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核酸分子杂交与应用PPT课件

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生物化学课件 第四章 核酸杂交

生物化学课件 第四章 核酸杂交
单链DNA的紫外吸收比双链DNA高40%，所以 变性导致DNA的紫外吸收增加，称为增色效 应（hyperchromic effect）。 在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺 旋被解开一半时的温度称为解链温度(Tm)。
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途


印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:

掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应

掌握核酸杂交的基本原理

熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印

核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针



探针的概念 探针的种类和选择

生物化学 第2章Ⅱ 核酸(共86张PPT)

生物化学 第2章Ⅱ 核酸(共86张PPT)

内呈正比
5、电泳缓冲液
DNA的凝胶电泳检测
(ethidiumbromide， 简称EB)是一种核酸染料，可以插入到DNA
或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的
紫外光照射下放射出橘红色的荧光，可用来显现 凝胶中的核酸分子。
在凝胶电泳中，溴化乙锭染料可对核酸分子 染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地检测 出凝胶介质中DNA谱带。
五、变性、复性与杂交
（一）、DNA的变性
1、概念 2、变性因素
3、变性的指标
1、概念
是指核酸双螺旋区的氢键断裂，双螺旋 解开，变成无规则线团的现象。核酸变 性其分子中的共价键并没有破坏，分子 量也不改变，核酸的变性（
denaturation ）
2、DNA的变性的因素
温度升高；
酸碱度改变、 pH（>11.3或<5.0）；
1、核酸分子本身的大小：同分子的摩擦
系数成反比的 Maxam和Gilbert 于1977年发明
Primer1（10uM）
2、琼脂糖的浓度：迁移率与胶浓度成反比 而聚丙烯酰胺凝胶制胶时不能将染料加入，会影响聚合。
第五节 核酸的研究方法 据此特性可以定性和定量检测核酸。
在液氮蒸发去2/3时，用自制研杵迅速磨碎叶片；
RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变 性行为所引起的性质变化没有DNA那样 明显。 天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸
收(260 nm)值增加25－40%.而RNA变性 后，约增加1.1%。
4. DNA变性后的表现
A260值增加
粘度下降
浮力密度增大
分子量不变
（二）、DNA的复性
1、概念：
变性DNA在适当的条件下，两条彼此分 开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构 ，这一过程称为复性；

核酸分子杂交与应用PPT课件

核酸分子杂交与应用PPT课件

2020年4月10日星期五
6
探针的种类
• RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可 以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录 产物。其优点是：
• RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂 交反应效率极高
• 因不存在重复序列，因此特异性高
• 本底低
• 缺点：
2020年4月10日星期五
7
探针的种类
• 寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的 短探针。
2020年4月10日星期五
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标记步骤
• 4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用
终止缓冲液
50mmol/L Tris.Cl(pH7.5)
50mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA
0.5%
SDS
2020年4月10日星期五
20
随机引物标记法特点
• 1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单 链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模 板是，操作方法同上，但必须采用反转录 酶。
• 基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、 真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某 一基因的全部或部分序列，或某一非编码 序列。
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶 催化产生的互补于mRNA的DNA链。
2020年4月10日星期五
5
探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
2020年4月10日星期五
23
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末

核酸分子杂交技术 ppt课件

核酸分子杂交技术 ppt课件


ppt课件
15
一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针

基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
ppt课件
26
(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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27
(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11




二、核酸分子杂交的基本原理

根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。

核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理PPT课件

核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理PPT课件
第43页/共46页
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
第44页/共46页
（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
第40页/共46页
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
第41页/共46页
（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
第42页/共46页
（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
第19页/共46页
四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针

核酸的分子杂交技术及其应用

核酸的分子杂交技术及其应用

核酸的分子杂交技术及其应用1概述核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。

它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。

在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。

这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。

在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。

作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。

它常常用放射性同位素来标记。

虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。

而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。

这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。

2核酸探针的制备核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。

比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。

目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法：2.1DNA的切口平移双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。

这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。

常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。

由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。

[课件]核酸分子杂交与应用PPT

2018/12/6 16
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
2
2018/12/6
3
核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
2018/12/6 4
2018/12/6
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变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
6
2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
11
3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。

核酸杂交


•第一节 核酸分子杂交的基本原理 •第二节 核酸探针 •第三节 核酸分子杂交技术
第一节
核酸分子杂交的基本原理
DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间， 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 交。常用已知的 DNA 或 RNA 的片段作为探针，包括 特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列， 或人工合成的寡核苷酸片段。
(4)
与核酸分子的结合稳定牢固，
非特异性吸附少。
(5)
具有良好的机械性能。
下面介绍几种常用的固相支持物：
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质(如抗体和酶等) 的非放射性标记探针的杂交体系。 (2) 尼龙膜(nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链 DNA和RNA的能力较硝酸纤维素膜更强，耐碱处理适 合于一步法的菌落原位印迹法。 尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针，即使用各种 蛋白 ( 如 BSA 、牛奶等 ) 进行预杂交，产生的杂交信号 本底较高，与非特异吸附有关。 PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容 易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅 的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交(reverse dot hybridization)：直接将不 同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与 之杂交，这样一次杂交反应就可以判断待测 DNA是否 含有这些探针的同源序列。
5.菌落或噬菌斑杂交(图7-13)。
二、核酸原位杂交
⒊电转法如图7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法(Southern blot hybridization)(图 7-12)。

《核酸的分子杂交》PPT课件

亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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2
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3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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核酸化学-PPT课件


