病毒保存液方法

病毒保存液在核酸标本保存过程中起到了什么作用？核酸检测假阳性、假阴性的问题一直是专家们的心头病，而核酸标本的采集和保存成为影响检测结果的重中之重，很多专家从实践工作中总结出的经验认为，鼻咽拭子标本2019-nCoV核酸检测阳性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本，为了提高检测阳性率，建议采集同一病人多部位标本，合并进行检测，下面我们来看看标本在采集、运输、保存过程中应该注意哪些问题。

口、咽拭子采集注意事项1.不要从鼻孔或扁桃体上采样2.不建议雾化导痰3. 下呼吸道标本（相对于上呼吸道标本）更可能呈阳性4.对于怀疑患感染新型冠状病毒的患者，特别是肺炎或严重疾病的患者，单个上呼吸道标本不能排除诊断，建议增加上呼吸道和下呼吸道标本。

病毒保存液标本采集方法：用于2019-nCoV核酸检测标本主要是口咽拭子，采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本。

如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后导致检测结果阴性。

标本运输及保存条件:2019-nCoV为RNA病毒，很容易被外源性或细胞破坏后所释放的RNA酶降解，而影响最后的检测效率。

严格来讲标本采集后应及时送到实验室（疾控中心、医院检验科、第三方实验室），尽快完成检测。

标本在常温条件下放置时间过长，也可能是造成最后检测结果假阴性的原因，如果因为特殊需要需要长时间保存的话，可以用病毒保存液来保存RNA病毒样本，此外还可以使用防止病毒核酸降解的标本采集管，但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果也需要进一步评价。

总的来说，标本采集后应及时送检，及时检测，如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测，应将采样后的拭子放入病毒保存液中,病毒保存液是病毒采样管内添加的用于保护病毒样本的保护性液体！。

流感病毒的保存及管理技术操作规范
（一）流感病毒的保存要求
1. 各个流感监测网络实验室寄送国家流感中心的毒株，均应备份保存，以备复核用。

2. 对分离阳性的临床采集的标本，于-70℃冰箱保存6个月，以备复核用，收到流感中心的鉴定报告后，可以按照有关规定处理。

3. 有条件的实验室对HA滴度大于1:32，并且无细菌污染的毒株，应保存2支干燥管毒种。

4. 所有阳性的流感病毒株均保存2管液体毒种，每管1mL。

存放于-70℃冰箱。

5. 保存管上应注明病毒名称、代数、保存日期。

并填写“流感毒株保存记录表”做详细记录。

6. 干燥毒株应注明病毒名称、代数、保存日期，并填写“流感毒株保存记录表”做详细记录。

7. 毒株的保存专人负责。

（二）毒株的管理
1. 液体毒株于-70℃或以下温度可保存3年甚至更长时间。

2. 干燥毒株可以长期保存，具体方法：等体积的病毒液与无菌脱脂奶混匀，冷冻干燥，置4℃或以下温度长期保存。

3. 任何人未经允许不得私自将毒株带出实验室。

4. 未经卫生部允许任何个人和单位不得向其他国家的实验室提供流感毒株。

5. 有明确的保存记录，包括毒株保存记录、毒株使用记录、毒株销毁记录等。

6. 用于科研目的的流感毒株，需经有关人员书面签字同意后方可提供。

7. 未经允许任何人不得私自向其他单位提供流感毒株。

8. 对于保存毒种的冰箱每日观察工作状况并记录。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011391579.0(22)申请日 2020.12.02(71)申请人 苏州海狸生物医学工程有限公司地址 215123 江苏省苏州市工业园区华云路1号东坊产业园B区4号楼(72)发明人 任辉　付监贵　(74)专利代理机构 苏州华博知识产权代理有限公司 32232代理人 何蔚(51)Int.Cl.C12Q 1/24(2006.01)(54)发明名称一种病毒样本RNA保存液及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种病毒样本RNA保存液及其制备方法，其中保存液包括以下组分：Tris ‑HCl、乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X ‑100、柠檬酸钠；其中主要成分乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸的浓度为1mM～10mM，硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠的浓度为0.1M～2M/(m/v)，曲拉通X ‑100的浓度为0.1％～2％(v/v)。

采用本发明制备的病毒样本RNA保存液成本低廉的同时，能够有效避免室温下病毒样本RNA降解，保护病毒RNA长达一周。

本发明保存液可应用于拭子、唾液样本中新型冠状病毒和其他病毒RNA的保存；采用本发明保存液的样本可适用于磁珠法提取实现RNA自动化提取，亦可适用于一步法专用PCR试剂盒直接进行病毒RNA扩增。

