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生物化学课件 第四章 核酸杂交

生物化学课件 第四章 核酸杂交

单链DNA的紫外吸收比双链DNA高40%，所以 变性导致DNA的紫外吸收增加，称为增色效 应（hyperchromic effect）。 在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺 旋被解开一半时的温度称为解链温度(Tm)。
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途


印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
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(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:

掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应

掌握核酸杂交的基本原理

熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印

核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针



探针的概念 探针的种类和选择
第五章核酸分子杂交技术

第五章核酸分子杂交技术


5’ 3’
3’ 5’
随机6-12bp单核苷酸引物
5’
3’
3’
5’
变性
一般探针长度在400-600bp之间
③末端标记法(terminal labeling) 3’末端 5’末端
④PCR标记法 ⑤光敏标记法
生物素、地高辛等
光敏基团与生物素结合
⑥化学衍生结合标记法 转氨标记法等
(4)探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用， 将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法 相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针， 而此法则是利用离心的方式来纯化探针
（a）
基因组DNA
DNA限制片段
（b）
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜源自（e）同探针同源杂交的基因 DNA片段
X光底片
DNA凝胶电泳
Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片
水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、 BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有 EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米 psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻 的psbA基因序列
• 蛋白质样品的制备 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 • 蛋白质的电转移：NC膜 • 靶蛋白的免疫学检测
靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应
第十章 核酸分子的杂交技术

第十章 核酸分子的杂交技术


RNA提取
1.样品细胞的有效破碎； 2.使核蛋白复合体变性； 3.对内源RNA酶的有效抑制； 4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分
离；
• Northern blotting
三、斑点印迹杂交(dot bloting)
• 将RNA或DNA变性后直接点样于NC 膜或尼龙膜上
• 优点：简单、快速、可同时检测多 个样品
• 应用：确定DNA样品之间的同源性
四、核酸原位杂交(in situ hybridization)
1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片 中的核酸进行杂交检测的方法。
2.特点： – 能在成分复杂的组织中进行单一细胞 的研究 – 不需从组织或细胞中提取核酸 – 能准确反映组织细胞的相互关系及功 能状态
2.多色荧光染色体原位杂交(multicolor FISH; mFISH )
3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic
Hybridization；CGH )
3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic
Hybridization；CGH )
利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的 Genomic DNA ，再同时与正常的染色体进行 hybridization，染色体上不同荧光间的强弱 比值，由此比较而观察基因组中特定基因的 拷贝数变化。
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
• 步骤
1.待测DNA样品的制备、酶切
• DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释 放，用TE液溶解，交替使用酚、氯仿两 种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质
• 标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。
核酸分子杂交技术 ppt课件

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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针

基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
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二、核酸分子杂交的基本原理

根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理PPT课件

核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理PPT课件

第43页/共46页
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
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（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
第40页/共46页
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
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（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
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四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
[课件]核酸分子杂交与应用PPT

[课件]核酸分子杂交与应用PPT

2018/12/6 16
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
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核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
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变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
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2018/12/6பைடு நூலகம்
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影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
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3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
第二章 核酸分子杂交 - 副本(共94张PPT)

第二章 核酸分子杂交 - 副本(共94张PPT)

在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的 元素或分子。标记常用的为同位素标记法和生物素 标记法。
通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道 被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上 的位置，也就知道了它的分子大小。
3、 杂交 杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。
应用较多固相杂交：先将待测单链核酸样品〔如为双 链，那么须先变性成为单链〕结合到硝酸纤维素膜 上，然后与溶液中标记探针进行杂交。
cＤＮＡ探针不含内含子及高度重复序列，是一种较为理想的核酸探针。 因此尤其适用于基因表达的检测。
３.ＲＮＡ探针
通常采用含Ｔ７或ＳＰ６启动子的表达载体来制备高度敏感的 ＲＮＡ探针。
目的基因→克隆到含Ｔ７或ＳＰ６启动子的表达载体的多克隆 位点，用适当的限制性内切酶在插入序列下游将质粒线性化， 参加Ｔ７或ＳＰ６ ＲＮＡ聚合酶、ＮＴＰｓ和α－３２Ｐ －ｄＵＴＰ，即可以目的基因的ＤＮＡ为模板，合成高放射 性的ＲＮＡ探针。
ＲＮＡ作为探针较为理想，但极易被环境中大量存在的核酸酶降 解，较ＤＮＡ难于操作，故限制了其使用。
４.寡核苷酸探针 随着ＤＮＡ合成仪的广泛应用，采用人工合成的寡核苷酸片段作
为探针也非常普遍。
研究者可根据的基因序列或根据氨基酸序列推测出的ＤＮＡ序列， 合成一段１５－３０ｎｔ的寡核苷酸片段。
DNA探针〔包括cDNA探针〕的主要优点有下面三点：
第二节、核酸探针及其标记
• 核酸探针是指标记有放射性或其他标记物 的单链多聚核苷酸片段，用于检测核酸样 品中特定核苷酸序列。
一、探针的种类及其选择
核酸探针可以是人工合成的寡核苷酸片段，可以是克隆 的基因组DNA、全长cDNA或局部片段，也可以是 RNA。
应根据实验目的及要求不同，选择不同类型的探针。选择 探针时应充分考虑探针的特异性及其来源是否方便等因 素。
核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类（可编辑）

