分光光度计检测RNA样品在260nm、280nm处的吸光度，若两者的比值在1.8～2.0时，可认为RNA纯度良好，蛋白质等其他物质酵素的污染可以接受。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 真核生物利用polyA聚合酶在新转录出的mRNA3′端加上polyA尾巴形成polyA＋的mRNA。

（）答案：正确解析：DNA序列中没有多聚T的序列，说明细胞分裂后加上了3′尾巴。

加工过程首先是3′末端一些过剩的核苷酸被核酸外切酶切去，然后由多聚腺苷酸聚合酶催化，以ATP为底物，在mRNA3′末端逐个加上腺苷酸，形成polyA尾巴。

BAC文库构建技巧基因组DNA文库构建实验技巧基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。

通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。

一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。

研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。

二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。

不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。

比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre 的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。

构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。

构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。

需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。

用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。