病毒保存液方法

病毒保存液在核酸标本保存过程中起到了什么作用？核酸检测假阳性、假阴性的问题一直是专家们的心头病，而核酸标本的采集和保存成为影响检测结果的重中之重，很多专家从实践工作中总结出的经验认为，鼻咽拭子标本2019-nCoV核酸检测阳性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本，为了提高检测阳性率，建议采集同一病人多部位标本，合并进行检测，下面我们来看看标本在采集、运输、保存过程中应该注意哪些问题。

口、咽拭子采集注意事项1.不要从鼻孔或扁桃体上采样2.不建议雾化导痰3. 下呼吸道标本（相对于上呼吸道标本）更可能呈阳性4.对于怀疑患感染新型冠状病毒的患者，特别是肺炎或严重疾病的患者，单个上呼吸道标本不能排除诊断，建议增加上呼吸道和下呼吸道标本。

病毒保存液标本采集方法：用于2019-nCoV核酸检测标本主要是口咽拭子，采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本。

如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后导致检测结果阴性。

标本运输及保存条件:2019-nCoV为RNA病毒，很容易被外源性或细胞破坏后所释放的RNA酶降解，而影响最后的检测效率。

严格来讲标本采集后应及时送到实验室（疾控中心、医院检验科、第三方实验室），尽快完成检测。

标本在常温条件下放置时间过长，也可能是造成最后检测结果假阴性的原因，如果因为特殊需要需要长时间保存的话，可以用病毒保存液来保存RNA病毒样本，此外还可以使用防止病毒核酸降解的标本采集管，但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果也需要进一步评价。

总的来说，标本采集后应及时送检，及时检测，如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测，应将采样后的拭子放入病毒保存液中,病毒保存液是病毒采样管内添加的用于保护病毒样本的保护性液体！。

流感病毒的保存及管理技术操作规范
（一）流感病毒的保存要求
1. 各个流感监测网络实验室寄送国家流感中心的毒株，均应备份保存，以备复核用。

2. 对分离阳性的临床采集的标本，于-70℃冰箱保存6个月，以备复核用，收到流感中心的鉴定报告后，可以按照有关规定处理。

3. 有条件的实验室对HA滴度大于1:32，并且无细菌污染的毒株，应保存2支干燥管毒种。

4. 所有阳性的流感病毒株均保存2管液体毒种，每管1mL。

存放于-70℃冰箱。

5. 保存管上应注明病毒名称、代数、保存日期。

并填写“流感毒株保存记录表”做详细记录。

6. 干燥毒株应注明病毒名称、代数、保存日期，并填写“流感毒株保存记录表”做详细记录。

7. 毒株的保存专人负责。

（二）毒株的管理
1. 液体毒株于-70℃或以下温度可保存3年甚至更长时间。

2. 干燥毒株可以长期保存，具体方法：等体积的病毒液与无菌脱脂奶混匀，冷冻干燥，置4℃或以下温度长期保存。

3. 任何人未经允许不得私自将毒株带出实验室。

4. 未经卫生部允许任何个人和单位不得向其他国家的实验室提供流感毒株。

5. 有明确的保存记录，包括毒株保存记录、毒株使用记录、毒株销毁记录等。

6. 用于科研目的的流感毒株，需经有关人员书面签字同意后方可提供。

7. 未经允许任何人不得私自向其他单位提供流感毒株。

8. 对于保存毒种的冰箱每日观察工作状况并记录。

病毒的超低温保存法大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。

需要简单养分的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。

此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至150℃，再将这些小管贮存在150～－196℃的液氮中。

超低温的冷冻爱护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。

ATCC 常用一种由甘油（10％）、二甲亚砜（5％）和培育液制成的混合剂保存多数的细胞株。

这些化学试剂进入细胞内可避开内膜的冷冻损伤。

贮存在低温容器内的细胞复苏时必需当心操作。

当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避开这种事故。

只要快速将样品解冻就能削减活力的丢失，做法是：将封口的小管快速放入37℃的水中，直至全部的冰溶化，然后打开管口，将内容物移入培育基。

超低温保藏的微生物必需始终贮存在温度特别低的环境中，因此需要液氮罐。

在长期贮存的过程中必需常常留意补充液氮。

这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。

2.2 材料病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。

2.3 方法（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。

（2）将含有澄清病毒悬液（组织培育的上清培育基，或组织培育基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。