核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类（可编辑）

核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类分子杂交技术与应用分子杂交技术与应用? 分子杂交技术的目的是什么?分子杂交的基本方法有哪些?Southern印迹法有哪些步骤,为了达到什么目的呢为什么叫印迹法呢?一、核酸分子杂交的基本原理与分类一、核酸分子杂交的基本原理与分类(一)核酸分子杂交的基本原理(一)核酸分子杂交的基本原理1、变性(denaturation)1、变性(denaturation)(1)定义:(1)定义: 在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。

螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。

(2).引起核酸变性的因素(2).引起核酸变性的因素变性剂变性剂酸(尿素)(尿素)碱碱有机溶剂热有机溶剂热(乙醇)(乙醇)(3)、变性后核酸的特点:(3)、变性后核酸的特点:粘度下降粘度下降密度增加密度增加紫外吸收增加紫外吸收增加 2、融解温度(Tm):2、融解温度(Tm):定义:在DNA热变性时,其A 的升高达最定义:在DNA热变性时,其A 的升高达最260260 大值一半时的温度。

大值一半时的温度。

3、复性(退火)3、复性(退火) 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。

变性DNA 经过一定处理重新形成双螺旋的过程。

影响复性速度的因素: 影响复性速度的因素:DNA浓度 DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 DNA片段复杂性合适的复性温度合适的复性温度适当的离子强度适当的离子强度4、杂交4、杂交定义两条来源不同,但具有互补序列的核酸,按两条来源不同,但具有互补序列的核酸,按碱基配对原则复性形成一个杂交体,这个过程即碱基配对原则复性形成一个杂交体,这个过程即分子杂交。

分子杂交。

DNA/DNA的杂交作用:DNA/DNA的杂交作用: 检测特定生物有机体之间的亲源关系检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA:DND/DNA或RNA/DNA: 揭示核酸片断中某种特定基因的位置。

分子生物学课件-基因操作7节节核酸杂交revised

分子生物学课件-基因操作7节节核酸杂交revised


2、尼龙膜：
对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到 350-500μg/cm2。对小分子量的核酸片段也有 较强的结合能力。不一定通过真空干烤，只需短 时间紫外线照射，核酸中的部分嘧啶碱即可与膜 上带正电荷的氨基相互交联，从而使结合更加牢 固。
优点 吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破 碎、可重复使用）。
第七节 核酸分子杂交
（molecular hybridization)
特点： 灵敏度高（<1pg互补序列） 速度快（<24h） 简单易行 应用： 基因克隆的筛选 酶切图谱制作 基因组中特定基因序列的定量和定性检测 基因突变分析 疾病的诊断、微生物病原体检测
核酸分子杂交
用标记的已知DNA或RNA片段（探针） 来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸 间碱基互补的原则发生异源性结合，再经 显影或显色的方法，将结合核酸序列的位 置或大小显示出来。
Northern 杂交
原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后， 转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交， 分析mRNA的大小及含量。
应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分 子的大小。
方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性 胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗 膜→压片→洗片→图像分析
⑤ 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸 分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥 力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。
3、杂交
来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互 补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂 交。
杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、 DNA与RNA之间的杂交。
❖ Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization)
《核酸的分子杂交》PPT课件

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亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
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（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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《核酸分子杂交》课件

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实验步骤
1
样品制备
获得需要研究的核酸样品并进行提取和
合成探针和标记物
2
纯化。
设计和合成与目标核酸互补的DNA或
RNA探针，并标记探针以便检测。
3
杂交反应
将待测核酸样品与探针和标记物进行杂
杂交产物的检测和分析
4
交反应，使它们结合形成杂交分子。
通过不同的检测方法对杂交产物进行分 析和表征，如凝胶电泳、放射性测量等。
核酸杂交的种类
DNA-DNA杂交
两段DNA互相结合形成双链 DNA。
RNA-DNA杂交
RNA和DNA互相结合形成 RNA-DNA杂交分子。
RNA-RNA杂交
两段RNA分子互相结合形成 双链RNA。
应用
检测病原微生物、基因 突变、肿瘤等
核酸分子杂交可用于诊断病 原微生物感染、检测基因突 变和肿瘤相关标记物。
《核酸分子杂交》PPT课 件
核酸分子杂交是指不同DNA或RNA进行结合形成杂交分子的过程。它在分析 核酸序列的同源性和差异性、检测特定序列的核酸以及研究DNA和RNA的结 构、功能和互动关系方面非常重要。
定义
核酸分子杂交是指来自不同DNA或RNA的单链或双链核酸互相结合形成杂交 分子的过程。
重要性
研究基因表达、基因调 控等
通过核酸分子杂交，我们可 以研究基因的表达模式和调 控机制。
设计新型药物和检测方 法
利用核酸分子杂交技术，可 以设计基于核酸的新型药物 和高灵DNA和RNA的结
性和差异性
核酸
构、功能和互动关系
核酸分子杂交可用于比较 DNA或RNA序列，帮助我 们了解核酸之间的相似性 和差异性。
通过配对互补的探针和标 记物，核酸分子杂交可用 于检测具有特定序列的核 酸分子。

