核酸分子杂交技术PPT课件
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生物化学课件 第四章 核酸杂交
单链DNA的紫外吸收比双链DNA高40%，所以 变性导致DNA的紫外吸收增加，称为增色效 应（hyperchromic effect）。 在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺 旋被解开一半时的温度称为解链温度(Tm)。
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
核酸分子杂交与应用PPT课件
2020年4月10日星期五
6
探针的种类
• RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可 以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录 产物。其优点是：
• RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂 交反应效率极高
• 因不存在重复序列，因此特异性高
• 本底低
• 缺点：
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探针的种类
• 寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的 短探针。
2020年4月10日星期五
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标记步骤
• 4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用
终止缓冲液
50mmol/L Tris.Cl(pH7.5)
50mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA
0.5%
SDS
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随机引物标记法特点
• 1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单 链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模 板是，操作方法同上，但必须采用反转录 酶。
• 基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、 真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某 一基因的全部或部分序列，或某一非编码 序列。
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶 催化产生的互补于mRNA的DNA链。
2020年4月10日星期五
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探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
2020年4月10日星期五
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大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末
核酸分子杂交技术 ppt课件
ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
ppt课件
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
ppt课件
27
(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11
二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理PPT课件
第43页/共46页
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
第44页/共46页
（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
第40页/共46页
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
第41页/共46页
（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
第42页/共46页
（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
第19页/共46页
四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
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（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
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2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
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（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
第19页/共46页
四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
核酸分子杂交2011-09
– 缺口翻译法或切口平移法 – 随机引物法 – 末端标记法
• cDNA探针的标记，RNA探针的标记 探针的标记， 探针的标记 探针的标记
Ⅰ缺口翻译法或切口平移 （nick translation） ）
限量DNase I在待标记的 在待标记的dsDNA的每一条链上产生若干个 限量 在待标记的 的每一条链上产生若干个 单链缺口； 单链缺口； 利用E.coli DNA多聚酶 的5’-3’外切酶活性，在缺口处5’末 利用 多聚酶I的 外切酶活性，在缺口处 末 多聚酶 外切酶活性 端每切除一个核苷酸，则再利用5‘-3’多聚酶活性在 末端 多聚酶活性在3’末端 端每切除一个核苷酸，则再利用 多聚酶活性在 添加一个核苷酸，以修补缺口； 添加一个核苷酸，以修补缺口； 随着缺口在5’末端的移动 修饰的核苷酸就掺入到新合成的 随着缺口在 末端的移动,修饰的核苷酸就掺入到新合成的 末端的移动 DNA链中，即探针由5’末端向 端延伸。 链中，即探针由 末端向 端延伸。 末端向3’端延伸 链中
核酸分子杂交
（Nucleic Acid Hybridization ）
获得、检测和筛选目的基因的主要方法之一
Content
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术 5 DNA芯片技术 芯片技术
前
言
核酸分子杂交
有互补特定核苷酸序列的变性DNA或RNA单链，经 或 单链， 有互补特定核苷酸序列的变性 单链 退火处理，按照碱基互补原则形成 退火处理，按照碱基互补原则形成DNA-DNA或DNA或 RNA双链的过程叫分子杂交。 双链的过程叫分子杂交。 双链的过程叫分子杂交
priming )
• 随机寡核苷酸引物（random primer)：含有各种可能排列顺 随机寡核苷酸引物（ 序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用。一般6bp或6-8bp，可人工合成 或DNA酶I降解小牛胸腺DNA获得。 • E.coli DNA聚合酶I的Klenow大片段：仅具有5 性，而无5 3外切酶活性。 3聚合酶活