（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。

（4）用喷灯当心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。

留意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。

（5）再当心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。

（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。

病毒保存液和细胞保存液的区别一、病毒保存液病毒保存液适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作，是采样管内浸末采样拭子病毒样本一种保护病毒的被检测物质的液体，可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。

通常分为两种，一种是非灭活型，能够保护病毒的蛋白和核酸，另一种是灭活型，通常含有灭活病毒的裂解盐，裂解蛋白而保护核酸。

1、灭活型：添加有裂解盐的病毒保存液就是灭活型的病毒保存液，里面含有的Tris、裂解盐、EDTA等主要目的是裂解核酸而释放出核酸，从而通过后续的实时荧光RT-PCR进行核酸检测，以此判断样本是否含有病毒特征核酸，即是否感染病毒。

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是生命的最基本物质之一。

病毒结构单一，就只含有一种核酸和蛋白质，因此检测出特征核酸就检测除了病毒。

病毒属于寄生生物，采样后体外无法存活，如果不能及时检测，就需要放入病毒保存液中。

为了保护病毒检测环境的安全性，就需要加入裂解盐来灭活病毒，释放出可以被检测的核酸即可。

2、非灭活型：除了灭活型的病毒保存液，此外还有非灭活型病毒保存液，不含裂解盐，但是保存的病毒完整性更好，检出率更高，除了核酸检测外还可以用于其他研究。

灭活型病毒保存液则使用上更安全，操作环境要求也不用那么严格，各有各的优势，目前研究的非灭活病毒保存液的成分主要为Hank's液基础，在Hank's液基础之上，还添加了诸如庆大霉素、真菌抗生素、BSA（牛血清白蛋白第五组分）、生物缓冲剂HEPES、氨基酸、冷冻保护剂、甘油等多种组分：3、病毒样本采集方法：a .鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。

取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。

上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010773758.4(22)申请日 2020.08.04(71)申请人 中牧实业股份有限公司地址 100070 北京市丰台区南四环西路188号总部基地八区16-19号楼(72)发明人 李双男　张贺楠　何至远　于雷　(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人 商秀玲(51)Int.Cl.C12N 1/04(2006.01)C12R 1/93(2006.01)(54)发明名称一种RNA病毒保存液及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及一种RNA病毒保存液及其制备方法和应用。

本发明通过复配二糖、原位凝胶剂和碳链长度为3‑22的直链或有支链的脂肪醇来制备冻存液，用于在对RNA病毒进行冻干保存之前或投入使用之前的非超低温保存，可以在较长时间内保持RNA病毒的滴度。

本发明通过实验验证，以本发明的RNA病毒保存液保存的犬瘟抗原在4℃条件下保存28天滴度下降不超过1log，显著提升了RNA病毒在‑40℃～4℃液体的条件下的保存状态，可大幅度提高多联多价疫苗生产方面的灵活性。

权利要求书1页 说明书7页CN 111961592 A 2020.11.20C N 111961592A1.一种用于RNA病毒保存的组合物，其特征在于，以质量体积百分含量计，包括如下组分：二糖20％～70％、原位凝胶剂0.5％～3％和碳链长度为3-22的直链或有支链的脂肪醇0.2％～2％。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以质量体积百分含量计，包括如下组分：二糖30％～50％、原位凝胶剂1％～2％和碳链长度为3-22的直链或有支链的脂肪醇0.5％～1.5％。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述二糖为蔗糖、乳糖或海藻糖的一种或多种；和/或，所述碳链长度为3-22的直链或有支链的脂肪醇为丙二醇、丙三醇、十四烷醇或十八烷醇中的一种或多种；和/或，所述原位凝胶剂为卡波姆、泊洛沙姆和壳聚糖中的一种或多种。

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1. 准备工作。

穿戴个人防护装备（PPE），口罩、护目镜、手套、防护服。

病毒保存液标本采集方法
一、预期用途：
本产品适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作。

可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。

二、采集方法：
1 .咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

2. 鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。

取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。

上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

3. 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。

将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。

图示试子保存及试子种类
一次性使用病毒采样管用途：
1、用于疾控部门、临床部门对传染病原微生物监测采样使用。

适用于流感病毒（普通流感、高致病性禽流感、甲型H1N1流感病毒等）、手足口病毒及其他类型的病毒采样。

同时也用于支原体、衣原体、脲原体等的采样。

2、用于从采样现场到检测实验室运送鼻咽拭子标本或特定部位的组织标本，以待进行PCR提取与检测。

3、用于保存鼻咽拭子样本或特定部位的组织标本，以待进行必要的细胞培养。

非灭活型病毒保存液介绍520非灭活型病毒保存液介绍一、病毒的特征：病毒是一类个体微小，无完整细胞结构，含单一核酸（DNA或RNA）型来，必须在活细胞内寄生并复制的非细胞型微生物。