核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理


法则是利用离心的方式来纯化探针
第三节 核酸分子杂交的方法
• 按待测核酸是否固定在固相支持物上分： • 固相杂交 • southern印迹杂交 • northern印迹杂交 • 斑点杂交 • 原位杂交 • 液相杂交
一、Southern印迹杂交 （一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
第二节 探针
一、探针的种类
• 基因组DNA探针 • cDNA探针 • RNA探针 • 寡核苷酸探针
基因组DNA探针从基因组DNA中选取某一基因片段 ↓ 与载体连接（质粒、噬菌体） ↓ 克隆(PCR扩增) ↓ 酶切 优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解（与 RNA比较）；③标记方法成熟。
2、变性的方法：
（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。
（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
（二）复性 定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱 基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或 杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸 /DNA和寡核苷酸/RNA。
（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶
分离小片段用高浓度胶
2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子
DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，
大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液

核酸分子杂交技术

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Southern印迹杂交 1）Southern印迹杂交
DNA检测 －DNA检测
将混合DNA样品经凝胶电泳分离， 将混合DNA样品经凝胶电泳分离， DNA样品经凝胶电泳分离 被分离的DNA片段从凝胶转移到膜上， 被分离的DNA片段从凝胶转移到膜上， DNA片段从凝胶转移到膜上 经标记的探针杂交，从而检测特定DNA 经标记的探针杂交，从而检测特定DNA 片段。 片段。
分子杂交图
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一 核酸分子杂交技术原理
用标记的已知DNA或 RNA片段 （ 探针 ） 来检测样品中 或 片段（ 用标记的已知 片段 探针） 未知核酸序列（ 形成异源双螺旋） 未知核酸序列 （ 形成异源双螺旋 ） ， 再经显影或显色的方 法，将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。 将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。
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3） Western印迹 （Western blot） Western印迹 blot）
• 又称免疫印迹（immunoblotting），常用的蛋白质检测 又称免疫印迹（immunoblotting） 免疫印迹 技术。将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白区带转到膜上， 技术。将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白区带转到膜上， 通过免疫反应，检测能与可以抗体结合的蛋白质。 通过免疫反应，检测能与可以抗体结合的蛋白质。 • 操作程序： 操作程序： 蛋白质样品制备→SDS-PAGE分离→ 蛋白质样品制备→SDS-PAGE分离→蛋白质的电转移 分离 （印迹）→靶蛋白与抗体（一抗与二抗）的结合→显色、 印迹） 靶蛋白与抗体（一抗与二抗）的结合→显色、 分析。 分析。
1
复性
复性：变性DNA分开的两股链在适当 复性：变性 分开的两股链在适当 条件下重新生成双链结构的过程
退火（ 热变性的DNA经 退火 （ annealing） :热变性的 ） 热变性的 经 缓慢冷却复性的过程。 缓慢冷却复性的过程。

分子生物学研究方法(下)核酸分子杂交技术


增色效应（ 增色效应（二）
• 增色效应可以作为DNA变性的指标 增色效应可以作为DNA DNA变性的指标 • 不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌 不同来源DNA的变化不一， DNA的变化不一 DNA经热变性后 经热变性后， 260nm的吸光度值 DNA经热变性后，其260nm的吸光度值 可增加40%以上，其它不同来源的DNA 可增加40%以上，其它不同来源的DNA 40%以上 溶液的增值范围大多在20 30%之间 20－ 之间。 溶液的增值范围大多在20－30%之间。
DNA变性曲线（二）
6.DNA的复性 6.DNA的复性
• 复性概念： （1）复性概念：指变性 DNA 在适当条 件下， 件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双 螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性， 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性， DNA一般经缓慢冷却后即可复性 此过程称之为“ 退火” annealing）。 此过程称之为“ 退火”（annealing）。
2）DNA的（G+C）含量 DNA的 G+C）
• 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于 DNA分子中的 G+C）的含量。 分子中的（ DNA分子中的（G+C）的含量。 • （G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm值越 G+C）含量越高， 碱基对越多，Tm值越 高。因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对 碱基对具有3对氢键， 只有2对氢键，DNA中 G+C） 只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能 增强结构的稳定性， 间氢键需比A 增强结构的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量， G+C）含量高的DNA DNA， 氢键付出更多的能量，故（G+C）含量高的DNA， 其变性Tm也高。 Tm也高 其变性Tm也高。