• cDNA探针的标记，RNA探针的标记 探针的标记， 探针的标记 探针的标记
Ⅰ缺口翻译法或切口平移 （nick translation） ）
限量DNase I在待标记的 在待标记的dsDNA的每一条链上产生若干个 限量 在待标记的 的每一条链上产生若干个 单链缺口； 单链缺口； 利用E.coli DNA多聚酶 的5’-3’外切酶活性，在缺口处5’末 利用 多聚酶I的 外切酶活性，在缺口处 末 多聚酶 外切酶活性 端每切除一个核苷酸，则再利用5‘-3’多聚酶活性在 末端 多聚酶活性在3’末端 端每切除一个核苷酸，则再利用 多聚酶活性在 添加一个核苷酸，以修补缺口； 添加一个核苷酸，以修补缺口； 随着缺口在5’末端的移动 修饰的核苷酸就掺入到新合成的 随着缺口在 末端的移动,修饰的核苷酸就掺入到新合成的 末端的移动 DNA链中，即探针由5’末端向 端延伸。 链中，即探针由 末端向 端延伸。 末端向3’端延伸 链中
核酸分子杂交
（Nucleic Acid Hybridization ）
获得、检测和筛选目的基因的主要方法之一
Content
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术 5 DNA芯片技术 芯片技术
前
言
核酸分子杂交
有互补特定核苷酸序列的变性DNA或RNA单链，经 或 单链， 有互补特定核苷酸序列的变性 单链 退火处理，按照碱基互补原则形成 退火处理，按照碱基互补原则形成DNA-DNA或DNA或 RNA双链的过程叫分子杂交。 双链的过程叫分子杂交。 双链的过程叫分子杂交
priming )
• 随机寡核苷酸引物（random primer)：含有各种可能排列顺 随机寡核苷酸引物（ 序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用。一般6bp或6-8bp，可人工合成 或DNA酶I降解小牛胸腺DNA获得。 • E.coli DNA聚合酶I的Klenow大片段：仅具有5 性，而无5 3外切酶活性。 3聚合酶活
核酸杂交
•第一节 核酸分子杂交的基本原理 •第二节 核酸探针 •第三节 核酸分子杂交技术
第一节
核酸分子杂交的基本原理
DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间， 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 交。常用已知的 DNA 或 RNA 的片段作为探针，包括 特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列， 或人工合成的寡核苷酸片段。
(4)
与核酸分子的结合稳定牢固，
非特异性吸附少。
(5)
具有良好的机械性能。
下面介绍几种常用的固相支持物：
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质(如抗体和酶等) 的非放射性标记探针的杂交体系。 (2) 尼龙膜(nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链 DNA和RNA的能力较硝酸纤维素膜更强，耐碱处理适 合于一步法的菌落原位印迹法。 尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针，即使用各种 蛋白 ( 如 BSA 、牛奶等 ) 进行预杂交，产生的杂交信号 本底较高，与非特异吸附有关。 PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容 易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅 的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交(reverse dot hybridization)：直接将不 同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与 之杂交，这样一次杂交反应就可以判断待测 DNA是否 含有这些探针的同源序列。
5.菌落或噬菌斑杂交(图7-13)。
二、核酸原位杂交
⒊电转法如图7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法(Southern blot hybridization)(图 7-12)。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是一种用于检测和分析核酸特异性的分子生物学技术。
它可以检测和分
析特定的基因或基因产物，如RNA或DNA，以及其他特定的核酸分子，如转录因子、调控
因子等。
核酸分子杂交技术可以用来确定特定基因的存在、结构和功能，也可以用来检测
和鉴定病毒、细菌和其他微生物的存在。
核酸分子杂交技术的基本原理是，将两个不同的核酸分子（称为“杂交物”）混合在一起，使它们能够结合在一起。
这种结合是由特定的碱基对结合所决定的，也就是说，只有具有
相同的碱基序列的两个核酸分子才能结合在一起。
结合后的核酸分子杂交物可以被检测到，从而可以用来确定特定核酸分子的存在。
核酸分子杂交技术可以用来检测和分析特定基因的存在、结构和功能，也可以用来检测和
鉴定病毒、细菌和其他微生物的存在。
在肿瘤学研究中，核酸分子杂交技术可以用来检测
肿瘤细胞中特定基因的表达水平，从而可以帮助医生更好地诊断和治疗患者。
此外，核酸
分子杂交技术还可以用来研究基因调控，以及研究基因突变对基因表达的影响。
核酸分子杂交技术的应用非常广泛，可以用来研究基因、蛋白质和其他生物分子，以及病毒、细菌和其他微生物。
它可以用来诊断和治疗疾病，以及研究基因调控和基因突变对基
因表达的影响。
总之，核酸分子杂交技术是一种重要的分子生物学技术，在医学、生物学和其他领域都有
着广泛的应用，可以用来检测和分析特定的基因、病毒和其他微生物，并且可以用来研究
基因调控和基因突变对基因表达的影响。
《核酸的分子杂交》PPT课件
亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
精选课件ppt
Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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2
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3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
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21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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3
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一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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核酸分子杂交技术
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
DNA变性 中和 Southern印迹 预杂交 杂交 洗膜 检测
39
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
毛细管转移示意图
40
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
电转移示意图
41