权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 112626166 A 2021.04.09C N 112626166A1.一种病毒样本RNA保存液，其特征在于包括以下组分Tris ‑HCl、乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X ‑100、柠檬酸钠。

2.根据权利要求1所述的病毒样本RNA保存液，其特征在于，主要成分包括乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X ‑100。

病毒保存液和细胞保存液的区别一、病毒保存液病毒保存液适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作，是采样管内浸末采样拭子病毒样本一种保护病毒的被检测物质的液体，可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。

通常分为两种，一种是非灭活型，能够保护病毒的蛋白和核酸，另一种是灭活型，通常含有灭活病毒的裂解盐，裂解蛋白而保护核酸。

1、灭活型：添加有裂解盐的病毒保存液就是灭活型的病毒保存液，里面含有的Tris、裂解盐、EDTA等主要目的是裂解核酸而释放出核酸，从而通过后续的实时荧光RT-PCR进行核酸检测，以此判断样本是否含有病毒特征核酸，即是否感染病毒。

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是生命的最基本物质之一。

病毒结构单一，就只含有一种核酸和蛋白质，因此检测出特征核酸就检测除了病毒。

病毒属于寄生生物，采样后体外无法存活，如果不能及时检测，就需要放入病毒保存液中。

为了保护病毒检测环境的安全性，就需要加入裂解盐来灭活病毒，释放出可以被检测的核酸即可。

2、非灭活型：除了灭活型的病毒保存液，此外还有非灭活型病毒保存液，不含裂解盐，但是保存的病毒完整性更好，检出率更高，除了核酸检测外还可以用于其他研究。

灭活型病毒保存液则使用上更安全，操作环境要求也不用那么严格，各有各的优势，目前研究的非灭活病毒保存液的成分主要为Hank's液基础，在Hank's液基础之上，还添加了诸如庆大霉素、真菌抗生素、BSA（牛血清白蛋白第五组分）、生物缓冲剂HEPES、氨基酸、冷冻保护剂、甘油等多种组分：3、病毒样本采集方法：a .鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。

取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。

上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

病毒保存液标本采集方法
一、预期用途：
本产品适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作。

可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。

二、采集方法：
1 .咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

2. 鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。

取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。

上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

3. 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。

将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。

图示试子保存及试子种类
一次性使用病毒采样管用途：
1、用于疾控部门、临床部门对传染病原微生物监测采样使用。

适用于流感病毒（普通流感、高致病性禽流感、甲型H1N1流感病毒等）、手足口病毒及其他类型的病毒采样。

同时也用于支原体、衣原体、脲原体等的采样。

2、用于从采样现场到检测实验室运送鼻咽拭子标本或特定部位的组织标本，以待进行PCR提取与检测。

3、用于保存鼻咽拭子样本或特定部位的组织标本，以待进行必要的细胞培养。

非灭活型病毒保存液介绍520非灭活型病毒保存液介绍一、病毒的特征：病毒是一类个体微小，无完整细胞结构，含单一核酸（DNA或RNA）型来，必须在活细胞内寄生并复制的非细胞型微生物。

1. 含有单一知种核酸（DNA或RNA）的基因组和蛋白质外壳，没有细胞道结构，个体微小、结构简单。

2. 在感染细胞的同时或稍后释放其核酸，然后以核酸复制的方式增殖，而不是以二分裂方式增殖；3. 严格的细胞内寄生性。

病毒自身不能复制，而是将基因侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统复制新的病毒。

二、非灭活型病毒保存液特点：1. 低温非冻型保存，不破坏病毒的外壳，方便长途运输。

2. 适用于各种拭子样品，包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子、等3. 可以用于 H1N1 流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。

4. 可以用柱式病毒 DNAout 或柱式病毒 RNAout 提取病毒核酸。

5. 采样液中的抗生素能有效防止细菌和真菌污染。

6. 采样液添加了牛血清白蛋白，能保护病毒样本，提高分离率三、德晟非灭活型病毒保存液成分：1. 保存液成分为：Hanks液基础,庆大霉素,真菌抗生素,BSA (V) ,冷冻保护剂、生物缓冲剂及氨基酸等。

2. 多种抗生素联合，具有抗细菌和抗真菌的作用。

3. 牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质稳定剂，可在病毒的蛋白质外壳形成一种保护膜，使其不易分解，保证病毒的完整性。