《核酸分子杂交技术》课件


核酸分子杂交原理
互补配对
核酸分子通过互补配对原理相 结合，碱基之间形成稳定的氢 键。
熔解
通过改变温度，使两条核酸分 子解开，断裂氢键，分离出单 链。
探针结合
利用互补配对原理，核酸探针 与目标核酸结合，形成稳定的 双链结构。
核酸探针的制备
1
设计探针序列
根据目标核酸序列设计探针，考虑碱基
合成探针
2
互补性和特异性。
《核酸分子杂交技术》 PPT课件
核酸分子杂交技术是一种重要的实验技术，能够研究DNA和RNA的结构、功 能以及相互作用。让我们一起探索这门神奇的科学吧！
什么是核酸分子杂交技术
1 定义
核酸分子杂交技术是指通过核酸探针与目标 核酸的互补碱基配对作用实现的一种检测、 分离和研究方法。
2 原理
该技术利用核酸分子的碱基互补性特点，使 探针与目标核酸发生相互结合，从而实现目 标分子的检测和定位。
利用合成技术合成目标序列的核酸探针。
3
标记探针
通过化学反应或酶标记等方法，将探针 标记上荧光剂或放射性示踪剂。
应用领域
遗传研究
核酸分子杂交技术在遗传研究中 起到了至关重要的作用，帮助人 们了解遗传信息的传递和变异。
医学诊断
通过核酸分子杂交技术，可以检 测病原体和基因突变，用于疾病 的早期诊断和治疗。
法医分析
核酸分子杂交技术用于法医学领 域的DNA鉴定和犯罪现场的分析， 提供了重要的法律证据。
核酸分子杂交技术的优势
1 高度特异性
通过合理设计探针序列， 核酸分子杂交技术能够高 度特异地检测目标核酸。
2 灵敏度高
核酸分子杂交技的特点。
3 广泛应用
核酸分子杂交技术在基础 研究、生物医学、农业科 技等领域均有广泛应用。
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2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤
待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜：
• 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 • 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法
探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测
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Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性
与Southern印迹杂交不同之处： RNA电泳 避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解
变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)
RNase抑制环境
核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）
1
核酸分子杂交技术：
具一定同源性的两条(DNA或RNA) 单链在适宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则特异性地复性， 形成双链。
探针(已知核酸片断，单链)
待测核苷酸序列(单链)
2
核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛 顿卡内基学院（Carnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序 列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起 时，其相应的同源区段将会退火形成双链的 结构。
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（a）
基因组DNA
DNA限制片段
（b）
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
同探针同源杂交的基因
DNA片段
（e）
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X光底片
DNA凝胶电泳
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Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片
水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、 BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有 EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米 psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻 的psbA基因序列
* 因这种方法与Southern blot杂交技术十分类似，与DNA的 杂交（Southern 杂交）相对应，被趣称为Northern杂 交。
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Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA
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2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理
3、靶核酸为RNA
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27Βιβλιοθήκη Western 杂交印迹法(Western bloting)
检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血 清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
4
5
6
影响杂交的因素
核酸分子的浓度和长度
• 浓度大，复性快；分子量大，复性慢
温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应
• 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA
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分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 Western 印迹法 原位杂交 斑点印迹杂交 液相杂交
将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行 杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和 组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交。
特点 • 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 • 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序 列灵敏度高 • 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
主要步骤：
• 蛋白质样品的制备 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 • 蛋白质的电转移：NC膜 • 靶蛋白的免疫学检测
靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应
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In Situ Hybridization
原位杂交
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原位杂交(in situ hybridization)
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利用非放射性探针检测核苷酸
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主要应用 • 1.遗传病诊断 • 2.DNA图谱分析 • 3.PCR产物分析
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Northern blot
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Northern杂交
* 1979年，J. C. Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳 凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤 纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 也称为Northern印迹（Northern Blot），用以检测某 一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。
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Southern DNA印迹杂交
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Southern DNA印迹杂交
使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结 合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链 DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移 的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂 交技术。由于它是由英国人Edwin Mellor Southern于1975年首先设计出来的，故又叫 Southern blot。
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核酸分子杂交的基本原理
DNA变性
• 方法
热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
• 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶 解温度(melting temperature,Tm)
DNA复性或杂交(hybridization)
• DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
* 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。
* 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。
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原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组
织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分 细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针 与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、 RNA/RNA 杂交
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