第二节 核酸分子杂交的类型
第二节 核酸分子杂交的类型
一、反向点杂交
二、Southern印迹杂交
三、Northern印迹杂交 四、原位杂交 其它命名如：斑点杂交
菌落杂交 微板酶联杂交
31
第二节 核酸分子杂交的类型
杂交分类
按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类：
固相杂交 ➢ 探针 ➢ 被测DNA（RNA） ➢ 在固体支持物上杂交 ➢ 容易洗膜
碱性磷酸酶
罗丹明和FITC
地高辛
NT、PCR、RP 600W可见光照 365紫外线照 化学合成法或直接法
化学合成法或直接法
合成法
RP、NT
酶标亲和素或酶标 抗生物素抗体显色 抗生物素抗体显色 直接底物显色或用酶 抗体+底物显色 直接底物显色或用酶
抗体+底物显色 荧光显微镜观察或酶 标抗体+底物显色 酶标抗体+底物3显0 色
Northern印迹 杂交流程图
43
第二节 核酸分子杂交的类型
三、Northern印迹杂交
与Southern印迹杂交比较：
– RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染 – 所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用 – RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解
RNA 2’-OH – 变性剂的作用：防止RNA分子形成发夹式的二级
《核酸分子杂交》课件
实验步骤
1
样品制备
获得需要研究的核酸样品并进行提取和
合成探针和标记物
2
纯化。
设计和合成与目标核酸互补的DNA或
RNA探针，并标记探针以便检测。
3
杂交反应
将待测核酸样品与探针和标记物进行杂
杂交产物的检测和分析
4
交反应，使它们结合形成杂交分子。
通过不同的检测方法对杂交产物进行分 析和表征，如凝胶电泳、放射性测量等。
核酸杂交的种类
DNA-DNA杂交
两段DNA互相结合形成双链 DNA。
RNA-DNA杂交
RNA和DNA互相结合形成 RNA-DNA杂交分子。
RNA-RNA杂交
两段RNA分子互相结合形成 双链RNA。
应用
检测病原微生物、基因 突变、肿瘤等
核酸分子杂交可用于诊断病 原微生物感染、检测基因突 变和肿瘤相关标记物。
《核酸分子杂交》PPT课 件
核酸分子杂交是指不同DNA或RNA进行结合形成杂交分子的过程。它在分析 核酸序列的同源性和差异性、检测特定序列的核酸以及研究DNA和RNA的结 构、功能和互动关系方面非常重要。
定义
核酸分子杂交是指来自不同DNA或RNA的单链或双链核酸互相结合形成杂交 分子的过程。
重要性
研究基因表达、基因调 控等
通过核酸分子杂交，我们可 以研究基因的表达模式和调 控机制。
设计新型药物和检测方 法
利用核酸分子杂交技术，可 以设计基于核酸的新型药物 和高灵DNA和RNA的结
性和差异性
核酸
构、功能和互动关系
核酸分子杂交可用于比较 DNA或RNA序列，帮助我 们了解核酸之间的相似性 和差异性。
通过配对互补的探针和标 记物，核酸分子杂交可用 于检测具有特定序列的核 酸分子。
分子生物技术—核酸分子杂交技术
一、核酸分子杂交基本原理
(二) 核酸分子杂交基本原理
• 根据核酸变性和复性的原理,不同来源的DNA 变性后,若这些异源DNA之间存在某些相同序 列的区域,在退火条件下则可形成DNA-DNA 异源双链;或将变性的单链DNA与RNA经复 性处理可以形成DNA-RNA杂合双链。这种 不同来源的单链核酸分子在合适的条件下,通 过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分 子杂交
三、核酸分子杂交相关技术
（一）传统核酸分子杂交技术
2.Northern杂交
• 对RNA的检测也可以利用与DNA检测 相同的印迹技术来分析。与 Southern 印迹杂交的方法类似,只是变性剂不同
• Southern杂交中使用的使DNA变性的 试剂为NaOH。因为NaOH会水解 RNA的2-羟基基团,所以Northern杂 交中使RNA変性的试剂为甲基氧化汞 、乙二醛或甲醛
• 斑点杂交和狭缝杂交都是将被检标本 点到膜上烘烤固定。不需电泳和转膜 过程,整个操作过程简便、快速
• 缺点是无法判断核酸片段的大小,也无 法判断样品溶液中是否存在着不同的 靶序列,多用作核酸定性或半定量分析 而且便于杂交条件的摸索
三、核酸分子杂交相关技术
（二）核酸原位杂交
• 原位杂交是将核酸分子杂交技术与组 织细胞化学和免疫组织化学结合起来 的一种杂交方法,其基本原理及探针的 标记方法与传统核酸分子杂交技术相 同
三、核酸分子杂交相关技术
（一）传统核酸分子杂交技术
3. 斑点杂交与狭缝杂交
• 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸 纤维素膜或尼龙膜上,再采用特定的探 针进行杂交这种方法称为点杂交
• 若采用狭缝点样器加样后杂交,则称为 狭缝杂交
• 斑点杂交与狭缝杂交的区别是点样形 状的不同
《核酸分子杂交技术》课件
核酸分子杂交原理
互补配对
核酸分子通过互补配对原理相 结合，碱基之间形成稳定的氢 键。
熔解
通过改变温度，使两条核酸分 子解开，断裂氢键，分离出单 链。
探针结合
利用互补配对原理，核酸探针 与目标核酸结合，形成稳定的 双链结构。
核酸探针的制备
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设计探针序列
根据目标核酸序列设计探针，考虑碱基
合成探针
2
互补性和特异性。
《核酸分子杂交技术》 PPT课件
核酸分子杂交技术是一种重要的实验技术，能够研究DNA和RNA的结构、功 能以及相互作用。让我们一起探索这门神奇的科学吧！
什么是核酸分子杂交技术
1 定义
核酸分子杂交技术是指通过核酸探针与目标 核酸的互补碱基配对作用实现的一种检测、 分离和研究方法。
2 原理
该技术利用核酸分子的碱基互补性特点，使 探针与目标核酸发生相互结合，从而实现目 标分子的检测和定位。
利用合成技术合成目标序列的核酸探针。
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标记探针
通过化学反应或酶标记等方法，将探针 标记上荧光剂或放射性示踪剂。
应用领域
遗传研究
核酸分子杂交技术在遗传研究中 起到了至关重要的作用，帮助人 们了解遗传信息的传递和变异。
医学诊断
通过核酸分子杂交技术，可以检 测病原体和基因突变，用于疾病 的早期诊断和治疗。
法医分析
核酸分子杂交技术用于法医学领 域的DNA鉴定和犯罪现场的分析， 提供了重要的法律证据。
核酸分子杂交技术的优势
1 高度特异性
通过合理设计探针序列， 核酸分子杂交技术能够高 度特异地检测目标核酸。
2 灵敏度高
核酸分子杂交技的特点。
3 广泛应用
核酸分子杂交技术在基础 研究、生物医学、农业科 技等领域均有广泛应用。
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3、离子强度：
（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂 交率增加
（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进 行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
4、甲酰胺：
（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交 液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此
法则是利用离心的方式来纯化探针
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二、影响杂交的因素
1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂 交效率