1. 含有单一知种核酸（DNA或RNA）的基因组和蛋白质外壳，没有细胞道结构，个体微小、结构简单。

2. 在感染细胞的同时或稍后释放其核酸，然后以核酸复制的方式增殖，而不是以二分裂方式增殖；3. 严格的细胞内寄生性。

病毒自身不能复制，而是将基因侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统复制新的病毒。

二、非灭活型病毒保存液特点：1. 低温非冻型保存，不破坏病毒的外壳，方便长途运输。

2. 适用于各种拭子样品，包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子、等3. 可以用于 H1N1 流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。

4. 可以用柱式病毒 DNAout 或柱式病毒 RNAout 提取病毒核酸。

5. 采样液中的抗生素能有效防止细菌和真菌污染。

6. 采样液添加了牛血清白蛋白，能保护病毒样本，提高分离率三、德晟非灭活型病毒保存液成分：1. 保存液成分为：Hanks液基础,庆大霉素,真菌抗生素,BSA (V) ,冷冻保护剂、生物缓冲剂及氨基酸等。

2. 多种抗生素联合，具有抗细菌和抗真菌的作用。

3. 牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质稳定剂，可在病毒的蛋白质外壳形成一种保护膜，使其不易分解，保证病毒的完整性。

4. Hanks缓冲液构建的中性环境，有助于增加病毒的生存时间和感染稳定性。

5. 用于临床流感、禽流感(如H7N9) 、手足口病、麻疹等病毒标本及支原体、脲原体、衣原体等标本的采集及运送四、使用方法：注意：标本采集人员需按有关规定做好个人防护。

咽、鼻拭子最好在发病的头3 天采集。

1. 在安全柜内本产品分装到自备的、螺旋盖内有橡胶圈的5 mL 旋盖塑料管里（一级容器）。

B 型产品已经在旋盖离心管中，可以跳过此步。

2. 鼻拭子的采集：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010800497.0(22)申请日 2020.08.11(71)申请人 杭州博日科技有限公司地址 310000 浙江省杭州市滨江区滨安路1192号(72)发明人 王虹军　金茂峰　陈芝娟　贺贤汉　(74)专利代理机构 北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙) 11463代理人 严诚(51)Int.Cl.C12N 7/00(2006.01)C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6806(2018.01)C12R 1/93(2006.01)(54)发明名称病毒样本保存液及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种病毒样本保存液及其制备方法和应用，涉及生物技术领域，本发明提供的病毒样本保存液，包括特定浓度的缓冲化合物、离液剂、去污剂和螯合剂，通过上述特定浓度的特定组分相互配合，使得本发明提供的病毒样本保存液具有安全、稳定、高效的优点，可以在10分钟内将病毒灭活，并可稳定保存病毒样本核酸。

并且，无需超低温环境即可实现对病毒样本的保存，可适用于临床及野外环境采集及运输病毒样本。

权利要求书1页 说明书10页 附图4页CN 111718908 A 2020.09.29C N 111718908A1.一种病毒样本保存液，其特征在于，所述病毒样本保存液包括：终浓度为10-50mmol/L的缓冲化合物、质量体积百分比为5％-15％的离液剂、体积百分比为0.1％-20％的去污剂和终浓度为0.1-1mmol/L的螯合剂。

2.根据权利要求1所述的病毒样本保存液，其特征在于，所述病毒样本保存液包括：终浓度为20-50mmol/L的缓冲化合物、质量体积百分比为5％-10％的离液剂、体积百分比为1％-10％的去污剂和终浓度为0.1-0.5mmol/L的螯合剂；优选地，所述病毒样本保存液包括：终浓度为50mmol/L的缓冲化合物、质量体积百分比为5％的离液剂、体积百分比为10％的去污剂和终浓度为0.1mmol/L的螯合剂。