4. Hanks缓冲液构建的中性环境，有助于增加病毒的生存时间和感染稳定性。

5. 用于临床流感、禽流感(如H7N9) 、手足口病、麻疹等病毒标本及支原体、脲原体、衣原体等标本的采集及运送四、使用方法：注意：标本采集人员需按有关规定做好个人防护。

咽、鼻拭子最好在发病的头3 天采集。

1. 在安全柜内本产品分装到自备的、螺旋盖内有橡胶圈的5 mL 旋盖塑料管里（一级容器）。

B 型产品已经在旋盖离心管中，可以跳过此步。

2. 鼻拭子的采集：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010800497.0(22)申请日 2020.08.11(71)申请人 杭州博日科技有限公司地址 310000 浙江省杭州市滨江区滨安路1192号(72)发明人 王虹军　金茂峰　陈芝娟　贺贤汉　(74)专利代理机构 北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙) 11463代理人 严诚(51)Int.Cl.C12N 7/00(2006.01)C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6806(2018.01)C12R 1/93(2006.01)(54)发明名称病毒样本保存液及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种病毒样本保存液及其制备方法和应用，涉及生物技术领域，本发明提供的病毒样本保存液，包括特定浓度的缓冲化合物、离液剂、去污剂和螯合剂，通过上述特定浓度的特定组分相互配合，使得本发明提供的病毒样本保存液具有安全、稳定、高效的优点，可以在10分钟内将病毒灭活，并可稳定保存病毒样本核酸。

并且，无需超低温环境即可实现对病毒样本的保存，可适用于临床及野外环境采集及运输病毒样本。

权利要求书1页 说明书10页 附图4页CN 111718908 A 2020.09.29C N 111718908A1.一种病毒样本保存液，其特征在于，所述病毒样本保存液包括：终浓度为10-50mmol/L的缓冲化合物、质量体积百分比为5％-15％的离液剂、体积百分比为0.1％-20％的去污剂和终浓度为0.1-1mmol/L的螯合剂。

2.根据权利要求1所述的病毒样本保存液，其特征在于，所述病毒样本保存液包括：终浓度为20-50mmol/L的缓冲化合物、质量体积百分比为5％-10％的离液剂、体积百分比为1％-10％的去污剂和终浓度为0.1-0.5mmol/L的螯合剂；优选地，所述病毒样本保存液包括：终浓度为50mmol/L的缓冲化合物、质量体积百分比为5％的离液剂、体积百分比为10％的去污剂和终浓度为0.1mmol/L的螯合剂。

慢病毒使用操作指南一、慢病毒的储存与稀释：1. 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）注：A．病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。

B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

2. 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完)，分装后使用。

二、慢病毒用于体外（in vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1. 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体内（in vivo）注射所需要的病毒量。

如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）2. 慢病毒感染目的细胞预实验①慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的（HEK293T，Hela）细胞作为平行实验的对照细胞。

B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清、双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

C．Invabio提供的病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。

如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。

②以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。

病毒保存液的选择及霉菌的控制
病毒的检测不同于常规的生化检测，病毒本身是一种结构简单的微生物，必须寄生在活细胞内。

采样后，病毒离开寄主细胞，在采样管内其蛋白质外壳和核酸都会很快降解，这样核酸检测时就无法判断初始采集的样本是否含有病毒，容易造成假阴性。

所以我们要使用病毒保存液防止病毒的降解；同时还要防止病毒保存液长霉菌的现象出现。

1、灭活病毒保存液
当前核酸检测是对样本中的病毒RNA进行检测，需要将病毒裂解，所以只要能保证病毒核酸的完整和稳定就可以了，不需要保存活病毒。

它的优势是不仅能够迅速高效地使待测样本利的病毒蛋白裂解失活，可以有效防止感染，同时又含有Rnase酶抑制剂，能保护病毒核酸不被降解，后续的NT-PCR实验只要能检测出病毒的核酸即可以做出诊断。

而且能在常温下保存相对较长的时间。

2. 非灭活型保存液
它是一种同时保留了病毒的蛋白质外壳以及病毒核酸DNA或者
RNA的保存液，这样病毒在体外具有蛋白抗原表位和核酸的完整性，当然操作失误时也有一定的感染性风险。

采样后长时间保存需要保持严格低温。

3. 是否出现长霉菌的现象
现在市面上的很多非灭活病毒保存液出现长菌现象，专业的厂家会针对菌落进行了严格的控制，所以一般不会出现这个问题。