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶 液或脱脂奶粉
1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记
2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不 当所带来的一系列问题
3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µgDNA以 上
4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记
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PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反
应的底物，以待标记的DNA为模板，经 PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分 子中
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水存在于反应体系中不同顺序 的总长度
（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
6、非特异性杂交反应：
（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附
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（二）探针的标记 1、理想标记物应具备的特性： • 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
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2、标记物 （ 1） 理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
分子生物学检测技术
核酸分子杂交技术 PCR技术
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核酸分子杂交技术
一、 核酸分子杂交的定义及基本原理 • 定义：
具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 •杂交有固一液相杂交和液相杂交。
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变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
（一）探针的种类 1、根据组成分类
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逆转录酶的 DNA聚合酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
DNA 聚合 酶
第二条CDNA链
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1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探
针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
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（三）探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相
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（3）标记物种类 • 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
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（3）标记方法
体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代 谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合 成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中
其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合， 作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下， 按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与 模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成 一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性 核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中
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随机引物法所具有的优点：
② 利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外 切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除
③ 在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以 互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切 口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将 标记的核苷酸掺入到新的DNA链中
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随机引物法
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体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基团与 探针分子上的某些基团反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上
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酶促标记法 切口平移法（nick translation)
①利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
• 基因组DNA探针 • cDNA探针 • RNA探针 • 寡核苷酸探针
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2、标记物
放射性同位素标记法 如32P、3H、 35S
非放射性同位素标记法 如金属、半抗原、 荧光素
3、标记的方式 体内标记法 体外标记法
化学标记法
酶促标记法
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➢ 最常用的核酸探针 ➢ 长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针 ➢ 多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列 ➢ DNA片段须是特异的（仅与靶DNA或RNA结合） ➢ 来源广泛（微生物或动物、人类的细胞）