第二节 核酸的化学组成
核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成的 具有一定空间结构的生物大分子。
基本元素：C、H、O、N、P ； 其中P 的含量比较稳定，占9%-10%，通过测
定P 的含量来推算核酸的含量（定磷法）。
核酸→核苷酸
磷酸 核苷
碱基 戊糖
一、戊糖
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的 糖为β-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则 为β-D-核糖。
碱基平面之间的距离
（轴距）为0.34 nm，
每10个核苷酸形成一
小 沟
个螺旋，其螺距（即
螺旋旋转一圈）的高
度）为3.4 nm。
大 沟
DNA双螺旋结构模型要点（5）
两条链借碱基之间 的氢键和碱基堆积 力（即碱基之间的 范德华力）牢固的 连接起来，维持 DNA双螺旋的三 维结构。
两条链是碱基互补 关系。
第 四 章
核 酸 化 学
本章内容
第一节 概述 第二节 核酸的化学组成 第三节 核酸的分子结构 第四节 核酸的性质 第五节 核酸的研究方法
第一节 概 述
核酸（nucleic acid—NA）是一类重要 的生物大分子，担负着生命信息的储 存与传递。
核酸是现代生物化学、分子生物学的 重要研究领域，是基因工程操作的核 心分子。
(D o r h U )
H CH 3 N
N
N
NN
dR
N 6 -M e th y l-d A
NH 2
N
CH 3
ON
dR
5 -M e th yl-d C
（2）
Ade HO CH 2 O
HH
H OH
H OCH 3
2 '- O - 甲 基 腺 苷 ((AAmm) )
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10x切口平移缓冲液
0.5mol/L
Tris.Cl(pH7.2)
0.1mol/L 1mmol/L
MgSO4 二硫苏糖醇(DTT)
500μg/ml
牛血清白蛋白
13.03.2021
.
12
标记步骤
• 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核 糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)， 20mmol/L溶液各1μl。
• 基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、 真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某 一基因的全部或部分序列，或某一非编码 序列。
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶 催化产生的互补于mRNA的DNA链。
13.03.2021
.
5
探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。
以下操作要在同位素工作室中有防护措施 的情况下进行操作
• 4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。 注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室 温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻 融次数。
13.03.2021
.
13
标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl， 混匀
• 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2μl
2mmol/L3种dNTP(无dATP) 1μl
[α-32P]dATP
30μCi
加水至
25μl
10xKlenow片段缓冲液
2μl
0.5mol/L 0.1mmol/L 1mmol/L
500μg
.
20
随机引物标记法特点
• 1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单 链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模 板是，操作方法同上，但必须采用反转录 酶。
• 2、标记活性高，只需25ng样品DNA，可在 3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记 dNTP掺入到探针DNA链上
• 3、操作方便
13.03.2021
带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链 DNA均可作为切口平移法的模板。
13.03.2021
.
9
13.03.2021
DNase I
DNA Pol I,α-32P-dNTP
.
10
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.
11
标记步骤
• 1、取1μgDNA溶于少量无菌蒸馏水中
• 2、加入μl10x切口平移缓冲液，混匀
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.
2
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.
3
核酸探针的标记 探针(probe)是指用放射性核素或其 它标记物标记的核酸片段。
放射性标记
标
记
生物素标记
物 非放射性标记 地高辛标记
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荧光素标记
.
4
探针的种类
• DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用 的核酸探针。长度在几百碱基对以上。 DNA探针又分为：
13.03.2021
.
1
核酸分子杂交：来源相同或不同的 DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在 合适的条件下通过碱基互补形成双链 杂交体的过程称核酸分子杂交 (molecular hybridization)。核酸分子 杂交技术是目前生物化学和分子生物 学研究中应用最广泛的技术之一，也 是临床分子检验的重要技术。
Tris.Cl(pH7.2) DMTgTS(O二4硫苏糖醇)
.
21
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.
22
3’末端标记 末端标记属于部分标记。特点是可得 到全长DNA片段，但标记活性不高。 3’末端标记法包括限制酶切和聚合酶 合成两个过程，3’标记有两种方式：
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
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大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末
注：以上操作均在冰浴中进行 • 8、置14～16oC水浴中保温1～2小时 • 9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应 • 10、纯化标记的DNA探针
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.
14
单 链
D
N
A 探 针 的 标 记
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探针的标记
• 随机引物法
• 标记原理：随机引物是含有各种可能排列 的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何 核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物 作用。将待标记的探针模板与随机引物一 起退火，合成标记探针。
• 优点：
• 可根据需要人工合成相应的序列；
• 因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值 也有明显变化，特别适用于点突变的检测
• 杂交速度快特异性强
• 缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂 交体不稳定
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.
8
探针的标记
• 切口平移法
• 标记原理：是目前实验室是最常用的一种 脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌 DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的 dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。
• 3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段， 混匀并离心，室温反应3小时以上
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.
19
标记步骤
• 4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用
终止缓冲液
50mmol/L Tris.Cl(pH7.5)
50mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA
0.5%
SDS
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.
16
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.
17
标记步骤
• 1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下 列溶液，并混匀
20mmol/L
DTT
1μl
5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1μl
10x随机引物缓冲液
1μl标记dຫໍສະໝຸດ TP3μl水1μl
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.
18
标记步骤
• 2、取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在 蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛 细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中 30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转 入上述离心管中
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.
6
探针的种类
• RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可 以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录 产物。其优点是：
• RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂 交反应效率极高
• 因不存在重复序列，因此特异性高
• 本底低
• 缺点：
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探针的种类
• 寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的 短探针。